馬鈴薯品種和組織對基因組測序深度分布模式的影響

張國棟，劉柏林,，李修寶，司懷軍，李修慶

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州　730070；2.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州　730070；3.加拿大農業(yè)部馬鈴薯研究中心，F(xiàn)redericton，New Brunswick，Canada E3B 4Z7；4.日照市農業(yè)科學院，山東 日照　276500)

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馬鈴薯品種和組織對基因組測序深度分布模式的影響

張國棟1,2，劉柏林1,2,3，李修寶4，司懷軍1,2，李修慶3

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070；3.加拿大農業(yè)部馬鈴薯研究中心，F(xiàn)redericton，New Brunswick，Canada E3B 4Z7；4.日照市農業(yè)科學院，山東 日照276500)

摘要：【目的】 探討品種和組織對馬鈴薯基因組測序深度分布的影響.【方法】 對‘布爾班克’和‘云薯107’2個品種的薯塊芽端和莖端進行了深測序，建立了在參照基因組上的測序深度分布圖.【結果】 發(fā)現(xiàn)這些分布在品種間有明顯差別(例如在三號染色體中部和尾部)，在同一品種的DNA樣本間很類似，但芽端和莖端在二號染色體有明顯差別.這些結果說明測序深度的分布主要受品種基因組本身所影響，也受薯塊上部位影響，而且在很大程度上可以重復.【結論】 這些結果能幫助設計試驗和合適利用測序深度.

關鍵詞：馬鈴薯；DNA測序；小序列片段；參考基因組；覆蓋程度；品種差別；組織特異性

Illumina測序技術是目前基因組深測序的主要技術或主要技術之一.Illumina讀序段(reads，小片段、短序列)在參照基因組(reference genome)上的覆蓋深度(測序深度)是研究染色體非整倍體、基因表達活性和基因拷貝數(shù)變化的重要手段[1-3].但是，Illumina引物在測序時有很大的偏差，不完全隨機，建立DNA文庫時，最早擴增的片段有更大機會被繼續(xù)擴增，因而造成在測序覆蓋深度在染色體上不同區(qū)間有很大變化[4].即便是酵母菌的一個僅僅1 kb的基因表達區(qū)片段在測序時便出現(xiàn)了約15個覆蓋很多和一個幾乎沒有覆蓋的區(qū)間[4].這種覆蓋度偏差也受建DNA文庫前的DNA碎片化處理技術有關，例如用超聲波破碎DNA成小片段時并不是隨機的，而是有的部位容易斷裂有的部位很難斷裂，所以文庫變身就不是完全隨機的[5].DNA聚合酶對引物也有選擇性[6].另外我們認為引物的不隨機性可能也和DNA文庫克隆的小片段的空間結構、退火時復性速度等有關.這個第2代測序中出現(xiàn)的覆蓋度不均勻問題除了上述引物和DNA制片段技術方面影響，肯定還有一些未知的影響因素.基因表達等研究的前提往往把組織間的差別看成基因表達的差別，所以并不能發(fā)現(xiàn)組織本身，例如馬鈴薯塊莖的芽端和莖端，對Illumina 測序時覆蓋度分布有何影響.

栽培的馬鈴薯主要是四倍體，而且容易有體細胞變異，例如世界上100年來栽培面積最大的馬鈴薯品種‘Russet Burbank(布爾班克)’便是一個由體細胞突變產(chǎn)生的品種[7].這個品種而且還在變異中，例如數(shù)十年前報道布爾班克染色體倍數(shù)在不同的細胞層中不同，所以是嵌合體，但現(xiàn)在栽培的已經(jīng)不是嵌合體了[8].從‘布爾班克’塊莖再生的植株有很多形態(tài)、生長和加工品質方面的變化[9].由于多倍性和體細胞變異，馬鈴薯品種的基因組深測序時，覆蓋度樣式可能比較復雜.

馬鈴薯是國際上最重要的蔬菜和糧食兼用性作物，是甘肅、內蒙、黑龍江和山東等多個省份的主要作物.除了國際上最重要的馬鈴薯品種‘布爾班可’外，‘云薯107’是在甘肅產(chǎn)量表現(xiàn)最好的品種之一[10].本研究擬對這2個重要品種用Illumina系統(tǒng)進行深測序，分析了在馬鈴薯參照基因組染色體[11]上的覆蓋度分布，鑒定分布模式和發(fā)現(xiàn)了影響覆蓋度的一些因素，以期為以后如何設計和分析覆蓋度有關的試驗提供了有用的信息.

