血清miR-21-5P和miR-155-5P表達(dá)對(duì)百草枯中毒患者診斷及預(yù)后的影響

蘭超　郭楠楠　裴輝　史曉朋　張華麗　喬英杰

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部　河南 鄭州　450052)

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血清miR-21-5P和miR-155-5P表達(dá)對(duì)百草枯中毒患者診斷及預(yù)后的影響

蘭超郭楠楠裴輝史曉朋張華麗喬英杰

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部河南 鄭州450052)

【摘要】目的探討血清miR-21-5P和miR-155-5P的表達(dá)對(duì)百草枯中毒患者診斷和預(yù)后的影響。方法選擇2014年11月至2015年8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的102例百草枯中毒患者，按入院時(shí)尿百草枯濃度分為輕型(32例)、中型(42例)、重型(28例)3組，并選取健康人30例作為對(duì)照組。記錄各組患者臨床資料，統(tǒng)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)受試者血清miR-21-5P和miR-155-5P的表達(dá)量，評(píng)估m(xù)iR-21-5P和miR-155-5P在百草枯中毒臨床診療中的價(jià)值。結(jié)果血清miR-21-5P和miR-155-5P診斷百草枯中毒的ROC曲線下面積分別是88.3%和83.9%；重型組的兩種標(biāo)志物表達(dá)量明顯高于中型組、輕型組和健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；死亡組miR-21-5P和miR-155-5P表達(dá)量均高于存活組，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論百草枯中毒患者外周血 miR-21-5P和miR-155-5P表達(dá)水平增高，可能成為百草枯中毒診斷的標(biāo)志物。兩者對(duì)區(qū)分百草枯中毒嚴(yán)重程度及判斷預(yù)后都具有積極的臨床意義。

【關(guān)鍵詞】百草枯中毒；miRNA；診斷；預(yù)后

百草枯為有機(jī)雜環(huán)類接觸性除草劑，可經(jīng)皮膚、呼吸道及消化道吸收造成急性中毒，是內(nèi)科常見(jiàn)除草劑急性中毒之一。目前臨床上尚缺乏特效治療方法，有報(bào)道顯示其病死率高達(dá)50%～80%[1]。百草枯可損害多個(gè)臟器功能，其中肺損傷是最突出和最嚴(yán)重的改變，可導(dǎo)致“百草枯肺”，早期表現(xiàn)為急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，后期則出現(xiàn)肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化，是百草枯中毒患者致死的主要原因。

微小RNAs(MicroRNAs)又簡(jiǎn)稱miRNAs，是一類長(zhǎng)約19～25個(gè)核苷酸的小分子RNA，廣泛存在于動(dòng)物、植物、病毒和單個(gè)細(xì)胞等生物體中。miRNAs是一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程的功能，并且可在血清中穩(wěn)定表達(dá)[2]。近年來(lái)，miR-21-5P和miR-155-5P在免疫調(diào)節(jié)、肺損傷和肺纖維化等病理生理的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制研究得到了廣泛的關(guān)注[3]，然而對(duì)于miR-21-5P和miR-155-5P在百草枯中毒的診斷及預(yù)后判斷方面尚缺乏臨床病例研究。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)百草枯中毒患者血清中miR-21-5P和miR-155-5P的相對(duì)表達(dá)量，對(duì)照臨床相關(guān)指標(biāo)，探討miR-21-5P和miR-155-5P對(duì)百草枯中毒診斷及預(yù)后的指導(dǎo)意義。

1資料和方法

1.1主要儀器和試劑miRNA提取分離試劑盒：TIANGEN DP501(北京天根生化科技有限公司)；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒：TIANGEN KR201(北京天根生化科技有限公司)；miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒：TIANGEN FP401(北京天根生化科技有限公司)；ABI7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Bioplastics PCR八連管(上海百研生物科技有限公司)。

