Sysmex HISCL5000化學發(fā)光分析儀檢測乙型肝炎標志物性能評價

鄂建飛，劉利洪，陳宗耀，王登朝，葉　敏，袁成良

(四川省德陽市人民醫(yī)院檢驗科　618000)

Sysmex HISCL5000化學發(fā)光分析儀檢測乙型肝炎標志物性能評價

鄂建飛，劉利洪，陳宗耀，王登朝，葉敏，袁成良△

(四川省德陽市人民醫(yī)院檢驗科618000)

目的評價Sysmex HISCL5000化學發(fā)光免疫分析儀(以下簡稱HISCL5000分析儀)對乙型肝炎血清標志物檢測的分析性能。方法用HISCL5000分析儀進行HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb檢測，根據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)頒布的EP系列文件對儀器分析性能進行評價。結果HISCL5000分析儀檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb低濃度和高濃度兩個濃度批內不精密度變異系數(shù)(CV)%分別為1.24%、1.05%、2.56%、2.27%、2.19%、1.95%、2.37%、1.43%、2.49%、1.29%；總不精密度CV%分別為2.32%、1.74%、3.12%、2.45%、2.94%、2.96%、3.02%、1.82%、3.21%、1.54%。HBsAg檢測線性r2=0.976 5，HBsAb檢測線性r2=0.951 6，兩者r2均大于0.95。HISCL5000分析儀和e601分析儀HBsAg檢測結果比對：r2=0.982 2，HBsAb檢測結果比對：r2=0.974 8。HISCL5000分析儀與ELISA兩種方法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb結果的符合率分別為99.6%(550/552)、93.5%(516/552)、99.6%(550/552)、94.9%(524/550)、92.0%(508/552)。HISCL5000分析儀檢測HBsAg攜帶污染X=0.070 8，3SD(L-L)=0.106 2，X<3SD(L-L)。HISCL5000分析儀檢測HBsAg、HBsAb下限分別為0.006 IU/mL、0.213 6 mIU/mL。結論HISCL5000分析儀檢測乙型肝炎血清標志物的精密度、線性范圍、比對結果、攜帶污染、檢測下限均達到要求，能滿足臨床需求。

乙型肝炎病毒；磁微?；瘜W發(fā)光酶免疫分析法；血清學標志物；性能評價

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范圍內的嚴重公共衛(wèi)生問題之一，約5%的世界人口為HBV攜帶者。當前國內HBV的感染率比較高，乙型肝炎血清學標記物(HBV-M)是臨床實驗室最主要的檢測項目[1]。ELISA仍是目前大多數(shù)臨床實驗室定性檢測HBV-M的常規(guī)方法，其檢測結果常作為臨床診斷和治療慢性乙型肝炎的依據(jù)之一[2]，但是，近年來越來越多的臨床實驗室將磁微?；瘜W發(fā)光酶免疫分析法用于HBV-M檢測。本實驗室按美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)EP系列文件的要求，對Sysmex HISCL5000全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行性能驗證，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1標本來源所有檢測標本均來自2015年3～6月本院檢測HBV-M的門診和住院患者。

1.2儀器與試劑采用日本Sysmex HISCL-5000全自動化學發(fā)光免疫分析儀(以下簡稱HISCL5000分析儀，磁微?；瘜W發(fā)光酶免疫分析法)及其配套試劑；德國COBAS e601 全自動免疫分析儀(以下簡稱e601分析儀，電化學發(fā)光免疫分析法)及其配套試劑；瑞士TECAN全自動酶免疫分析儀(以下簡稱TEACN分析儀，酶聯(lián)免疫吸附試驗)，試劑為上海科華生物工程股份有限公司產(chǎn)品，標準物質來自北京康徹思坦生物公司。

