Foxp3基因多態(tài)性與廣東地區(qū)產(chǎn)后抑郁相關(guān)性的初步探討*

馮桂玲，潘昆貽，鄧小燕△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科　510260；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東中山 510235)

·論著·

Foxp3基因多態(tài)性與廣東地區(qū)產(chǎn)后抑郁相關(guān)性的初步探討*

馮桂玲1，潘昆貽2，鄧小燕1△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科510260；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東中山 510235)

目的探討中國廣東地區(qū)女性叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)-6054(deletion/ATT，rs5902434)、Foxp3-3279(A/C,rs376158)、Foxp3-924(A/G,rs2232365)與產(chǎn)后抑郁癥(PPD)發(fā)病的相關(guān)性。方法用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(PCR-SSP)分析法對69例PPD確診患者(PPD組)和140例健康產(chǎn)后女性(對照組)的外周血提取DNA樣本，進(jìn)行Foxp3-6054、Foxp3-3279、Foxp3-924點突變分析，比較兩群體該基因多態(tài)性的差異。結(jié)果Foxp3基因Foxp3-6054位點在PPD組AA基因型頻率和對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)oxp3-6054位點等位基因頻率、Foxp3-3279、Foxp3-924位點單核苷酸多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率在PPD組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論中國廣東地區(qū)Foxp3-6054與PPD的發(fā)病具有一定的相關(guān)性，中國廣東地區(qū)Foxp3-3279、Foxp3-924與PPD的發(fā)病未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3；單核苷酸多態(tài)性；產(chǎn)后抑郁

產(chǎn)后抑郁癥(PPD)被世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國精神病協(xié)會定義為產(chǎn)后4～6周內(nèi)第一次發(fā)病(既往無精神障礙史)，癥狀類似普通抑郁，嚴(yán)重影響產(chǎn)婦身心健康的產(chǎn)褥期精神綜合征。近年來，有關(guān)PPD和免疫系統(tǒng)的相互作用逐步受到重視，抑郁癥一方面可引起各種軀體疾病相關(guān)的免疫改變；另一方面，免疫炎癥也是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制之一[1]。許多研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，而叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)可特異表達(dá)于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)亞群上，是其獲得免疫調(diào)節(jié)特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，該基因的正常表達(dá)是CD4+CD25+Treg發(fā)揮作用的前提[2-3]。關(guān)于PPD與Foxp3基因多態(tài)性的相關(guān)研究少有報道。因此，本課題組試圖探討Foxp3基因的突變是否與 PPD的發(fā)生有關(guān)，通過查閱文獻(xiàn)，可發(fā)現(xiàn)Foxp3-6054(deletion/ATT，rs5902434)、Foxp3-3279(A/C,rs376158)和Foxp3-924(A/G,rs2232365)這3個基因單核苷酸多態(tài)性位點的突變與銀屑病等疾病的發(fā)生相關(guān)[4]。因此，本研究選取Foxp3上述3個基因單核苷酸多態(tài)性位點來研究其與 PPD的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料隨機(jī)選擇2013年6月至2014年9月在廣東省越秀區(qū)詩書街社區(qū)醫(yī)療中心的產(chǎn)后回訪產(chǎn)婦進(jìn)行愛丁堡 PPD癥評估量表(EPDS)調(diào)查。并根據(jù)EPDS診斷標(biāo)準(zhǔn)，大于或等于10分提示存在不同程度的抑郁癥狀，則視為篩查陽性，共篩選出35例PPD患者，總分越高，抑郁程度越高[5]，另34例來自廣州市腦科醫(yī)院確診為PPD患者，共69例PPD患者納入PPD組。對照組為140例足月產(chǎn)婦，平均年齡(29.4±4.6)歲，均為廣東籍貫漢族人，既往無精神障礙史，無原發(fā)性高血壓、心血管疾病、肝腎疾病、糖尿病等病史。產(chǎn)婦分別采集所有研究對象清晨空腹靜脈采血2～3 mL，以乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝，保存于4 ℃冰箱中備用，用于基因組DNA抽提。

