毛細(xì)管電泳分離氟西汀對映體

楊思文,代語林,鄧　寧,王　燕,何建波,朱燕舞

(合肥工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,安徽 合肥　230009)

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毛細(xì)管電泳分離氟西汀對映體

楊思文,代語林,鄧寧,王燕,何建波,朱燕舞

(合肥工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,安徽 合肥230009)

摘要:文章建立了在毛細(xì)管電泳中以離子液體三甲基羥乙基雙三氟甲磺酰亞胺鹽(HOEtN1,1,1NTF2)和羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)聯(lián)用分離氟西汀對映體的毛細(xì)管電泳新方法。在檢測波長為226 nm,高差為10 cm，進樣10 s的條件下,考察了CM-β-CD的濃度、HOEtN1,1,1NTF2、背景緩沖液及其pH值、分離電壓等實驗條件對氟西汀對映體拆分的影響。獲得了氟西汀對映體分離的最佳實驗條件為:在15 mmol/L pH值為 8.5磷酸鹽緩沖液中添加30 mmol/L HOEtN1,1,1NTF2和10 g/L CM-β-CD,分離電壓為20 kV。在最佳實驗條件下,氟西汀對映體在11 min內(nèi)實現(xiàn)了基線分離,分離度為2.33。該方法操作簡便、分析快速、分離效果好,適用于分離氟西汀對映體。

關(guān)鍵詞:離子液體;羧甲基-β-環(huán)糊精;毛細(xì)管電泳;對映體分離;氟西汀

氟西汀(fluoxetine)為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs),目前廣泛應(yīng)用于治療抑郁癥,屬于第二代抗抑郁藥[1]。氟西汀有一個手性中心,雖然R型和S型異構(gòu)體藥效相同,但R型比S型作用時間長3倍,并且可以預(yù)防偏頭疼[2-3],所以基于原料藥的質(zhì)量控制及藥效研究,對氟西汀對映體進行手性分離研究具有重要意義。

毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis,CE)具有靈敏度高、分析快速、樣品消耗小等優(yōu)點,近幾年在拆分藥物對映體領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。而羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)是毛細(xì)管電泳分離手性藥物時常用的手性選擇劑[4-5]。文獻(xiàn)[6-7]利用手性選擇劑CM-β-CD分離氟西汀對映體,通過CM-β-CD與氟西汀對映體產(chǎn)生疏水包絡(luò)作用、氫鍵作用和離子間靜電作用,分別在45 min和16 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離。由于離子液體具有導(dǎo)電性高、溶解性好及毒性小等特殊的理化性質(zhì),作為背景緩沖液添加劑廣泛應(yīng)用于高效毛細(xì)管電泳中[8-10]。但目前以離子液體和CM-β-CD聯(lián)用拆分氟西汀對映體的研究不多。

本文采用離子液體三甲基羥乙基雙三氟甲磺酰亞胺鹽(HOEtN1,1,1NTF2)和CM-β-CD共同作為毛細(xì)管電泳背景緩沖液添加劑分離氟西汀對映體,考察了CM-β-CD的質(zhì)量濃度、HOEtN1,1,1NTF2、背景緩沖液的濃度及其pH值、分離電壓等條件對氟西汀對映體分離的影響,獲得了分離氟西汀對映體的最佳電泳條件。實驗結(jié)果表明:添加離子液體HOEtN1,1,1NTF2能提高氟西汀對映體的分離度;在最佳電泳條件下,氟西汀對映體在11 min內(nèi)實現(xiàn)了基線分離,與文獻(xiàn)[6]的研究結(jié)果相比,在HOEtN1,1,1NTF2和CM-β-CD共同作用下,氟西汀對映體分析時間縮短。

1試驗部分

1.1儀器與試劑

配置高壓電源的CL1020高效毛細(xì)管電泳儀、CL1020紫外檢測器、HW-2000色譜工作站(北京彩陸科學(xué)儀器公司);TG328A分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);PHS-3CT酸度劑(上海雷磁儀器廠);SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);未涂層熔融石英毛細(xì)管柱(50 cm×50 μm,河北永年銳灃色譜器件有限公司)。

