基于抗體-適配子建立的高爾基體蛋白73檢測(cè)方法的研究

洪建明，冼中任，曾林玉，徐　霞

(廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院　510182)

基于抗體-適配子建立的高爾基體蛋白73檢測(cè)方法的研究

洪建明，冼中任，曾林玉，徐霞

(廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院510182)

目的建立基于抗體-適配子雙夾心的高爾基體蛋白73(GP73)ELISA檢測(cè)方法，并用于血清GP73的檢測(cè)。方法以抗體-適配子雙夾心的模式，通過正交試驗(yàn)和方陣滴定試驗(yàn)確定GP73特異性抗體和適配子最佳工作水平、反應(yīng)的溫度和時(shí)間等。以GP73 重組蛋白建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并評(píng)價(jià)該方法靈敏度、精確度、線性及準(zhǔn)確度等。利用該方法對(duì)59例對(duì)照組患者及77 例肝癌患者血清進(jìn)行GP73水平檢測(cè)，并同步進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定甲胎蛋白(AFP)水平。結(jié)果該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為3.87%，批間CV平均為4.44%；平均回收率為95.8%，靈敏度達(dá)12.0 ng/mL。肝癌患者血清GP73水平均明顯高于對(duì)照組、肝炎組和肝硬化組(P<0.05)。GP73對(duì)原發(fā)性肝癌診斷靈敏度為85.7%，而AFP為62.3%；而早期肝癌中GP73和AFP靈敏度分別為76.7%、36.7%。結(jié)論成功建立基于抗體-適配子夾心的GP73 ELISA 檢測(cè)方法，該方法可用于臨床檢測(cè)GP73水平。

高爾基體蛋白73;適配子;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn);肝癌

高爾基體蛋白73(GP73)是相對(duì)分子質(zhì)量約為73×103的Ⅱ型跨膜糖蛋白，在健康人肝臟中表達(dá)甚微或不表達(dá)[1]；但研究發(fā)現(xiàn)其在肝癌細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，GP73被認(rèn)為是肝癌診斷的新型標(biāo)志物[2]。近年來的研究更是表明,GP73診斷原發(fā)性肝癌的靈敏度可達(dá)77.0%～88.6%，明顯優(yōu)于甲胎蛋白(AFP)的40.0%～62.9%；特別是在AFP陰性原發(fā)性肝癌的診斷中GP73更具優(yōu)勢(shì)[3-5]。在以往的研究中，免疫印跡試驗(yàn)和ELISA兩種方法最常用于GP73蛋白水平的檢測(cè)。其中免疫印跡試驗(yàn)由于操作步驟繁多，且僅用蛋白水平半定量，無法在臨床應(yīng)用推廣；ELISA中的單抗、多抗的制備時(shí)間周期長，過程復(fù)雜，純度要求高，難以控制,且抗體的修飾困難，長期保存難等限制了其臨床應(yīng)用。適配子是指經(jīng)篩選后得到能與靶分子特異性結(jié)合的核酸片段，適配子能夠分辨出靶分子結(jié)構(gòu)上細(xì)微的差別，甚至可以區(qū)分1個(gè)甲基或1個(gè)羥基的差別，具有高度特異性。而與抗體相比，適配子具有篩選周期短、可人工合成、方便修飾和保存、可重復(fù)利用等優(yōu)勢(shì)；迄今篩選到的凝血酶、茶堿、抗血管內(nèi)皮因子等適配子已在診斷中彰顯出廣闊的應(yīng)用前景[6]。因此本研究將獲得的適配子用生物素標(biāo)記作為檢測(cè)分子，并以GP73 的特異性多克隆抗體為捕獲分子，建立抗體-適配子雙夾心 ELISA 方法，并應(yīng)用于臨床血清標(biāo)本GP73 水平的檢測(cè)。

1資料與方法

1.1一般資料選取廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2011年3～11月的住院患者177 例為研究對(duì)象,其中肝癌患者77例，男59例，女18例，年齡23～82 歲，診斷以組織病理學(xué)為依據(jù)，腫瘤分期根據(jù)美國器官分配聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)(UNOS)改良的TNM 分期進(jìn)行，其中早期肝癌30例，包括T1期(單個(gè)腫塊小于2 cm)和T2期(單個(gè)腫塊直徑為2～5 cm；或少于3個(gè)腫塊，但每個(gè)腫塊直徑小于3 cm)；肝硬化患者21例，其中男14例，女7例，年齡35～84 歲；肝炎患者20例，其中男15例，女5例，年齡0.3～80.0歲。另選擇同期健康體檢者59 例納入對(duì)照組，排除消化道疾病及腫瘤患者，年齡24～87歲。

