肝細胞生長因子對光老化成纖維細胞凋亡及周期的影響

楊清建， 畢 波， 朱寧文， 陳 亮， 賈傳龍， 盧勇舟，

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實驗研究

肝細胞生長因子對光老化成纖維細胞凋亡及周期的影響

楊清建， 畢 波， 朱寧文， 陳 亮， 賈傳龍， 盧勇舟，

周軼群， 楊 平， 郭 妤， 朱晶晶， 劉天一

目的 探討肝細胞生長因子(HGF)對紫外線誘導皮膚成纖維細胞周期及凋亡的影響。方法 建立光老化模型，皮膚成纖維細胞(FBs)經(jīng)HGF處理后行倒置顯微鏡觀察、細胞計數(shù)并予以流式細胞周期檢測；以HGF預處理皮膚FBs 2 h，中波紫外線(UVB)照射誘導體外FBs細胞發(fā)生細胞損傷，Tunel染色試劑盒檢測細胞凋亡。結(jié)果 光老化模型建立后，UVB+HGF組細胞存活較UVB組增多(P<0.05)；HGF減少光老化成纖維細胞P53的表達，改善光老化FBs細胞周期分布；HGF能夠減少UVB導致的FBs凋亡(P<0.05)。結(jié)論HGF可調(diào)控光老化細胞周期分布及減少細胞凋亡，在光老化治療中具有潛在應用前景。

肝細胞生長因子； 光老化； 成纖維細胞； 細胞周期； 凋亡

皮膚光老化是指皮膚長期受到日光照射所引起的損害，表現(xiàn)為皮膚粗糙、增厚、松弛，呈深而粗的皺紋[1]，局部有過度的色素沉著或毛細血管擴張，甚至可能出現(xiàn)各種良惡性腫瘤[2-3]。紫外線作為日光中主要的高能射線，目前普遍認為是導致皮膚光老化的主要因素[4]。作為皮膚真皮層中含量最多的細胞成分，成纖維細胞在光老化中發(fā)生的一系列改變對光老化的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義[5-7]。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一種具有多種生物功能的細胞因子及重要的細胞生存調(diào)節(jié)因子[8-10]，也是潛在的細胞生存因子[10]和抗細胞凋亡因子[11]。近期的研究表明，HGF通過包括MAPK/ERK依賴的P13K磷酸化信號轉(zhuǎn)導途徑保護心肌細胞對抗凋亡[12]。自2015年6月，復旦大學附屬華東醫(yī)院整形外科對HGF在光老化過程中成纖維細胞(fibroblasts, FBs)損傷的抗細胞凋亡作用進行了探討。

1 材料與方法

1.1 小鼠皮膚FBs的獲取及培養(yǎng) 取1～3 d 無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級C57 BL/6小鼠，經(jīng)乙醚麻醉處死后，浸泡于75%乙醇中10 min，用DMEM洗去殘留乙醇，置于培養(yǎng)皿中，剪刀分離背部皮膚，剪下皮膚組織塊約1 cm×1 cm，立即置于2%中性蛋白酶中，37℃恒溫消化4 h；將皮膚取出，鑷子分離表皮和真皮，將真皮剪碎后置于0.1%膠原酶中，37℃恒溫搖床消化2 h，至組織塊基本消失。1500 r/min離心5 min，收集沉淀；棄上清，細胞以DMEM+10% FBS制成細胞懸液，吹打均勻后以約2×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37℃，5% CO2，100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)；接近80%融合時進行傳代，比例約為1∶4。

1.2 藥物處理及分組 選用P2代細胞，將細胞隨機分成4組：正常組、HGF組(HGF處理)、中波紫外線(ultraviolet radiation b, UVB)模型組(UVB照射)、UVB+HGF組(HGF處理+UVB照射)。方法：移去培養(yǎng)液，覆蓋薄層磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)，打開蓋子，置于UVB燈管(飛利浦 TL 20 W/01 RS)正下方，進行首次照射，照射劑量(使用Lutron UV light meter測量)為120 mJ/cm2。照射完畢后，吸去PBS，加入10.0 ml DMEM+1% FBS繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h照射1次，120 s/次，共4次；末次照射完成后改為DMEM+10%FBS培養(yǎng)。

