鴨I－FABP基因的克隆、組織表達(dá)模式及功能研究

陳 芳，張 昊，盧立志

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鴨I－FABP基因的克隆、組織表達(dá)模式及功能研究

陳 芳1，2，3*，張 昊1，2，3，盧立志3

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢430064；2.動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430064；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021）

摘 要：本研究旨在探討鴨I－FABP基因的結(jié)構(gòu)與功能。本試驗(yàn)以紹興麻鴨為研究材料，運(yùn)用RACE、RT－PCR方法擴(kuò)增鴨I－FABP基因mRNA全序列，運(yùn)用qRT－PCR方法檢測該基因在小腸不同區(qū)段的表達(dá)特性，運(yùn)用siRNA干擾、qRT－PCR分析其功能。結(jié)果表明，鴨I－FABP基因共編碼132個(gè)氨基酸，在不同物種間保守性較高，且在第60位氨基酸處發(fā)現(xiàn)一個(gè)Ile/Thr的突變位點(diǎn)；I－FABP在空腸前半段和十二指腸中表達(dá)量較高，與微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（Microsomal triglyceride transferprotein，MTTP）和載脂蛋白B（Apolipoprotein B，ApoB）基因在小腸不同腸段具有相似的表達(dá)變化情況，而與肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白基因（Liver fatty acid binding protein，L－FABP）存在差異；干擾I－FABP基因表達(dá)后，MTTP和ApoB基因的表達(dá)量顯著降低，而L－FABP未發(fā)生顯著變化。該結(jié)果預(yù)示了I－FABP基因在鴨的小腸脂肪酸吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)通路中的重要作用，也為該基因的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴨；I－FABP；小腸；脂肪酸

由于家禽現(xiàn)代育種工作對生長速度的過度追求，造成家禽體脂過度沉積。這不僅影響畜禽產(chǎn)品品質(zhì)，還造成飼料資源的浪費(fèi)。人體食入過量的脂肪易導(dǎo)致肥胖，糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等發(fā)病率的提高對健康造成損害。隨著生活水平的不斷提高，人們對畜禽產(chǎn)品品質(zhì)的要求越來越高。因此，減少畜禽體脂沉積、增加肌間脂肪含量已成為畜禽工作者的重要研究目標(biāo)。從分子機(jī)理上研究鴨脂類代謝過程可以為其育種和營養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù)。

小腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（Intestinal fatty acid binding protein，I－FABP），又稱FABP2，是特異性的在小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)的脂肪酸結(jié)合蛋白家族成員，可與長鏈不飽和脂肪酸結(jié)合，攜帶其穿過細(xì)胞膜并運(yùn)送到脂肪酸組裝為乳糜微粒的位置——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［1］。I－FABP是機(jī)體脂肪代謝過程中重要的調(diào)控因子之一，亦可作為小腸成熟度和損傷的標(biāo)記［2］。I－FABP基因多態(tài)性與人類高脂血癥、Ⅱ型糖尿病以及肥胖等代謝疾病有關(guān)［3－5］。I－FABP在控制肉雞腹脂重這一性狀中起重要作用［6］，且在該基因發(fā)現(xiàn)多處多態(tài)位點(diǎn)與生長和屠體性狀顯著相關(guān)［7］，但關(guān)于鴨I－FABP的研究較少。

本試驗(yàn)通過克隆鴨I－FABP基因全序列，分析該基因在不同腸段的表達(dá)以及該基因?qū)χ舅嵛绽猛分嘘P(guān)鍵基因的影響，研究I－FABP在小腸脂肪酸吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，旨在為鴨育種和營養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取4只初生重相近的1日齡紹興鴨，屠宰后將小腸按長度等分為12段，樣品采集后于液氮中過夜，之后保存于－70℃；提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后用于不同腸段基因表達(dá)譜分析。另采集26只1日齡紹興鴨十二指腸樣本（共計(jì)30只），進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)驗(yàn)證分析。細(xì)胞培養(yǎng)選用孵化至25d左右的紹興鴨鴨胚。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的雞IFABP序列擴(kuò)增出鴨部分序列后，設(shè)計(jì)RACE引物。根據(jù)基因序列跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)定量引物。RACE和定量引物由上海英駿公司合成。干擾RNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。本試驗(yàn)所用到引物序列見表1。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 The sequence of primers