1.2儀器與試劑純化的GP73 重組蛋白、GP73 特異性多克隆抗體由本課題組制備；生物素標(biāo)記的GP73 適配子由本課題組前期制備與驗(yàn)證[7]，并交上海Invitrogen公司合成和修飾(適配子序列專列號(hào)：ZL201210235952.2)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素購自美國Sigma公司；酶標(biāo)板購自Greiner Bio-one Cellstar公司；全自動(dòng)洗板機(jī)購自Bio Rad 公司；Elx800酶標(biāo)儀為美國寶特公司產(chǎn)品；E170 電化學(xué)發(fā)光儀購自羅氏公司。

1.3方法

1.3.1抗體-適配子雙夾心ELISA基本操作過程以0.05 mol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋GP73 特異性多抗按試驗(yàn)設(shè)定濃度包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜；用含有 0.05%(v/v)吐溫-20(Tween-20)的 PBS(PBST)洗滌3 次，拍干后加封閉液[2%牛血清清蛋白溶液(BSA)的PBST]封閉，4 ℃過夜；然后用PBST洗滌3次，按設(shè)定濃度每孔加入100 μL GP73 重組蛋白，均作復(fù)孔，酶標(biāo)板在37 ℃孵育1 h后用PBST 洗滌3次，并拍干。按設(shè)計(jì)的方案在酶標(biāo)孔中加入生物素標(biāo)記的GP73適配子100 μL每孔，酶標(biāo)板在37 ℃作用1 h 后用PBST洗滌3次，并拍干。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素100 μL每孔，37 ℃作用1 h；PBST洗滌4次后，加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)100 μL每孔，37 ℃ 30 min；之后終止反應(yīng)并在450 nm波長測(cè)定吸光度(OD)值。

1.3.2抗體-適配子雙夾心ELISA法檢測(cè)GP73 蛋白最適工作條件的確定(1)主要試劑工作濃度確立：將GP73 特異性多抗(5 mg/mL)包板設(shè)立了1∶500、1∶1 000、1∶2 000三個(gè)稀釋度，GP73 蛋白稀釋成200、100、50 ng/mL，Biotin 標(biāo)志的GP73 適配子(30 μg/mL)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素則設(shè)立了 1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000三個(gè)工作濃度。選用四因素三水平的正交表設(shè)計(jì)各因素的交叉試驗(yàn)方案，篩選確定最佳工作濃度。(2)最適封閉液的選擇：最佳工作濃度確定后，固定蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，采用方陣試驗(yàn)測(cè)試不同封閉液(pH7.4 的含1%BSA 的PBST、pH7.4 的1% 脫脂奶粉及pH7.4 的含2%BSA的PBST)與稀釋條件對(duì)結(jié)果的影響，根據(jù)標(biāo)本與空白對(duì)照的差值，最終確定最適封閉液。

1.3.4精確度以標(biāo)準(zhǔn)曲線批內(nèi)誤差和批間誤差來表示該方法的精確度。(1)批內(nèi)誤差：每一標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度做10次重復(fù)，以其批內(nèi)變異系數(shù)(CV)表示批內(nèi)誤差。(2)批間誤差：將GP73標(biāo)準(zhǔn)品各濃度平行測(cè)定10次，以其批間CV表示批間誤差。

1.3.5回收試驗(yàn)于已知GP73濃度的正?；旌涎鍢?biāo)本(n=10)內(nèi)各加入系列濃度的GP73(500、400、200 ng/mL)，重復(fù)測(cè)定3次測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.3.6血清標(biāo)本GP73和AFP水平測(cè)定對(duì)59 例對(duì)照者、77 例肝癌患者、21 例肝硬化患者、20例肝炎患者進(jìn)行血清GP73的測(cè)定(參照1.3.1中步驟)，同時(shí)對(duì)59 例對(duì)照組患者及77 例肝癌患者血清用E170全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定AFP水平。