1.3 倒置顯微鏡觀察光老化模型并進行細胞計數(shù)分析 末次照射4～6 h，分別將4組細胞置于倒置相差顯微鏡(日本尼康)下觀察細胞形態(tài)、細胞密度并攝影。然后分別將4組細胞用0.25%胰酶消化后，PBS洗滌1次，用細胞計數(shù)板計數(shù)。

1.4 碘化丙錠檢測細胞周期 末次照射12 h后，將培養(yǎng)液移去，PBS沖洗3次，胰酶消化成單細胞懸液， PBS洗滌2次，每次1000 r/min，離心5 min。盡可能完全去除上清，加入1 ml于-20℃ 70%乙醇中，邊振蕩邊加，使細胞分散，固定完全，4℃過夜或?qū)吮颈４嬗?20℃，直至DNA染色。染色后取出標本，于250 r/min離心5 min，盡可能完全去除上清，然后再用PBS洗滌1、2次，250 r/min離心5 min。加入1.0 ml DNA染液，充分振蕩，4℃避光孵育30 min。流式細胞儀檢測。DNA染色液(10.0 ml，新鮮配制)組成：Triton X-100 10 μl+1 mg/ml碘化丙碇(PI)200 μl+DNase-free Rnase 2 mg+PBS 9.79 ml。

1.5 Western blot檢測蛋白表達 細胞末次照射48 h后，移去培養(yǎng)液，預冷PBS洗滌3次，培養(yǎng)皿移至冰上，加入蛋白裂解液500 μl，用1.0 ml針頭反復吹打，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，冰上靜置15 min。12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清，用BCA法測定蛋白濃度；取各個處理組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度，與等體積2倍上樣緩沖液混合，煮沸并離心；電泳分離蛋白并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，孵育袋中加入TEST稀釋的P53 (abcam 1∶500) 和 GAPDH (boster 1∶2000 )，4℃孵育過夜；采用辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(Jack-son 1∶2000)室溫孵育2 h，用ECL化學發(fā)光法顯影和定影。

1.6 Tunel染色 選用P2代細胞，采用HGF濃度5 ng/ml的DMEM+10% FBS處理2 h。照射處理后約1 h，4組細胞用PBS洗滌1次，用4%多聚甲醛固定細胞30～60 min，PBS洗滌1次，加入含0.1%Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min；配制TUNEL檢測液(一步Tunel染色試劑盒，南京碧云天公司)每個樣本含TdT酶2 μl、熒光標記液48 μl；在樣品上加50 μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次；用抗熒光淬滅封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察。Cy3的激發(fā)波長為550 nm,發(fā)射波長為570 nm(紅色熒光)。于高倍熒光顯微鏡下每組隨機選取視野，計數(shù)細胞總數(shù)(每組不少于200個)。

2 結(jié)果

2.1 HGF可增加光老化FBs的存活數(shù)目 經(jīng)過4次亞致死劑量UVB輻照后[13]，UVB模型組細胞數(shù)目明顯較正常組、HGF組細胞數(shù)目少；而UVB+HGF組的細胞數(shù)目明顯較UVB組多；HGF對未經(jīng)UVB輻照的細胞組，即HGF組的細胞數(shù)目無明顯影響(圖1)。經(jīng)統(tǒng)計學分析，4組細胞中UVB模型組細胞數(shù)目較正常組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；經(jīng)HGF預處理后的FBs即UVB+HGF組較UVB模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；正常組與HGF組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1HGF對光老華成纖維細胞存活率的影響a. 正常組b.NOR+HGF組c.UVB模型組d.UVB+HGF組

Fig 1 The effect of HGF on photoaging fibroblasts survival. a. Normal group. b. NOR+HGF group. c. UVB model group.

d. UVB+HGF group.