1.2研究對(duì)象選擇2014年11月至2015年8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的102例百草枯中毒患者進(jìn)行研究。所有患者入院后均做尿液快速半定量檢測(cè)，并按尿百草枯濃度檢測(cè)結(jié)果分為3組：輕型(尿百草枯濃度<10 μg/ml)32例，中型(尿百草枯濃度10～30 μg/ml)42例，重型(尿百草枯濃度>30 μg/ml)28例。各組按轉(zhuǎn)歸分為死亡和存活兩個(gè)亞組。選取30例健康體檢者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：口服中毒，中毒距入院時(shí)間在4～24 h 內(nèi)(多數(shù)患者來(lái)院不是首診，故入院距服毒時(shí)間較長(zhǎng))，入院前未接受過(guò)血液灌流或血液凈化治療，既往無(wú)肺、肝、腎、心臟、腫瘤及血液系統(tǒng)等疾病，資料完整。診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)：參照全國(guó)統(tǒng)編教材《急診醫(yī)學(xué)》《預(yù)防醫(yī)學(xué)》“百草枯中毒”相關(guān)章節(jié)及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《職業(yè)性急性百草枯中毒的診斷》和2013年第三屆全國(guó)百草枯農(nóng)藥中毒學(xué)術(shù)會(huì)議對(duì)百草枯中毒診斷與治療的“泰山共識(shí)”進(jìn)行百草枯中毒診斷和分型。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他毒物中毒者，妊娠及既往有肺、心臟、肝、腎、腫瘤及血液系統(tǒng)等疾病者。本項(xiàng)研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，本項(xiàng)研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3治療方法對(duì)服毒距入院時(shí)間<8 h的患者均給予清水洗胃，所有患者均給予活性碳或蒙脫石散吸附并給予導(dǎo)瀉，置尿管導(dǎo)尿，在棄去膀胱內(nèi)的殘余尿后1 h留取尿標(biāo)本待檢。同時(shí)應(yīng)用大劑量糖皮質(zhì)激素(甲潑尼龍500～1 000 mg/d)、環(huán)磷酰胺、烏司他丁、血必凈注射液及保護(hù)器官藥物，口服心得安等藥物以對(duì)抗百草枯毒性。當(dāng)患者出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難及動(dòng)脈血氧分壓(PaO2) <40 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)時(shí)給予低流量鼻導(dǎo)管吸氧。在取得患者和家屬同意后給予床旁血液灌流(灌流均在留取血、尿標(biāo)本之后進(jìn)行)。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法檢測(cè)指標(biāo)：記錄患者的姓名、性別、年齡、中毒劑量、中毒距就診時(shí)間、中毒距洗胃時(shí)間及28 d預(yù)后，同時(shí)記錄患者入院時(shí)的尿百草枯濃度、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、尿素氮(BUN)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、D二聚體(D-D)、動(dòng)脈血乳酸(Lac)、動(dòng)脈血二氧化碳分壓(PaCO2)和急性生理和慢性健康狀態(tài)評(píng)分(acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ評(píng)分)等指標(biāo)。健康對(duì)照組同期進(jìn)行。

血清miR-21-5P和miR-155-5P的測(cè)定：于患者入院12 h內(nèi)、血液灌流前抽取靜脈血5 ml，在4 ℃下3 000 r/min離心10 min，提取血清；提取血清中總的miRNA；對(duì)miRNA 3’末端進(jìn)行加Poly (A)處理，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈；采用SYBR GreenI 染料法進(jìn)行熒光定量檢測(cè)miR-21-5P和miR-155-5P相對(duì)表達(dá)量(以上步驟均按照試劑說(shuō)明書步驟進(jìn)行，引物序列及內(nèi)參照U6均由北京天根生化科技有限公司合成)。本實(shí)驗(yàn)采用ABI7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)分析，以U6為內(nèi)參照基因。采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量(△△Ct=CtmiRNA-CtU6)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的兩組定量資料比較采用t檢驗(yàn)(方差不齊時(shí)采用校正t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制miR-21-5P、miR-155-5P診斷百草枯中毒的ROC 曲線，并計(jì)算曲線下面積。