1.3方法每日對儀器進行保養(yǎng)，且質控品檢測結果均在控制范圍內。采用HISCL5000分析儀、e601分析儀及TECAN分析儀檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)、乙型肝炎核心抗體(HBcAb)，嚴格按儀器及試劑說明書進行操作。結果判讀：ELISA檢測時，HBsAg、HBsAb、HBeAg樣品吸光度(OD)值大于或等于臨界(Cut-off)值為陽性，HBeAb、HBcAb樣品OD值小于Cut-off值為陽性；HISCL5000檢測時，HBsAg≥0.03 IU/mL，HBsAb≥5.0 mIU/mL，HBeAg≥1.0 C.O.I，HBeAb≥50 Inh%，HBcAb≥1.0 C.O.I為陽性。

1.3.1精密度試驗每天分析1個批次，取2個濃度的標本，每天每個濃度的標本重復測定4次，連續(xù)測定5 d，計算批內不精密度和總不精密度，評價方案按EP15-A2進行[3]。

1.3.2線性試驗HBsAg、HBsAb線性試驗參照EP6-A2進行[4]，選擇高于儀器檢測上限的標本，用HISCL專用稀釋液進行稀釋，以原始標本為1.0，按照0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1進行稀釋，0.1以下對倍稀釋，直至檢測值低于儀器檢測下限，計算決定系r2是否大于0.95。

1.3.3比對試驗選擇40個濃度覆蓋儀器線性范圍的標本，按EP9-A2進行HISCL5000分析儀及e601分析儀HBsAg、HBsAb定量檢測結果比對[5]；另選擇患者血清標本進行HISCL5000分析儀及ELISA檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb結果比對，計算結果符合率。

1.3.4攜帶污染取高濃度標本(H)和低濃度標本(L)各一份，將高濃度標本分成 10 份，低濃度標本分成11份，21份標本按順序：L1、L2、L3、H1、H2、L4、H3、H4、L5、L6、L7、L8、H5、H6、L9、H7、H8、L10、H9、H10、L11連續(xù)測定，選出高值對低值干擾組(H-L)與低值對低值干擾組(L-L)兩組數(shù)值，分別計算均值(Mean)和標準差(SD)，要求X=Mean(H-L)-Mean(L-L)，X<3SD(L-L)驗證通過。

1.3.5檢測下限用HISCL專用稀釋液將已知濃度的低濃度標本(HBsAg C1校準品0.25 IU/mL，HBsAb C1校準品10 mIU/mL)對倍稀釋成5個濃度系列作為驗證材料，每個濃度重復檢測20次，計算CV%，CV%<20%的最低濃度即為定量檢出限。

1.3.6檢測結果頻數(shù)圖選取常規(guī)標本1 642份，潛在干擾標本120份：孕婦標本16份,注射過疫苗標本6份,黃疸標本10份,脂血標本10份,溶血標本10份,HIV陽性標本4份,梅毒陽性標本10份,丙肝陽性標本10份,ANA陽性標本16份,弓形蟲感染標本4份, EB病毒陽性標本4份,風疹抗體陽性4份, RF陽性標本16份。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用配對χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1HISCL5000分析儀精密度驗證結果(1)批內不精密度：HISCL5000分析儀檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb低濃度和高濃度兩個濃度批內不精密度分別為:1.24%、1.05%、2.56%、2.27%、2.19%、1.95%、2.37%、1.43%、2.49%、1.29%；(2)總不精密度：HISCL5000分析儀檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb低濃度和高濃度總不精密度分別為:2.32%、1.74%、3.12%、2.45%、2.94%、2.96%、3.02%、1.82%、3.21%、1.54%，見表1。

2.2HISCL5000分析儀檢測HBsAg、HBsAb的線性分析HBsAg檢測線性r2=0.976 5，回歸方程為Y=205.72X-480.29；HBsAb檢測線性r2=0.951 6，回歸方程為Y=78.521X-240.85，兩者r2均大于0.95。