2結(jié)果

2.1抗體-適配子雙夾心ELISA檢測(cè)GP73最佳工作濃度的確定經(jīng)測(cè)試和對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較分析后發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)系統(tǒng)中，采用5 μg/mL(稀釋度為1∶1 000)濃度的GP73 特異性抗體包板、生物素標(biāo)記的GP73 特異性適配子工作濃度為15 ng/mL(稀釋度為1∶2 000)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作濃度為1∶2 000，獲得的標(biāo)本與空白對(duì)照之間的OD差值最大，見表1，因此初步確定了包板的GP73特異性抗體濃度為5 μg/mL(稀釋度為1∶1 000)、生物素標(biāo)記的GP73特異性適配子工作濃度為15 ng/mL(稀釋度為1∶2 000)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素工作濃度為 1∶2 000。

表1　GP73 夾心ELISA 檢測(cè)系統(tǒng)的正交試驗(yàn)

注：試驗(yàn)組為在檢測(cè)系統(tǒng)中加有 50 ng /mLGP73 蛋白，空白組未加蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，其他條件同試驗(yàn)組。(-)表示未加鏈霉親和素，Substrate only 表示僅加有底物而未加適配體和鏈霉親和素。

2.2最佳封閉條件的確定在最適工作濃度下，采用方陣滴定試驗(yàn)，分別測(cè)試3種封閉液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含2%BSA的PBST作封閉液能明顯減低系統(tǒng)的本底OD值而對(duì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的影響不大，所產(chǎn)生的標(biāo)本與空白對(duì)照之間的差值最大,見表1。因此，最終確定 GP73 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)系統(tǒng)的最佳封閉液條件為pH7.4含2%BSA的PBST。

2.4抗體-適配子雙夾心ELISA檢測(cè)GP73方法的系統(tǒng)評(píng)價(jià)批內(nèi)CV為3.87%(2.70%～4.90%)，批間CV均值為4.44%(2.30%～6.40%)；3個(gè)濃度點(diǎn)的回收率均值為95.8%(92.6%～102.1%),見表3。

2.5血清標(biāo)本GP73和AFP水平測(cè)定77例肝癌患者GP73水平為(178.2±89.6)ng/mL，明顯高于肝硬化患者的(68.7±18.5)ng/mL,肝炎患者的(33.8±10.3)ng/mL，以及對(duì)照組的(18.7±6.7)ng/mL(P<0.05)。肝癌患者血清AFP水平為(142.6±56.4)ng/mL，比對(duì)照組的(4.3±0.9)ng/mL，肝炎患者的(12.2±13.8)ng/mL及肝硬化患者的(16.9±22.3)ng/mL都明顯升高(P<0.05)。但早期肝癌患者血清AFP水平為(13.8±9.3)ng/mL，與其他3組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而早期肝癌組血清GP73水平為(124.3±38.9)ng/mL，比肝硬化、肝炎患者，以及對(duì)照組都明顯升高(P<0.05)。見表4。

表2　抗體-適配子雙夾心 ELISA檢測(cè)GP73方法的批內(nèi)

表3　回收率的測(cè)定

表4　各組受試者GP73、AFP表達(dá)水平

注：與肝癌組比較，*P<0.05；與早期肝癌組比較，#P<0.05。

2.6AFP與GP73的ROC曲線由ROC曲線計(jì)算GP73和AFP用于診斷肝細(xì)胞肝癌的臨界值(Cut-off值)分別為59.6、18.2 μg/L；AFP對(duì)肝細(xì)胞肝癌的診斷靈敏度明顯低于GP73(62.3%低于85.7%，P<0.05)；早期原發(fā)性肝癌GP73的靈敏度為76.7%，AFP的靈敏度僅為36.7%。GP73曲線下面積為0.884，95%置信區(qū)間為0.834～0.934。AFP曲線下面積為0.776，95%置信區(qū)間為0.706～0.845。