2結(jié)果

2.1一般資料共納入102例百草枯中毒患者，其中男48例，女54例，年齡14～65歲，中毒劑量5～300 ml，中毒至就診時(shí)間0.4～22 h，中毒距洗胃時(shí)間為0.4～8 h。中毒后28 d 內(nèi)存活44例，死亡58例，病死率56.9%。按入院時(shí)尿百草枯濃度分為輕型、中型、重型3組。3組間性別、年齡、中毒距就診時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3組間中毒劑量、中毒距洗胃時(shí)間、WBC、BUN、ALT、PaCO2、Lac、APACHE Ⅱ評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　百草枯中毒患者入組時(shí)一般資料比較

2.2血清中miR-21-5P和miR-155-5P的表達(dá)對(duì)百草枯中毒的診斷效能miR-21-5P診斷百草枯中毒的曲線下面積是88.3%(95%CI：0.813～0.953)，當(dāng)miR-21-5P表達(dá)量為0.56時(shí)約登指數(shù)為最大值。miR-155-5P診斷百草枯中毒的曲線下面積是83.9%(95%CI：0.759～0.919)，當(dāng)miR-155-5P表達(dá)量為0.67時(shí)約登指數(shù)為最大值。見(jiàn)圖1。

圖1　miR-21和miR-155診斷百草枯中毒的ROC曲線

2.3不同嚴(yán)重程度百草枯中毒患者血清中miR-21-5P和miR-155-5P表達(dá)量對(duì)比重型組的miR-21-5P和miR-155-5P表達(dá)量明顯高于中型組、輕型組和健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　不同嚴(yán)重程度百草枯中毒患者血清miR-21-5P和

2.4百草枯中毒患者預(yù)后相關(guān)因素分析將102例百草枯中毒患者按中毒后28 d預(yù)后分為存活組和死亡組，兩組間性別、年齡、中毒距就診時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；死亡組中毒劑量、中毒距洗胃時(shí)間、尿百草枯濃度、WBC、BUN、ALT、Lac、APACHE Ⅱ評(píng)分、miR-21-5P和miR-155-5P表達(dá)量明顯高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PaCO2明顯低于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3　存活組和死亡組各項(xiàng)臨床指標(biāo)比較

3討論

百草枯中毒多以消化道吸收中毒常見(jiàn)，患者多為自服或誤服中毒。百草枯口服后吸收迅速，0.5～4 h達(dá)血漿濃度峰值，吸收后迅速分布到肺、腎、肝等器官，并在肺內(nèi)聚集[4]。急性百草枯中毒機(jī)制較復(fù)雜，除了百草枯本身理化作用外，還有大量的炎性因子和細(xì)胞因子參與機(jī)體的氧化損傷、炎癥反應(yīng)、凝血系統(tǒng)異常、細(xì)胞凋亡等過(guò)程[5]。臨床上可出現(xiàn)多臟器功能受損，其中以肺損傷為主，危害最大。近年來(lái)百草枯中毒的發(fā)病率愈來(lái)愈高，國(guó)內(nèi)外一直致力于百草枯中毒的研究，但至今尚無(wú)有效解毒藥，許多治療方法仍處于探索中，缺乏循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)。

miRNAs是一類非常重要的機(jī)體調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、維持生物體自身穩(wěn)態(tài)、參與疾病病理生理過(guò)程等方面都發(fā)揮重要作用，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。已有諸多研究表明，miRNAs與肺損傷、肺內(nèi)纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素可引起巨噬細(xì)胞中miR-132、miR-146a、miR-155表達(dá)水平增加。還有研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性肺纖維化進(jìn)展速度快慢可能是miR-302c、miR-423-5p、miR-210等調(diào)節(jié)的結(jié)果。另有研究表明，let-7對(duì)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展起著負(fù)調(diào)控作用，提出let-7d不僅可能是肺纖維化一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，還可能是監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的一個(gè)標(biāo)志物。