1.2.2 RACE反應(yīng)擴(kuò)增I－FABP序列 RACE試劑盒選用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒（TaKaRa，大連），根據(jù)其說明書進(jìn)行RNA樣品反轉(zhuǎn)錄及5′－RACE和3′－RACE反應(yīng)。擴(kuò)增出的片段回收純化后克隆測序。根據(jù)所獲得的序列拼接并與NCBI網(wǎng)站上其他物種該序列信息比對確認(rèn)后獲得鴨I－FABP基因cDNA全序列?；蚨鄳B(tài)位點(diǎn)確認(rèn)采取擴(kuò)增DNA片段后直接測序的方法完成。

1.2.3 基因表達(dá)分析 組織和細(xì)胞總RNA提取采用Trizol法，按照Trizol試劑盒（TaKaRa，Japan）說明書進(jìn)行；cDNA第一鏈合成采用M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa，Japan）合成，按照說明書進(jìn)行；基于qRT－PCR的基因表達(dá)分析由ABI 7300（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）完成，以鴨β－actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，Japan）進(jìn)行。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，cDNA 2μL，上下游引物各0.4μL，ROX reference dye 0.4μL，滅菌超純水補(bǔ)至20μL。qRT－PCR反應(yīng)程序：94℃3min；94℃10s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)后采集熒光生成擴(kuò)增曲線。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，每次測定設(shè)空白對照。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與干擾 選用孵化至25d左右的鴨胚，對鴨蛋表面進(jìn)行酒精消毒后，打開鴨蛋取出鴨胚放入培養(yǎng)皿。取出鴨胚空腸前1/2段放入常溫PBS中。去除腸系膜，注射器多次沖洗腸段后打開腸段并盡量剪碎，清洗干凈后加入10～20倍體積的1g·L－1膠原酶Ⅰ，37℃水浴鍋搖晃消化30min后收集細(xì)胞，清洗離心后加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，24h換液一次。細(xì)胞匯合至80%左右時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞干擾試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine2000，操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。干擾4h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后收集細(xì)胞，提取RNA。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對分析；采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)；各基因相對表達(dá)量用2－ΔCt方法計(jì)算，以β－actin作為內(nèi)參基因，重復(fù)次數(shù)為3次，ΔCt＝Cttarget gene－Ctβ－actin。

2 結(jié) 果

2.1 鴨I－FABP序列分析

本試驗(yàn)以紹興鴨肝為材料，分別通過5′－RACE 和3′－RACE擴(kuò)增獲得I－FABP基因片段387和418bp，如圖1所示。將擴(kuò)增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對并拼接后，獲得鴨I－FABP基因cDNA序列共648bp，NCBI序列號：JN＿202313。

I－FABP基因cDNA序列包括33bp的5′非編碼區(qū)和216bp的3′非編碼區(qū)。其中3′非編碼區(qū)包含27bp的Ploy－A結(jié)構(gòu)。CDS區(qū)編碼132個(gè)氨基酸。不同物種間氨基酸序列比對如圖2所示。該氨基酸序列在不同物種間較保守，與鴿子同源性高達(dá)90.15%，與雞同源性為88.64%。

本試驗(yàn)在克隆該基因序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)T/C的多態(tài)位點(diǎn)，如圖3A所示。本試驗(yàn)在30只鴨樣品中驗(yàn)證該多態(tài)位點(diǎn)，其中TT基因型的個(gè)體數(shù)為17，CT基因型的個(gè)體數(shù)為13，未檢測到CC基因型。該位點(diǎn)可導(dǎo)致預(yù)測氨基酸序列的第60位氨基酸由Ile轉(zhuǎn)變?yōu)門hr，該突變位點(diǎn)位于I－FABP蛋白二級結(jié)構(gòu)的βD折疊處，如圖3B所示。