鹽酸氟西汀(法國Patheon公司);三甲基羥乙基雙三氟甲磺酰亞胺鹽(上海成捷化學(xué)有限公司);羧甲基-β-環(huán)糊精(上海將來實業(yè)股份有限公司);十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、硫脲,均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);實驗用水均為二次去離子水。

1.2溶液的配制

(1)背景緩沖液(background electrolyte solution,BGE)的配制。用二次蒸餾水配制一定濃度的磷酸鹽緩沖溶液,加入CM-β-CD和HOEtN1,1,1NTF2,用磷酸調(diào)節(jié)至所需的pH值。BGE使用前用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾。

(2)樣品溶液的配制。稱取一定量的鹽酸氟西汀用無水乙醇溶解,配制成1.0 g/L樣品儲備溶液,實驗使用前將其稀釋成0.20 g/L樣品溶液,用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾。

1.3試驗方法

開機前,毛細(xì)管依次用1 mol/L的鹽酸溶液沖洗5 min,水沖洗5 min,1 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗10 min,水沖洗5 min,BGE沖洗10 min。每2次進樣之間毛細(xì)管用BGE沖洗3 min。

采用10 cm高差進樣,進樣時間為10 s,檢測波長為226 nm。

2結(jié)果與討論

2.1CM-β-CD質(zhì)量濃度對拆分的影響

由于手性藥物的手性中心在空間的取向不同,且CM-β-CD與手性藥物形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)不同,因此可通過對映體電泳遷移速度差異的增加達(dá)到拆分目的[11-12]。本文考察了CM-β-CD質(zhì)量濃度對手性分離的影響,在BGE含20 mmol/L pH值為8.5 Na2HPO4-H3PO4和30 mmol/L HOEtN1,1,1NTF2,分離電壓為20 kV,檢測波長為226 nm,進樣時間為10 s的條件下,分離度隨CM-β-CD質(zhì)量濃度變化的情況如圖1所示。從圖1可以看出,當(dāng)CM-β-CD的質(zhì)量濃度從0 g/L增大到10 g/L時,氟西汀對映體的分離度逐漸增大，但是當(dāng)CM-β-CD的質(zhì)量濃度大于10 g/L時,氟西汀對映體的分離度開始減小,這是由于分離電流增大產(chǎn)生過度的焦耳熱效應(yīng)導(dǎo)致分離度下降。因此,選擇緩沖液中添加CM-β-CD的最佳質(zhì)量濃度為10 g/L。

圖1　CM-β-CD質(zhì)量濃度對分離度的影響

2.2離子液體濃度對拆分的影響

本文考察了離子液體HOEtN1,1,1NTF2作為緩沖溶液的添加劑對氟西汀對映體的分離影響。在BGE含20 mmol/L pH值為8.5 Na2HPO4-H3PO4和10 g/LCM-β-CD,分離電壓為20 kV,檢測波長為226 nm,進樣時間為10 s的條件下,加入離子液體前后分離氟西汀對映體的電泳譜圖如圖2所示,其中F1和F2代表氟西汀對映體的2個色譜峰。從圖2可以看出,在不添加離子液體,單獨使用CM-β-CD作為手性選擇劑的情況下,氟西汀對映體未能實現(xiàn)基線分離。

在以30 mmol/L HOEtN1,1,1 NTF2和CM-β-CD共同作為背景緩沖液添加劑的情況下氟西汀對映體的分離圖如圖2所示。

從圖2可以看出,背景緩沖液中加入離子液體HOEtN1,1,1NTF2提高了氟西汀對映體分離度,在該實驗條件下,氟西汀對映體在8 min內(nèi)實現(xiàn)了基線分離,分離度為2.00。實驗可能的作用機理是離子液體HOEtN1,1,1NTF2可以促進手性藥物與CM-β-CD之間的相互作用[13-14],使對映體在毛細(xì)管中的電泳行為差異變大,從而提高對映體的分離度。