2.2HGF改善光老化FBs細胞周期分布及HGF減少光老化細胞P53的表達 通過對細胞周期的分析，我們發(fā)現(xiàn)UVB可造成FBs細胞周期阻滯，所示照射組的G0/G1分布下降(從78.4%±2.21%降至44.3%±1.80%)，而S期及G2/M期則有所增加(分別從9.18%±1.55%到33.7%±0.70%及從12.4%±1.25%到21.9%±1.10%)；HGF可部分逆轉(zhuǎn)這一改變。我們通過進一步WesternBlot檢測細胞周期蛋白P53的含量，發(fā)現(xiàn)HGF能夠減少UVB模型組P53細胞周期蛋白的表達(圖2)。我們推測，HGF能夠減少UVB照射后P53的表達，促使部分細胞重新進入細胞周期，從而部分緩解細胞周期阻滯。

圖2Westernblot檢測p53蛋白結(jié)果

Fig 2 Western blot detection results of p53 protein.

2.3 HGF減少UVB導致的FBs凋亡 大量的DNA雙鏈斷裂被認為是凋亡中最顯著的特征。TUNEL法是識別DNA缺口處3′-OH 末端,由于DNA雙鏈斷裂發(fā)生在凋亡早期，故TUNEL可檢測出早期凋亡細胞。經(jīng)過Tunel染色后發(fā)現(xiàn)正常組及HGF組細胞僅極個別細胞能被熒光素標記，即發(fā)生早期凋亡；而經(jīng)過UVB輻照后的FBs早期凋亡細胞數(shù)目顯著增加，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);但經(jīng)HGF預處理后的FBs發(fā)生早期凋亡的細胞數(shù)目較UVB模型組明顯減少，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

皮膚成纖維細胞DNA在受到紫外線輻射后，造成DNA鏈上相鄰的2個嘧啶堿基發(fā)生共價結(jié)合，生成嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimers, CPDs)。當細胞中DNA損傷積累到一定量時，細胞就會進入細胞周期阻滯或凋亡[14]。陽光中紫外線含量最多的是UVA(約占陽光的5.6%)，遠超過UVB的含量(約占陽光中的0.15%)[13]，但UVB的生物學作用卻是遠超UVA。有研究認為，UVB是造成光老化過程中DNA損傷的重要原因[3]。UVB被細胞的DNA吸收，可引起堿基對突變，產(chǎn)生CPDs和6-4光產(chǎn)物等物質(zhì)。DNA的損傷會導致P53的激活，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等，同時p53的半衰期延長，在細胞內(nèi)的濃度升高，激活的p53蛋白可結(jié)合到特定的靶基因序列，增加其轉(zhuǎn)錄，進而細胞有絲分裂受阻，導致細胞周期阻滯(L Rittié, 2002年)。

細胞凋亡包含了內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)和外源性途徑(受體介導的細胞死亡途徑)。當不同的信號進入細胞，細胞必須對多種信號進行平衡調(diào)節(jié)，最終作出一種適當?shù)姆磻?，如增殖、分化、生存或凋亡等。凋亡過程中，所有的信號分子連接成一個信號協(xié)同網(wǎng)絡(luò)，當細胞對多種細胞毒性刺激產(chǎn)生反應時，大量的凋亡前和抗凋亡因子啟動。若DNA嚴重損傷出現(xiàn)后，細胞超出了它的修復能力，細胞即出現(xiàn)凋亡[15]。大量的DNA雙鏈斷裂被認為是凋亡中最顯著的特征(M Mildner, 2002年)。TUNEL技術(shù)實際上是分子生物學和形態(tài)學相結(jié)合的研究方法，細胞凋亡的一個標志是核酸內(nèi)切酶首先切割染色體DNA，DNA雙鏈斷裂或單鏈出現(xiàn)缺口產(chǎn)生3′-OH末端，形成180～200 bp核小體DNA多聚體。TUNEL技術(shù)的原理即在脫氧核糖核苷酸酶(TdT)的作用下, 將熒光素標記的脫氧核糖核苷酸標記到3′-OH上，從而檢測到早期的細胞凋亡。與文獻報道一致，HGF不僅能夠減少心肌[16]、肝細胞[17]等細胞的凋亡，同樣能夠減少UVB輻照導致的皮膚FBs的凋亡。