3討論

GP73又稱Ⅱ型高爾基體膜蛋白，少量表達(dá)于人膽管上皮細(xì)胞，在肝細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但在肝炎、肝硬化等疾病中GP73表達(dá)明顯上調(diào)，特別是在原發(fā)性肝癌中[8-9]。目前，眾多研究表明GP73作為新型原發(fā)性肝癌腫瘤標(biāo)志物，其診斷特異度與靈敏度優(yōu)于AFP,特別是在早期原發(fā)性肝癌中[10]。Shi等[11]研究顯示原發(fā)性肝癌診斷中GP73靈敏度為68.5%，而AFP則僅為28.8%。2010年一項(xiàng)超過4 000例的大樣本、多中心、多種族GP73系列相關(guān)研究結(jié)果顯示，GP73診斷原發(fā)性肝癌的靈敏度及特異度分別達(dá)到了75%和97%，而AFP僅為58%和85%[12]。但Brker等[13]研究中GP73的靈敏度與特異度為60%和77%，均不及AFP的77%和96%。綜合以上研究，除了各研究入選病例不同的影響外，主要由于目前并沒有統(tǒng)一的GP73檢測(cè)方法與嚴(yán)格精確的臨界值，導(dǎo)致各研究間GP73靈敏度差異很大。

本試驗(yàn)利用GP73特異性多抗和適配子建立了檢測(cè)GP73水平的方法，精密度與準(zhǔn)確性均符合臨床應(yīng)用要求，靈敏度可達(dá)12.5 ng/mL，檢測(cè)肝癌患者血清標(biāo)本的GP73水平明顯高于其他組(P<0.05)，也驗(yàn)證了本方法的實(shí)用性。此外本試驗(yàn)中GP73用于原發(fā)性肝癌的診斷的靈敏度為85.7%，優(yōu)于AFP的62.3%；兩者ROC曲線下面積分別為0.884和0.776，據(jù)此推斷GP73可考慮為原發(fā)性肝癌診斷指標(biāo)。而在早期肝癌組(包括T1、T2期)血清GP73平均水平明顯高于肝硬化組(P<0．05)，而血清AFP在兩組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；早期原發(fā)性肝癌患者檢測(cè)GP73的靈敏度為76.7%，AFP靈敏度僅為36.7%；顯示了GP73在早期診斷原發(fā)性肝癌中的優(yōu)越性。此結(jié)果與Zhao等[14]研究在AFP陰性病例中GP73靈敏度達(dá)72%的結(jié)果相符。此后還需要開展肝癌患者的大樣本研究，才能進(jìn)一步明確肝癌患者各分期與階段血清GP73水平的變化，以明確GP73在肝癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究中建立了基于抗體-適配子檢測(cè)GP73的方法，具有方便、快速、靈敏度和精確度高等特點(diǎn)，為GP73更廣泛的應(yīng)用于臨床診斷奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)為適配子進(jìn)一步用于臨床診斷檢測(cè)提供了依據(jù)。

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Establishment of measuring GP73 by union of antibody and aptamer

HONGJianming,XIANZhongren,ZENGLinyu,XUXia

(KingMedCollegeofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510182,China)

ObjectiveTo establish and evaluate the method of measuring protein-GP73 by union of the specific polyclonal antibody and aptamer against GP73.MethodsBased on the model of antibody-sandwich,the optimal working concentration,reaction temperature and time were determined by orthogonal test and square titration test.The precision,linearity and accuracy of method were assessed.The levels of serum GP73 and alpha fetal protein(AFP)of 59 patients in control group and 77 patients with hepatocarcinoma were measured by antibody-aptamer ELISA and Electrochemical luminescence.ResultsThe standard curves(CV)of intra-assay and inter-assay were 3.87% and 4.44% respectively.The mean rate of callback was 95.8%，sensitive threshold was 12.0 ng/mL.The serum level of GP73 in hepatocarcinoma was significant higher than those in cirrhosis,hepatitis and control group(P<0.05).The level of GP73 in early hepatocarcinoma was significant higher than that in control group(P<0.05).The sensitivity of GP73 on diagnosis for hepatocarcinoma were 85.7%,while those of AFP were 62.3%.The sensitivity of GP73 and AFP on diagnosis for early liver cancer were 76.7% and 36.7%.ConclusionAntibody-aptamer sandwich GP73 ELISA detection method could be used for clinical detection of GP73 level.

GP73;aptamer;enzyme linked immunosorbent assay;liver cancer

2016-01-21修回日期：2016-03-23)

洪建明，男，檢驗(yàn)主管技師，主要從事免疫檢驗(yàn)研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.013

A

1673-4130(2016)12-1627-04

·論著·