1.2儀器與試劑Taq DNA聚合酶、飽和酚、LadderⅠ、0.5 g/mL 溴化乙啶(EB)為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，引物由生工生物(上海)有限公司合成[6]。儀器為PC480熱循環(huán)PCR分析儀和數(shù)字凝膠成像分析儀。Foxp3基因特異性引物序列為如下。Foxp3-6054，F(xiàn)1：5′-ACC TTT AAG TCT TCT GCC ATT TAT TCT ATT ATT T-3′;F2：5′-CCT TTA AGT CTT CTG CCA TTT ATT CTA TTA TTA-3′;R：5′-TGA TTA TCA GCG CAC ACA CTC AT-3′。Foxp3-3279,F1：5′-CTG GCT CTC TCC CCA ACT GA-3′；F2：5′-TGG CTC TCT CCC CAA CTG C-3′;R：5′-ACA GAG CCC ATC ATC AGA CTC TCT A-3′。Foxp3-924，F(xiàn)1：5′-CCC AGC TCA AGA GAC CCC A-3′；R1：5′-GGG CTA GTG AGG AGG CTA TTG TAA C-3′；F2：5′-CCA GCT CAA GAG ACC CCG-3′；R2：5′-GCT ATT GTA ACA GTC CTG GCA AGT G-3′。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的抽提按照Gentra公司的苯酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2Foxp3基因三位點多態(tài)性檢測根據(jù)設(shè)計的Foxp3基因特異性引物，用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法(PCR-SSP)檢測3個等位基因。PCR反應(yīng)體系為：DNA 2.5 μL,加入10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，20 μmol/L 的上下游引物各1.0 μL，5×106μ/L Taq DNA聚合酶1.0 μL，滅菌雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)足至25 μL。TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：Foxp3-6054，預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s；共35個循環(huán)，最后延伸7 min。Foxp3-3279/Foxp3-924，預(yù)變性96 ℃ 5 min；變性96 ℃ 20 s,退火70 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 25 s，5個循環(huán)；變性96 ℃ 25 s，退火65 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 50 s，25個循環(huán)；變性96 ℃ 30 s，退火55 ℃ 60 s，延伸72 ℃ 90 s，5個循環(huán)；最后延伸5 min。PCR 產(chǎn)物行2.0%的瓊脂糖凝膠(含 0.5 g/mL EB，100∶5)，取 9 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL溴酚藍(lán)緩沖液混勻后加樣于 0.5×TBE 緩沖液中，180伏電泳約22 min，在紫外凝膠分析系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增條帶并照相。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。用基因計數(shù)法計算基因型和等位基因頻率，等位基因頻率=(2×純合子數(shù)+雜合子數(shù))/(2×受檢人數(shù))，用Hardy-Weinberg檢測樣本是否符合孟德爾遺傳規(guī)律；基因型和等位基因頻率差異比較分別采用χ2檢測，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義(雙側(cè)檢驗)。

2結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗在Hardy-Weinberg遺傳平衡定律中，如P<0.05，則樣本人群該基因頻率不符合遺傳平衡法則；如P>0.05，則樣本人群該基因頻率符合遺傳平衡法則，具有恒定性。首先對 PPD組及對照組 Foxp3基因型分布進(jìn)行檢驗，統(tǒng)計PPD組和對照組不同位點基因型并用Hardy-Weinberg平衡原理估測樣本的群體代表性，本組研究對象檢驗結(jié)果為:SNP-6054χ2=1.58；SNP-3279χ2=1.21；SNP-924χ2=2.57,顯示PPD組基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明研究對象所在人群實際基因頻率和期望基因頻率的差異不明顯，其分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳遺傳平衡，具有群體代表性。

表1　Foxp3基因3個SNP位點Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.2Foxp3基因多態(tài)性檢測結(jié)果

2.2.1Foxp3-6054位點多態(tài)性檢測TT基因型只可見T組引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物條帶，為del/del純合子；AA(ATT/ATT)基因型只可見A 組引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物條帶，為ATT/ATT純合子；TA基因型可見T組A組兩組引物擴(kuò)增 PCR 產(chǎn)物條帶，為del/ATT雜合子。見圖1-A。

2.2.2Foxp3-3279位點多態(tài)性檢測CC基因型只可見C組引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物條帶，CC為CC純合子；AA基因型只可見A組引物擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物條帶，AA為AA純合子；AC 基因型可見C組 A 組兩組引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物條帶，AC為AC雜合子。見圖1-B。

2.2.3Foxp3-924位點多態(tài)性檢測AA基因型只可見A組引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物條帶，AA為AA純合子；GG基因型只可見G組引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物條帶，GG為GG純合子；GA基因型可見G組A組兩組引物擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物條帶，GA為GA雜合子。見圖1-C。