圖2　氟西汀的分離譜圖

在BGE含20 mmol/L pH值為 8.5 Na2HPO4-H3PO4和10 g/L CM-β-CD,分離電壓為20 kV,檢測波長為226 nm,進樣時間為10 s的條件下,改變添加HOEtN1,1,1NTF2的濃度時,分離度隨離子液體濃度的變化情況如圖3所示。

由圖3可看出,當(dāng)HOEtN1,1,1NTF2的濃度從0 mmol/L增大到30 mmol/L時,氟西汀對映體分離度逐漸增大,這是由于離子液體HOEtN1,1,1NTF2可以提高對映體的分離度;但HOEtN1,1,1NTF2的濃度從30 mmol/L增大到40 mmol/L,氟西汀對映體的分離度呈下降趨勢,這是由于離子液體濃度的增大,BGE離子強度增加,導(dǎo)致分離電流增大,由于焦耳熱(Q)與分離電流(I)平方成正比例關(guān)系,所以分離電流增大導(dǎo)致焦耳熱急劇增加,從而引起分離峰展寬,分離度降低。

因此,選擇HOEtN1,1,1NTF2的最優(yōu)濃度為30 mmol/L。

圖3　離子液體濃度對分離度的影響

2.3背景緩沖液濃度對拆分的影響

背景緩沖液濃度是影響對映體分離度的主要參數(shù)之一。在BGE含pH值為 8.5 Na2HPO4-H3PO4和30 mmol/L HOEtN1,1,1NTF2及10 g/L CM-β-CD,分離電壓為20 kV,檢測波長為226 nm,進樣時間為10 s的條件下,改變緩沖液濃度時,分離度隨緩沖液濃度變化的情況如圖4所示。

由圖4可知,當(dāng)緩沖液濃度從10 mmol/L增加到15 mmol/L時,氟西汀對映體分離度隨著緩沖液濃度的增大而增大,但是當(dāng)緩沖液濃度從15 mmol/L增加到30 mmol/L時,氟西汀對映體分離度呈下降趨勢,這是由于緩沖液濃度過大,焦耳熱影響嚴(yán)重,不利于分離。因此,選擇最佳緩沖液濃度為15 mmol/L。

圖4　緩沖液濃度對分離度的影響

2.4背景緩沖液pH值對拆分的影響

在毛細(xì)管電泳中,緩沖液pH值可影響電滲流的大小以及手性藥物的荷電情況,從而影響對映體的分離[15]。實驗考查了BGE含15 mmol/L Na2HPO4-H3PO4和30 mmol/L HOEtN1,1,1NTF2及10 g/L CM-β-CD,分離電壓為20 kV,檢測波長為226 nm,進樣時間為10 s的條件下,緩沖溶液pH值從7.5增加到9.5時氟西汀對映體的分離情況如圖5所示。由圖5可知,對映體分離度隨pH值的增大而減小,當(dāng)緩沖液pH≤8.5時,氟西汀對映體可實現(xiàn)基線分離,當(dāng)緩沖液pH≥9.0時,氟西汀對映體不能實現(xiàn)基線分離。由于色譜峰的遷移時間隨著pH值的增大而減小,因此為了節(jié)省分析時間并保證實現(xiàn)基線分離,選擇最佳緩沖液pH值為8.5,此時氟西汀對映體在11 min內(nèi)即可獲得基線分離。

pH

2.5分離電壓對拆分的影響

分離電壓是影響柱效、分離度和遷移時間的重要因素。在BGE含15 mmol/L pH 值為8.5 Na2HPO4-H3PO4、30 mmol/L HOEtN1,1,1NTF2和10 g/L CM-β-CD,檢測波長為226 nm,進樣時間為10 s的條件下,分離度隨著分離電壓的變化情況如圖6所示。