miR-21-5P編碼基因定位于TMEM49基因編碼區(qū)內(nèi)，通過(guò)自身啟動(dòng)區(qū)完成轉(zhuǎn)錄及poly A尾聚合，最終變?yōu)槌墒斓膍iRNA。miR-21與多種疾病相關(guān)[5]。有的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化小鼠和特發(fā)性肺纖維化患者肺內(nèi)的表達(dá)都增高，提示miR-21對(duì)肺纖維化發(fā)生起著正向推動(dòng)作用。此外，還有研究證明，miR-21參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫過(guò)程，對(duì)不同信號(hào)傳導(dǎo)的靶蛋白起關(guān)鍵調(diào)控作用。本項(xiàng)研究顯示miR-21-5P表達(dá)量上調(diào)，可做為百草枯中毒診斷的標(biāo)志物，具體作用機(jī)制尚不明確，可能與百草枯中毒患者大多存在肺損傷和肺纖維化有關(guān)。

miR-155-5P是一個(gè)多功能miRNA，位于人類21號(hào)染色體B細(xì)胞非編碼集合基因簇的第3個(gè)外顯子中，在免疫應(yīng)答的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7]。有研究表明miR-155能夠影響Th1、Th2細(xì)胞的功能，對(duì)活化T細(xì)胞具有一定調(diào)節(jié)作用[8]。汪勤等[9]的研究表明miR-155參與對(duì)Treg細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，在膿毒癥免疫失衡機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。本研究結(jié)果顯示，健康組與輕中重型組間、生存組與死亡組間miR-155-5P表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此推斷，miR-155-5P可作為百草枯中毒診斷的標(biāo)志物，亦可對(duì)百草枯中毒診斷、病情嚴(yán)重程度、預(yù)后做出預(yù)警。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探討了miR-21-5P和miR-155-5P與百草枯中毒診斷及預(yù)后判斷的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康組與輕中重型組間、生存組與死亡組間miR-21-5P和miR-155-5P表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-21-5P、miR-155-5P在死亡組的相對(duì)表達(dá)量顯著增高。miR-21-5P和miR-155-5P可作為百草枯中毒診斷和預(yù)后判斷的新標(biāo)志物，作為基因?qū)用娴纳飿?biāo)記物，有可能為百草枯中毒的治療開(kāi)辟新的天地。本項(xiàng)研究的樣本量較小，且未進(jìn)行遠(yuǎn)期預(yù)后的隨訪，不能明確miR-21-5P和miR-155-5P對(duì)百草枯中毒遠(yuǎn)期預(yù)后的影響?？傊?，這兩個(gè)標(biāo)志物對(duì)百草枯中毒的臨床意義還需更加深入的研究。

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The guiding significance of miR-21-5P and miR-155-5P expressed in serum for the diagnosis and prognosis of paraquat intoxication

Lan Chao, Guo Nannan, Pei Hui, Shi Xiaopeng, Zhang Huali, Qiao Yingjie

(DepartmentofEmergency,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the guiding significance of miR-21-5P and miR-155-5P expressed in serum for the diagnosis and prognosis of paraquat intoxication. Methods102 cases of patients with paraquat intoxication in the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University from November of 2014 to August of 2015 were chosen and divided into the mild group(n=32), moderate group(n=42), and severe group(n=28) according to their semi-quantification results of urine paraqua when they were admitted to the hospital. At the same time, 30 healthy persons were selected as the control group. The clinical data and related indicators of each group were collected, and the expression of miR-21-5P and miR-155-5P was measured to evaluate their clinical value in the diagnosis and treatment of paraquat intoxication. ResultsThe area under the ROC curve was 0.883 for the diagnosis of paraquat intoxication using miR-21-5P, while that was 0.839 using miR-155-5P. The expression of miR-21-5P and miR-155-5P was statistically different between the healthy, mild, moderate, and severe groups. There was also statistically significant difference between survival and death group (P<0.05). ConclusionThe expression of miR-21-5P and miR-155-5P in serum may be used as an indicator for the diagnosis of paraquat intoxication, and they have positive clinical significance for the prognosis of paraquat intoxication.

【Key words】paraquat intoxication; miRNA; diagnosis; prognosis

基金項(xiàng)目：國(guó)家臨床重點(diǎn)?？祈?xiàng)目(2012649)；河南省基礎(chǔ)與前沿

通訊作者：蘭超，E-mail：lanchao29@163.com。

【中圖分類號(hào)】R 605.97

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.06.003

(收稿日期：2016-03-11)

技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(142300410068)。