注：M為標(biāo)準(zhǔn)參照物DL600 bp。

圖1Foxp3-6054、Foxp3-3279和Foxp3-924位點

基因型PCR-SSP分析電泳

2.3重復(fù)性實驗隨機(jī)選取10%的樣本進(jìn)行重復(fù)性實驗，結(jié)果與之前實驗結(jié)果符合率為100%。

2.4基因型及等位基因分布頻率

2.4.1Foxp3-6054位點多態(tài)性基因型及等位基因分布頻率Foxp3-6054位點ATT插入型等位基因頻率在 PPD組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TT、TA和AA 3種基因型頻率在PPD患者中分別占39.1%、50.7%和10.1%；在對照組中分別占34.3%、64.3%和1.4%。兩組間TT基因型和TA基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而AA基因型頻率明顯高于對照組(P<0.05)。兩組間T等位基因和A等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　Foxp3-6054位點多態(tài)性基因型及等位基因在

2.4.2Foxp3-3279位點多態(tài)性基因型及等位基因分布頻率Foxp3-3279位點A等位基因頻率在 PPD組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AA、AC和CC 3種基因型頻率在 PPD患者中分別為8.7%、23.2%和68.1%；在對照組中分別為5.0%、36.4%和58.6%。3種基因型頻率在 PPD組和對照組的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組間等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　Foxp3-3279位點多態(tài)性基因型及等位基因在

2.4.3Foxp3-924位點多態(tài)性基因型及等位基因分布頻率Foxp3-924位點G等位基因頻率在 PPD患者和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AA、AG和GG 3種基因型頻率在 PPD患者中分別占39.1%、39.1%和21.7%；在健康對照中分別占36.4%、45.0%和18.6%。3種基因型頻率在 PPD患者和對照組的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組間等位基因頻率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3　Foxp3-924位點多態(tài)性基因型及等位基因在人群中

3討論

PPD屬于神經(jīng)癥性抑郁癥，目前對抑郁發(fā)病機(jī)制的研究證實，抑郁癥并不是由單一的神經(jīng)遞質(zhì)失衡引起，而是受多因素影響。研究顯示抑郁癥患者體內(nèi)炎癥前細(xì)胞因子、急性期反應(yīng)蛋白、化學(xué)增活素及細(xì)胞黏附分子等水平明顯升高，影響抑郁癥的特征性改變，如神經(jīng)遞質(zhì)代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌的改變和突出可塑性改變等，證實炎性反應(yīng)在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。近幾年，許多臨床和動物實驗研究表明大部分抑郁癥的患者存在免疫系統(tǒng)激活的表現(xiàn)，如在給予細(xì)胞因子治療的非抑郁癥患者可以出現(xiàn)抑郁行為，一些患有免疫功能異常的自身免疫性疾病患者易出現(xiàn)抑郁行為，某些細(xì)胞因子可以激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)，可以使中樞腎上腺系統(tǒng)功能亢進(jìn)，或者導(dǎo)致血清素系統(tǒng)的活化，引起抑郁癥的相關(guān)血液生化改變[1]。由此可見，免疫調(diào)節(jié)的失衡是PPD的發(fā)病機(jī)制之一。

人類Foxp3基因定位于XP11.23，含有11個外顯子和10個內(nèi)含子，其cDNA全長1 869 bp，表達(dá)于CD4+CD25+Treg，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Foxp3可作為CD4+CD25+Treg特異性標(biāo)志物，而Treg是T細(xì)胞的一個亞群，對免疫反應(yīng)具有抑制效應(yīng)[6]。目前在其他免疫紊亂的疾病中，有關(guān)Treg的研究很多，而對于存在免疫失衡的抑郁癥Treg的作用研究較少。鑒于Treg廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，同時考慮到抑郁癥患者體內(nèi)存在明顯的免疫功能紊亂，尤其是免疫激活，筆者推測在抑郁癥中很可能存在Treg的功能紊亂，其功能的恢復(fù)及免疫穩(wěn)態(tài)的維持可能有利于抑郁癥的治療。