圖6　分離電壓對分離度的影響

從圖6可以看出,分離電壓從16 kV增大到20 kV時,氟西汀對映體的分離度逐漸增大,這是由于隨著分離電壓的增大,色譜峰遷移時間縮短,減小了色譜峰展寬;當(dāng)分離電壓從20 kV增大到24 kV時,雖然色譜峰的遷移時間進一步縮短,但是氟西汀對映體的分離度卻明顯下降,這是由于遷移時間縮短,手性藥物與手性選擇劑之間的作用時間減少,同時由于分離電壓過高,焦耳熱急劇增大,引起分離度下降。綜合考慮,選擇最佳分離電壓為20 kV。

綜上所述,毛細(xì)管電泳分離氟西汀對映體的最佳實驗條件為:BGE含15 mmol/L pH值為 8.5 Na2HPO4-H3PO4、30 mmol/L HOEtN1,1,1NTF2和10 g/LCM-β-CD,分離電壓20 kV,檢測波長226 nm,高差10 cm，進樣時間10 s。在最佳實驗條件下氟西汀對映體分離的電泳譜圖如圖7所示,其中，T為電滲流標(biāo)記物硫脲的色譜峰,F1和F2為氟西汀對映體的2個色譜峰。在最佳電泳條件下氟西汀對映體在11 min內(nèi)實現(xiàn)了基線分離,分離度為2.33。

圖7　氟西汀的電泳圖

3結(jié)論

本文運用毛細(xì)管電泳法,以CM-β-CD和離子液體HOEtN1,1,1NTF2共同作為背景緩沖液添加劑,建立了氟西汀對映體手性拆分的毛細(xì)管電泳方法?？疾炝艘幌盗袑嶒瀰?shù)對分離結(jié)果的影響,獲得了氟西汀分離的最優(yōu)電泳條件,即BGE含15 mmol/L pH值為8.5 Na2HPO4-H3PO4、30 mmol/L HOEtN1,1,1NTF2和10 g/LCM-β-CD,分離電壓20 kV,檢測波長226 nm,高差10 cm，進樣時間10 s。

實驗結(jié)果表明，背景緩沖液中添加離子液體HOEtN1,1,1NTF2可以提高氟西汀對映體的分離度，此結(jié)果為進一步提高手性分子對映體的分離效果提供了一種新的思路。對于其定量分析，可采用左旋或右旋對照品的標(biāo)準(zhǔn)加入法進行測定,但由于目前無法購買到相應(yīng)的左右旋對照品,因此暫時無法進行該實驗,需條件成熟后進一步考察。

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(責(zé)任編輯閆杏麗)

Enantioseparation of fluoxetine by capillary electrophoresis

YANG Si-wen,DAI Yu-lin,DENG Ning,WANG Yan,HE Jian-bo,ZHU Yan-wu

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

Abstract:A new method for chiral separation of fluoxetine enantiomers was established by using trimethyl-hydroxyethyl bis(trifluoromethylsulfonyl)imide(HOEtN1,1,1NTF2)and carboxymethyl-β-cyclodextrin(CM-β-CD). The influence of the concentration of CM-β-CD,ionic liquid and buffer solution,buffer pH and separation voltage on chiral separation was investigated under the conditions of the detection wavelength of 226 nm and the sampling time of 10 s. On the basis of experiments,the optimal enantioseparation conditions were confirmed as follows:30 mmol/L HOEtN1,1,1NTF2 and 10 g/L CM-β-CD were added into the 15 mmol/L Na2HPO4-H3PO4 buffer solution as the pH value of the buffer solution was 8.5 and the applied voltage was 20 kV. Under the optimal enantioseparation conditions,the baseline separation was achieved for fluoxetine enantiomers within 11 min,attaining the resolution of 2.33. The method is simple and rapid with distinct separation effect,which is proved to be useful for enantioseparation of fluoxetine.

Key words:ionic liquid;carboxymethyl-β-cyclodextrin(CM-β-CD);capillary electrophoresis;enantiomer separation;fluoxetine

收稿日期：2015-02-11；修回日期：2015-05-06

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(21102030)

作者簡介：楊思文(1988-),女,安徽桐城人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生; 何建波(1965-),男,安徽太湖人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師.

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.06.024

中圖分類號:O657.8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1003-5060(2016)06-0837-05