1材料與方法

1.1植物品種和取材

試驗用2個馬鈴薯 (Solanumtuberosum)品種為‘布爾班克(Russet Burbank)’和‘云薯107’.‘布爾班克’在甘肅省和山東省都比較晚熟，為了分析成熟期的已經(jīng)適宜加工薯條的薯塊以及為了驗證不同實驗室的結果是否有共性，DNA測序用的‘布爾班克’薯塊取材于加拿大9月下旬已經(jīng)基本成熟植株的薯塊(取材于加拿大New Brunswick省的加拿大農業(yè)部馬鈴薯研究中心實驗農場的收獲前葉片還比較綠的植株).‘云薯107’是2013年9月下旬取自在甘肅省蘭州甘肅農業(yè)大學試驗田的仍然比較綠的植株.用的是收獲時標準大小的薯塊.馬鈴薯田間取樣后馬上從薯塊的芽端和莖端分別提取DNA.‘布爾班克’薯塊端部是從最外端算起約1 cm切塊；‘云薯107’是從約1 cm深度的切塊上取約1 cm3的端部組織.

1.2DNA的提取、文庫構建和測序

‘布爾班克’的DNA用QIAGEN試劑盒提取(DNeasy Plant Maxi Kit，QIAGEN，Hilden，Germany).‘云薯107’的DNA用CTAB法提取.DNS質量除了用光密度法之外還用用瓊脂糖電泳(凝膠濃度1%，電壓3～4 V/cm，時間40 min).文庫構建是用New England Biolabs (NEB)建庫試劑盒(貨號為E6000L).測序用Illumina HiSeqTM2500系統(tǒng).

1.3DNA測序和生物信息學分析

本試驗的Illumina 測序和圖譜定位委托北京百邁客生物科技有限公司(北京順義，http://www.biomarker.com.cn).與參考基因組比對用bwa (http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml).在使用bwa 軟件時，首先建立Index 文件，然后尋找SA coordinates，最后將尋找到的SA coordinates 轉換成SAM(Sequence Alignment/Map)和BAM 格式的文件.bwa 參數(shù)(比對時最多允許的堿基錯配數(shù)目)：序列長度大于60 bp 時，設為3，否則設為2.比對時，允許gap(空位匹配)數(shù)設為0，即不允許空位匹配.輸出文件包括最大插入片段長度，在插入片段大小無法準確推斷的情況時，默認值為500.在BWA和Samtools 分析時用“F 4 q 1”過濾后的高質量的基本上是唯一的最好定位質量的reads，叫做unique reads(“唯一”讀序段).本文的主要根據(jù)這類過濾過后的唯一讀序段分析.

2結果與分析

2.1插入片段大小、測序量和在參照基因組上的覆蓋深度

每個DNA文庫中插入片段大小都基本在300個堿基左右.‘布爾班克’芽端的稍微小一些，大約平均290個堿基(圖1).每個DNA樣本測序量是最少的有五千萬個(‘布爾班克’芽端)，最多的是六千七百萬個(‘云薯107’芽端)，平均為五千七百萬個(表1).對每個DNA樣本分別計算在參照基因組上的平均覆蓋度、在圖譜上定位的讀序段數(shù)在參照基因組上的覆蓋深度， 在‘布爾班克’中是7倍， ‘云薯107’中 是12倍，2個品種的平均是10倍，總覆蓋深度是19倍(表1).

A：‘布爾班克’芽端；B：‘布爾班克’莖端；C：‘云薯107’芽端；D：‘云薯107’莖端.圖1　從讀序段計算的DNA插入片段長度Fig.1　Insert size histogram for all reads

樣品總讀序段個數(shù)定位的讀序段個數(shù)/%基因組覆蓋深度定位/總數(shù)/%‘布爾班克’芽端5050304470.20382.9‘布爾班克’莖端5018889476.53482.0‘布爾班克’總量100691938147.00782.5‘云薯107’芽端6738287280.67694.5‘云薯107’莖端6076562080.88693.3‘云薯107’總量128148492162.001293.92個品種總量228840430308.001988.2

2.2在參照基因組上的覆蓋深度分布模式

用“F4q1”過濾后的“唯一”讀序段在參照基因組上定位.在參照基因組圖譜上的覆蓋深度有許多深度特別大的峰值區(qū)(圖2).這和預期的一樣，因為Illumina測序時不是完全隨機的.很顯然，和預期一樣有些區(qū)域容易測序有些區(qū)域難一些.