大量針對細胞周期改變及凋亡的研究證實，紫外線輻照能夠激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子通路(M Yaar, 2007年)，誘導促炎細胞因子如IL-1、IL-6、血管內(nèi)皮生長因子VEGF和TNF-β表達，參與免疫調(diào)節(jié)和細胞周期。這其中的NF-κB通常被看做是生存因子[15]，在細胞阻滯和凋亡過程中也起到重要作用。NF-κB)通過與其他核因子結(jié)合而發(fā)揮功能。其中NF-κB調(diào)節(jié)Noxa表達在P53介導的細胞凋亡中是關(guān)鍵分子。此外，NF-κB復合物在與p53、BCL-3作用過程中，轉(zhuǎn)變并形成NF-κB-HDAC1復合物。這種復合物會抑制細胞周期素D1的表達，導致細胞周期阻滯和細胞凋亡[18]。

研究表明，HGF是一個具有促細胞存活的細胞因子，它可以減少多種細胞類型的凋亡。但HGF抗凋亡信號在細胞經(jīng)何種途徑傳導還不十分清楚。有研究指出，抗凋亡信號是通過激活PI3K 和MAPK進行傳導。我們通過本實驗發(fā)現(xiàn)，HGF可降低UVB誘導的光老化FBs細胞周期蛋白P53的表達，使光老化細胞的細胞周期發(fā)生改變，部分改善細胞周期阻滯，減少光老化細胞的凋亡。HGF這種對光老化細胞凋亡的明顯抑制作用，具有潛在的延緩皮膚FBs光老化進程作用，為皮膚光老化的治療提出了一種新的可能。然而，由于體內(nèi)外的環(huán)境大相徑庭，加之動物與人類之間的種族差異因素等，故本研究僅為臨床治療提供初步的思路。

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Effect of hepatocyte growth factor on apoptosis and cell cycle of skin fibroblasts induced by UV

YANGQing-jian,BIBo,ZHUNing-wen,CHENLiang,JIAChuan-long,LUYong-zhou,ZHOUYi-qun,YANGPing,GUOYu,ZHUJing-jing,LIUTian-yi.

(DepartmentofPlasticSurgery,HuadongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China)

LIUTian-yi,Email:tianyiliucn@163.com

Objective To investigate the influence of HGF on cell cycle and apoptosis in photoaging skin fibroblasts induced by UV. Methods A photoaging model was established, skin FBs were treated by HGF under inverted microscope, cell count and flow cytometry were detected. HGF pretreatment skin FBs for 2 hours, FBs in cells in vitro induced by UVB irradiation injury, Apoptosis was detected by Tunel staining kits. Results After photoaging model establishment, the UVB+HGF group had more surviving cells than that in the UVB group (P<0.05);HGFreducestheexpressionofP53inphotoagingfibroblasts,andimprovesthedistributionofphotoagingFBscellcycle.HGFcanalsodecreaseFBsapoptosiscausedbyUVBexposure(P<0.05). Conclusion HGF can regulate photoaging FBs cell cycle distribution and reduce cell apoptosis, which has a potential application prospect in photoaging treatment.

Hepatocyte growth factor; Photoaging; Fibroblast; Cell cycle; Apoptosis

國家自然科學基金(81272125，81301642)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學科帶頭人培養(yǎng)計劃(XBR2011033)；863項目(SS2014AA020705) 作者單位：200040 上海，復旦大學附屬華東醫(yī)院 整形外科(楊清建,畢 波,陳 亮,賈傳龍,盧勇舟,周軼群,楊 平,郭 妤,朱晶晶,劉天一)；復旦大學附屬華山醫(yī)院 皮膚科(朱寧文) 第一作者：楊清建(1987-)，男，山東曹縣人，碩士研究生. 通信作者：劉天一，200040，復旦大學附屬華東醫(yī)院 整形外科，電子信箱：tianyiliucn@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.12.012

R

A

1673-7040(2016)12-0740-04

2016-06-07)