本研究中使用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)Foxp3-6054、Foxp3-3279、Foxp3-924三位點基因具有群體代表性，證實抽樣與分型結(jié)果可靠。以PCR-SSP法對所選擇的全部樣本進(jìn)行Foxp3-6054、Foxp3-3279、Foxp3-924三位點基因多態(tài)性與中國廣東地區(qū) PPD相關(guān)性分析。通過分析發(fā)現(xiàn)Foxp3-6054單核苷酸基因多態(tài)性與中國廣東地區(qū)PPD發(fā)病相關(guān)。攜帶Foxp3-6054 位點基因型AA基因型頻率明顯升高(P<0.05)，提示Foxp3-6054A/A位點可能是中國廣東地區(qū)漢族人群 PPD發(fā)生的危險因子。而另外兩個突變基因位點Foxp3-3279和Foxp3-924的研究發(fā)現(xiàn)其單核苷酸基因多態(tài)性與中國廣東地區(qū) PPD發(fā)病之間無顯著相關(guān)(P>0.05)，因而推斷Foxp3-3279和Foxp3-924位點可能不是 PPD發(fā)病的獨立危險因素，與中國廣東地區(qū) PPD的發(fā)病未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

基于基因型決定表型的理論，本文未對 PPD的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級，為科學(xué)驗證Foxp3基因是否為廣東地區(qū) PPD的易感基因，建議增加樣本量，擴(kuò)大樣本收集范圍，檢測該基因的多態(tài)性位點，進(jìn)一步證實Foxp3基因型可能直接或間接改變細(xì)胞內(nèi)Foxp3的表達(dá)水平導(dǎo)致或加重 PPD疾病的嚴(yán)重程度，檢測CD4+CD25+Treg的表達(dá)數(shù)量，監(jiān)測相關(guān)激素水平和激素受體基因多態(tài)性的變化，同時關(guān)注基因多態(tài)性與疾病臨床表型多樣性的內(nèi)在聯(lián)系。

[1]楊樂.抑郁癥免疫失衡機(jī)制中多巴胺受體D3與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)聯(lián)作用[D].湖南：中南大學(xué)，2007.

[2]李藝,楊歡,肖波，等.5-羥色胺受體與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在抑郁癥免疫功能紊亂中的關(guān)聯(lián)作用[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2009,18(4)：308-310.

[3]劉冰,李曉瑜,萬禮霞.FOXP3基因在人類變應(yīng)性鼻炎中的表達(dá)[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2010,39(22):4065-4067.

[4]湯月芬,王立偉,施慎遜.產(chǎn)后抑郁癥生物學(xué)病因及評估的研究進(jìn)展[J].中華精神科雜志,2005,38(2):126-128.

[5]高琳.Foxp3_Fas_FasL_COMT基因多態(tài)性與漢族尋常型銀屑病相關(guān)性分析[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2008.

[6]Gao L，Li K，Li F，et al．Polymorphisms in the FOXP3 gene in HAN chinese psoriasis patients[J]．J Dermatol SCI，2010，57(1):51-56．

Explore the association between the polymorphism of Foxp3 gene and postpartum depression in Guangdong Province*

FENGGuilin1，PANKunyi2，DENGXiaoyan1△

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510260,China;2.SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou,Guangdong510235,China)

ObjectiveTo investigate the association of Fork shaped spiral gene transcription factor 3(Foxp3)-6054(deletion/ATT，rs5902434),Foxp3-3279(A/C,rs376158),Foxp3-924(A/G,rs2232365)with the morbidity of postpartum depression among the populations in Guangdong province.MethodsThe peripheral blood DNA samples were identified by means of polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR-SSP)analysis among 69 cases which were confirmed to be postpartum depression and 140 cases of healthy control of postpartum women,and then we analyzed the point mutation of Foxp3-6054,Foxp3-3279,Foxp3-924 as well as compare the differences between the two groups in gene polymorphisms.ResultsThe SNP gene frequency and genotype frequency of Foxp3-6054 was statistical significant among the group of postpartum depression and the control group(P<0.05),and the SNP gene frequency and genotype frequency of Foxp3-3279,Foxp3-924 was not statistical significant among the group of postpartum depression and the control group(P>0.05).ConclusionFrom the current investigation cases,the Foxp3-6054 could be proved to associated with the morbidity of postpartum depression among the populations in Guangdong province,and the Foxp3 gene Foxp3-3279,Foxp3-924 could not be proved to associated with the morbidity of postpartum depression among the population in Guangdong province.

forkhead helix transcription factor 3;single nucleotide polymorphism;postpartum depression

2016-01-10修回日期：2016-03-18)

廣東省廣州市屬高校學(xué)科平臺建設(shè)臨床檢驗診斷學(xué)項目(穗教科2011-34)。

馮桂玲，女，主管技師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗研究?！?/p>

， E-mail:dxyzgy@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.003

A

1673-4130(2016)12-1598-04