2.3在參照基因組零號染色體上的覆蓋深度分布樣式

本研究選取數(shù)條染色體做覆蓋度的進一步描述.馬鈴薯參照基因組在組裝時尚未定位的連接片段放在一起組成了一個組(unlocalized scaffolds)，簡稱為零號染色體(chromosome 0)[11-12].本研究選取這個零號進行討論是因為它可能富含重復序列.布爾班克和云薯107 DNA讀序段在零號染色體上的分布有很大的共性，例如，都是染色體下游區(qū)覆蓋度平均比較高(圖3右側橫線標記區(qū))，而且在上游區(qū)有共同的一個覆蓋度很高的峰值(圖3右側橫線下區(qū)域).這2個DNA樣本都有的特色說明覆蓋度受馬鈴薯基因組本身特點的影響.在零號染色體上，有一個很明顯的高覆蓋峰(圖3星號標記的峰)只存在于布爾班克芽端和莖端，不存在于‘云薯107’的DNA中.這個高峰在2個‘布爾班克’DNA樣本中都存在，說明不是PCR引物隨機配對早造成的，而的確是‘布爾班克’品種的DNA特色.這個峰值不在‘云薯107’中，說明這個峰值是有品種特異性.

DNA：‘云薯107’芽端.數(shù)據(jù)是根據(jù)samtools view-F4q1過濾后獲取的唯一最好讀序段.圖2　參照基因組圖譜上的覆蓋深度分布Fig.2　Coverage depth on the potato reference genome

2.4在參照基因組二號染色體上的覆蓋深度分布樣式

在二號染色體上，至少有2個各個DNA樣本都有的特點：在染色體的上游區(qū)(左側)和在染色體的尾部(右側)都有一個覆蓋度很深的峰(圖4箭頭所指的峰).這進一步說明了這是在此染色體上有這2個品種都有的特點.值得注意的是有一個很高的峰值區(qū)只存在于芽端(‘布爾班克’芽端和‘云薯107’芽端)，而不存在于這2個品種的莖端(圖4).這說明馬鈴薯薯塊不同位置的DNA可能有不同的特點.

A：‘布爾班克’芽端；B：‘布爾班克’莖端；C：‘云薯107’芽端；D：‘云薯107’莖端.圖3　‘布爾班克’和‘云薯107’DNA讀序段在零號染色體上的分布Fig.3　Coverage depth on chromosome 0 of‘Russet Burbank’ and ‘Yun shu 107’

A：‘布爾班克’芽端；B：‘布爾班克’莖端；C：‘云薯107’芽端；D：‘云薯107’莖端.圖4　‘布爾班克’和‘云薯107’ DNA讀序段在第二號染色體上的分布Fig.4　Coverage depth on chromosome 2 of‘Russet Burbank’ and ‘Yun shu 107’

在第三號染色體上，‘布爾班克’的芽端和莖端的DNA都有一個高密度，即高覆蓋度區(qū)(圖5-A和圖5-B中的星號區(qū)).這個峰區(qū)盡管在‘云薯107’芽端DNA的序列覆蓋圖中好像也有一些，但總的說來在‘云薯107’中不明顯(圖5).在五號染色體的最下游(圖5)，‘布爾班克’的2個DNA樣本都有一個覆蓋度高的峰但在‘云薯107’中沒有這個峰值(圖5箭頭所指的區(qū)域).

A：‘布爾班克’芽端；B：‘布爾班克’莖端；：‘云薯107’芽端；D：‘云薯107’莖端.圖5　布爾班克和云薯107 DNA讀序段在第3號染色體上的分布Fig.5　Coverage depth on chromosome 3 of‘Russet Burbank’ and ‘Yun shu 107’

3討論

在圖2 中葉綠體和線粒體DNA的覆蓋度比較低，可能是因為讀序段進行了samtools view-F4q1過濾后處理，在重復的拷貝中只選了一個拷貝，這可能使在總基因組上平均覆蓋度變低了.葉綠體和線粒體DNA含量在不同品種和組織間差別很大和受環(huán)境影響很大[13].有些技術可以將細胞核、葉綠體和線粒體分開提取進行研究[14]，所以本文不對葉綠體和線粒體基因組做品種間和組織間覆蓋度分布重復性方面的比較.