2.3比對結果(1)HISCL5000分析儀及e601分析儀HBsAg檢測比對結果：r2=0.982 2，回歸方程為Y=0.727 3X+0.153 3； HISCL5000分析儀及e601分析儀HBsAb檢測比對結果：r2=0.974 8，回歸方程為Y=0.731X-5.842。(2)HISCL5000分析儀與ELISA兩種方法檢測552例患者血清標本HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb結果的符合率分別為99.6%(550/552)、93.5%(516/552)、99.6%(550/552)、94.9%(524/550)、92.0%(508/552)；兩種方法檢測HBsAg、HBeAg的結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，HBsAb、HBeAb、HBcAb的結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。用HISCL5000分析儀檢測552例患者血清標本HBsAb、HBeAb、HBcAb陽性率分別為62.0%(342/552)、25.7%(142/552)、61.2%(338/552)，陽性率明顯高于ELISA，兩種方法陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表1　HISCL5000分析儀精密度驗證結果

表2　HISCL5000分析儀與ELISA檢測HBV-M結果

2.4HISCL5000分析儀檢測HBsAg攜帶污染檢測結果攜帶污染HISCL5000分析儀檢測HBsAg攜帶污染X=0.070 8，3SD(L-L)=0.106 2，X<3SD(L-L)，符合相應的要求。

2.5HISCL5000分析儀檢測下限分析HISCL5000分析儀檢測HBsAg、HBsAb下限分別為0.006 IU/mL、0.213 6 mIU/mL，明顯低于試劑說明書0.03 IU/mL和5.0 mIU/mL，見表4。

注：HBsAg標本濃度(IU/mL)。

圖1HISCL5000檢測1 642例患者HBsAg結果分布情況

2.6HISCL5000分析儀檢測HBsAg結果分布HISCL5000分析儀檢測1 642患者HBsAg，其中結果小于或等于0.01 IU/mL 1 389例，占陰性標本的99.2%(1 389/1 400)，大于或等于5.0 IU/mL 216例，占陽性標本的89.3%(216/242)，見圖1。

表3　HISCL5000分析儀與ELISA檢測HBV-M陽性率的比較[n(%)]

表4　HISCL5000分析儀HBsAg、HBsAb檢測下限結果

3討論

乙型肝炎是由HBV感染引起的，HBV是一種有包膜的DNA病毒，能感染肝臟并引起肝細胞壞死和炎癥。HBV感染可分為慢性和急性感染，可以表現(xiàn)為無癥狀感染、輕度感染、嚴重感染，甚至罕見的爆發(fā)性肝炎[6]?？v向調查發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者在不進行治療超過5年會增加8%～20%的概率發(fā)展為肝硬化[7-11]。上述患者出現(xiàn)肝硬化時發(fā)生肝功能代償不全的概率每年增加約20%，同時乙型肝炎相關性肝癌的發(fā)生率也很高，1%～5%不等[12]。不進行治療的患者出現(xiàn)失代償性肝硬化預后極差，5年生存率為15%～40%[10,12-13]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約有2.4億人為HBV攜帶者，非洲和亞洲的感染率最高。慢性乙型肝炎感染者肝硬化和肝癌的風險很高，每年約65萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌[14]。因此世界衛(wèi)生組織呼吁各國采取更多措施防止新的感染，并確保已感染人被診斷和治療。

HBV-M檢測是診斷HBV感染和判斷病毒復制的重要指標之一[15]。臨床檢驗中檢測HBV-M的方法較多，按照檢測技術不同分為定性檢測和定量檢測兩大類，前者主要包括金標法和ELISA，后者主要包括化學發(fā)光法、電化學發(fā)光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析等。HBV-M的準確檢測對于乙型肝炎的流行病學監(jiān)測和診斷有著十分重要的作用，所以好的檢測方法非常重要。

ELISA操作簡單、經(jīng)濟實惠，通過在檢測過程中直接進行標準量化質控，保證了檢測結果的相對有效性。此外，ELISA如引入生物素和親和素系統(tǒng)或采用化學發(fā)光等技術，其靈敏度還可進一步提高。但ELISA技術有其局限性，因試驗中假陽性或假陰性結果是不能完全避免的。除方法和試劑本身對檢測結果性能的影響外，ELISA檢測結果的可靠性比較易受檢測過程中操作誤差的影響，如加樣和加試劑的重復性、孵育溫度的均衡性、孵育時間的長短、標本溶血等都可能影響檢測結果。因此，檢測中盡管使用符合要求的方法和試劑，也應注意檢測過程中其他因素對檢測結果的影響。磁微?；瘜W發(fā)光酶免疫分析具有高靈敏度和高特異度，試劑安全、穩(wěn)定及檢測快速等優(yōu)點，因此近年來基于此技術的全自動檢測設備發(fā)展迅速，被廣泛應用于臨床。

HISCL5000分析儀采用磁微?；瘜W發(fā)光酶免疫檢測技術，與傳統(tǒng)的化學發(fā)光分析法相比，HISCL5000檢測HBV-M有6個新的特點：(1)以磁性微粒作為包被載體，堿性磷酸酶作為標記物，金剛烷類衍生物作為高敏發(fā)光底物，發(fā)光強度為3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽的4倍以上，能夠檢測出低濃度的標本，提高檢出率利于早期發(fā)現(xiàn)病毒感染，避免了假陰性造成的漏診。(2)創(chuàng)新的B/F分離技術：通過在集磁/清洗后，加入去磁/分散磁珠的步驟，使得磁微粒重新均勻分散在液相中，并重復4次，這樣夾雜在微粒間的非特異性反應物能夠徹底釋放清洗液中，直到完全清除，最大限度排除干擾，保證結果準確可靠。(3)HISCL5000分析儀高敏發(fā)光法第一步捕獲待測物時，沒有磁珠參與，為液相(均相)反應。布朗運動顆粒越小，溫度越高，反應速度更快，結合更充分，所以孵育時間大大縮短。所有待測物被完全捕獲后，生物素化的抗原抗體結合物，再同包被鏈霉親和素的磁珠結合，因此HISCL5000分析儀檢測HBV-M 5項只需要90 μL標本量，檢測時間只需要17 min。(4)通過切換濾鏡，確保濃度由低到高的寬檢測線性范圍，大大降低了標本稀釋的頻率，為實驗室節(jié)省人力、時間及試劑成本，操作更方便。(5)一次性加樣吸頭和過濾薄膜擦拭雙重保障，最大限度地降低攜帶污染。(6)HISCL5000分析儀可在運行過程中隨時更換試劑盒、消耗品和沖洗液，體現(xiàn)HISCL5000分析儀的高度智能化和人性化。因此HISCL5000分析儀具有定量跟蹤分析、高靈敏度、高特異度、檢測快速、操作簡單及標本用量少的優(yōu)點，可提供實時、動態(tài)的檢測結果，有效指導臨床診斷和治療。