現(xiàn)在已知植物生長發(fā)育過程中有些DNA，尤其是重復序列，有變化[15-16]，所以對于芽端和莖端DNA在測序覆蓋度分布的模式方面的差別，目前不能排除的確是由于DNA序列的差異造成.需要對芽端莖端差別區(qū)，例如二號染色體的近尾部的高覆蓋區(qū)，進一步研究序列特點及是否在薯塊生長過程中有變化.

有多種技術，例如DNA原位分子雜交[17]和實時定量DNA聚合酶反應(qPCR)等[18]、可以研究DNA序列拷貝數(shù)染色體區(qū)段變異和基因表達活性.用二代測序技術的測序覆蓋深度、重復倍數(shù)或基因表達活性能夠在同一次試驗便對整個基因組不同區(qū)段一起比較分析，所以可比性很強，這是二代深測序法的巨大優(yōu)點.原位雜交和qPCR是用于一個DNA片段或基因的研究.所以這些技術可以互相補充.進一步研究本文中提到的高覆蓋度峰值區(qū)時，qPCR可能幫助驗證品種或組織間的差別.

基于2個品種和2個薯塊部位的深測序，本研究的結果不但支持了已知的測序不完全隨機性[4]，而且同時發(fā)現(xiàn)了染色體部位效應，并發(fā)現(xiàn)了品種效應和薯塊部位效應.盡管測序獲得的覆蓋度差異不排除有一些屬于試驗假象，但很大程度上是可以重復的品種間的差異，有些是組織間的差異.這種覆蓋度的不同并不是單純多測幾個DNA樣本便可避免，所以要慎重下關于拷貝數(shù)或基因活性高低的結論，需要和別的技術的數(shù)據(jù)統(tǒng)一分析.

致謝： 衷心感謝北京百邁客生物科技有限公司幫助測序和定位，加拿大農業(yè)部Muhammad Haroon先生協(xié)助馬鈴薯DNA提取.

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(責任編輯李辛)

Effects of potato cultivars and tuber sections on the sequencing depth pattern in genome

ZHANG Guo-dong1,2，LIU Bai-lin1,2,3，LI Xiu-bao4，SI Huai-jun1,2，LI Xiu-qing3

(1.Gansu Provincial Key Laboratory of Arid-land Crop Science,Gansu Key Laboratory of Crop Genetic and Germplasm Enhancement,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;3.Potato Research Centre,Agriculture and Agri-Food Canada,Fredericton,New Brunswick,Canada E3B 4Z7;4.Rizhao Academy of Agricultural Sciences,Rizhao 276500,China)

Abstract：【Objective】 The paper aims to explore the effects of potato cultivars and tuber section on the Illumina sequencing depth pattern in genome.【Method】 Deep sequencing was performed on tuber bud and stem end of two potato cultivars including ‘Russet Burbank’ and ‘Yunshu 107’,establishing distribution map based on sequencing in genome.【Result】 The sequencing depth distribution differed significantly between the two cultivars such as in the middle and end of reference chromosome 3,was highly similar among DNA samples within the same cultivars,but clearly different in reference chromosome 2.These results indicated that sequencing depth distribution was mainly impacted by genotypes,also by tuber position and could be repeated to a large extent.【Conclusion】 These findings may help to the design and data interpretation in biological research using the second generation sequencing approach.

Key words：potato;second generation DNA sequencing;small sequence fragments;reference genome;coverage depth;cultivars difference;tissue-specific variation

通信作者：司懷軍，男，教授，博士生導師，主要從事馬鈴薯生物技術研究.E-mail:hjsi@gsau.edu.cn；

基金項目：國家自然科學基金項目(31160298)；甘肅省杰出青年基金項目(1308RJDA011)；加拿大紐省農業(yè)部農業(yè)創(chuàng)新項目(EARI12-028)．

收稿日期：2015-04-15；修回日期：2015-05-05

中圖分類號：S 532

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)03-0043-06

第一作者：張國棟(1986-)，男，碩士研究生，研究方向為馬鈴薯生物技術.E-mail:Zhangguodong2012@sina.cn

李修慶，男，研究員，主要研究馬鈴薯遺傳改良和產(chǎn)品加工的生物學基礎和技術、植物葉綠體DNA和線粒體DNA、mRNA的成熟和體細胞基因組變異規(guī)律.E-mail:Xiu-Qing.Li@agr.gc.ca