本研究結果顯示，HISCL5000分析儀檢測批內和總不精密度CV%均小于15%，符合廠商要求，說明儀器檢測重復性好，結果穩(wěn)定。標本中被測物質的濃度在儀器檢測線性范圍內時，所測結果是可信的，即更接近于被測物質的真值，HISCL5000分析儀檢測HBsAg、HBsAb的線性范圍，r2分別為0.976 5、0.951 6，均大于 0.95。保證檢測結果的一致性是實驗室管理中實現(xiàn)質量目標的重要依據(jù)，即對同一份標本進行相同項目檢測，不同檢測方法所獲得的結果應相互符合。本研究按EP9-A2文件對HISCL5000 分析儀及e601分析儀定量檢測HBsAg、HBsAb的結果進行比對分析，二者檢測結果r2分別為0.982 2、0.974 8均大于0.95，說明二者定量檢測HBsAg、HBsAb具有較好一致性。本研究結果顯示，磁微?；瘜W發(fā)光酶免疫法與ELISA對HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb符合率分別為99.6%、93.5%、99.6%、94.9%、92.0%，檢測結果具有較好的一致性，高于相關報道的符合率[16]，其原因可能在于不相符的結果主要出現(xiàn)在臨界值濃度標本。大量研究顯示，磁微粒化學發(fā)光酶免疫法對臨界值標本的檢出率及結果準確性均優(yōu)于ELISA[17-18]。由此可見，ELISA與磁微?；瘜W發(fā)光酶免疫法對臨界值標本的檢測結果存在差異，就方法學和自動化程度而言，磁微?；瘜W發(fā)光酶免疫法優(yōu)于ELISA。HISCL5000分析儀檢測HBsAg攜帶污染X=0.070 8，小于L-L組3SD(0.106 2)，說明HISCL5000分析儀可以有效避免交叉污染，保證檢測結果的準確性。本研究顯示HISCL5000分析儀對HBsAg、HBsAb的檢測下限分別為0.006、0.213 6 mIU/mL，均能滿足臨床需求，同時HISCL5000分析儀檢測1 642患者HBsAg，≤0.01 IU/mL 1 389例，占陰性標本99.2%(1 389/1 400)，HBsAg≥5.0 IU/mL16例，占陽性標本89.3%(216/242)，說明HISCL5000分析儀能有效區(qū)分陰性和陽性標本。以上均說明磁微?；瘜W發(fā)光酶免疫法定量檢測結果能更好地用于患者病情監(jiān)測和疫苗接種效果評價，HISCL5000能為臨床乙型肝炎的診斷、治療和全程動態(tài)監(jiān)測提供準確的科學依據(jù)。

綜上所述，HISCL5000分析儀具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、攜帶污染低、檢測快速、標本用量少、自動化程度高等優(yōu)點，可以很好地滿足臨床診斷要求。

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Performance evaluation of Sysmex HISCL5000 in detecting HBV markers

EJianfei,LIULihong,CHENZongyao,WANGDengchao,YEMin,YUANChengliang△

(DepartmentofClinicalLaboratory，thePeople′sHospitalofDeyangCity，Deyang,Sichuan618000，China)

ObjectiveTo analyze performance of Sysmex HISCL5000 chemical luminescence immunity analyzer in detecting HBV markers.MethodsEvaluate the accuracy,linearity,carry pollution,the comparison results and detection limit of HISCL5000 according to Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)documents.ResultsInter-inaccuracy of HISCL5000 in detecting HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb and HBcAb with low and high concentrations were 1.24%,1.05%,2.56%,2.27%,2.19%,1.95%,2.37%,1.43%,2.49%,1.29% respectively;Total-inaccuracy were 2.32%,1.74%,3.12%,2.45%,2.94%,2.96%,3.02%,1.82%,3.21%,1.54% respectively.The linearity of HBsAg and HBsAb were 0.976 5 and 0.951 6,the both greater than 0.95.The comparison result of HISCL5000 and e601 in HBsAg and HBsAb were 0.982 2 and 0.974 8.Coincidence of HISCL5000 and ELISA in HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb were 99.6%(550/552),93.5%(516/552),99.6%(550/552),94.9%(524/550),92.0%(508/552) respectively.The carry pollution of HISCL5000 when detecting HBsAg wasX=0.070 8,3SD(L-L)=0.106 2，X<3SD(L-L).Meanwhile detection limit in HBsAg and HBsAb were 0.006 IU/mL,0.213 6 mIU/mL.ConclusionHISCL5000 is suitable for clinical application with good precision,accuracy,linearity,carry pollution,the comparison results and detection limit.

hepatitis B virus;magnetic particle chemiluminescence enzyme immunoassay;serological markers;performance evaluation

2016-01-28修回日期：2016-03-18)

鄂建飛，男，主管檢驗師，主要從事臨床免疫學研究?！?/p>

，E-mail：13568235628@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.020

A

1673-4130(2016)12-1647-04

·論著·