圖1 鴨I－FABP基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis patterns of duck IFABPgene PCR products

2.2 鴨I－FABP基因在小腸不同區(qū)段的表達(dá)

本試驗(yàn)對鴨小腸不同腸段I－FABP基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，鴨I－FABP基因在空腸上半段表達(dá)量最高，其次為十二指腸，在空腸末段和回腸段表達(dá)量較低。

2.3 鴨小腸不同腸段中脂肪酸吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)

本試驗(yàn)分析了與脂肪酸結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的LFABP、MTTP和Apob基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示。從總體水平上可以看出，L－FABP在小腸中的表達(dá)豐度遠(yuǎn)低于I－FABP。MTTP和Apob基因在小腸不同腸段的表達(dá)趨勢一致：在空腸中段表達(dá)量最高，其次為空腸前段和十二指腸，在空腸末端和回腸中表達(dá)量較低。

圖2 多物種I－FABP基因氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of I－FABPgene among different species

圖3 鴨I－FABP基因多態(tài)位點(diǎn)Fig.3 SNP of duck I－FABPgene

2.4 干擾鴨I－FABP基因表達(dá)后對小腸其他脂肪酸吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響

為研究I－FABP基因?qū)ζ渌舅嵛张c轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響，本試驗(yàn)采用合成si－IFABP RNA干擾鴨小腸原代上皮細(xì)胞I－FABP基因表達(dá)后，檢測其他基因mRNA表達(dá)變化情況。從圖6可以看出，干擾組I－FABP表達(dá)量下降為對照組表達(dá)量的42.89%。干擾I－FABP基因表達(dá)后，MTTP表達(dá)量降低至對照組的61.92%，ApoB表達(dá)量降低至對照組的44.68%，均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），而L－FABP表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化。

圖4 I－FABP基因在鴨小腸不同腸段表達(dá)Fig.4 Relative abundance of duck I－FABP mRNA in different intestine segments

3 討 論

脂肪酸在維持機(jī)體正常生命過程中起重要作用。食物中的甘油三酯在體內(nèi)消化分解成脂肪酸和甘油后經(jīng)小腸吸收才能被機(jī)體利用。小腸對脂肪酸的吸收主要通過兩種方式：一種是通過磷脂雙分子層的簡單擴(kuò)散，另一種是蛋白參與的轉(zhuǎn)運(yùn)，而后者在調(diào)節(jié)脂質(zhì)吸收過程中起重要作用［8］。小腸上皮細(xì)胞中參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白主要有FABPs、NPC1L1、CD36、SR－BI等，而FABPs在這一過程中起極其重要的作用。在小腸中表達(dá)的FABP家族成員主要有I－FABP、L－FABP和回腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（Ileal lipid binding protein，ILBP），其中I－FABP和L－FABP主要參與長鏈脂肪酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，ILBP主要參與回腸中膽汁酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)［1］。

I－FABP為小腸特異性表達(dá)的脂肪酸結(jié)合蛋白，在不同品種間保守性很高。本試驗(yàn)擴(kuò)增的鴨I－FABP基因CDS序列共編碼132個(gè)氨基酸，與鴿子的同源性高達(dá)90.15%。鴨I－FABP基因第2外顯子上有一個(gè)T/C突變，該突變可導(dǎo)致編碼的第60位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸，且該突變位點(diǎn)位于該蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的βD折疊上，與人Ala54Thr突變位點(diǎn)位置相近。人Ala54Thr突變位點(diǎn)位于βC－D折疊，該結(jié)構(gòu)與α－Ⅱ螺旋遠(yuǎn)端形成門戶入口，且該結(jié)構(gòu)的第31、36、57賴氨酸位點(diǎn)與長鏈脂肪酸結(jié)合密切相關(guān)［9］。人I－FABP蛋白第54位氨基酸Thr可增加該蛋白在體外對長鏈脂肪酸的結(jié)合力［10］。在口服脂肪情況下，Thr54型個(gè)體表現(xiàn)為更高的血漿甘油三酯乳糜微粒和極低密度脂蛋白水平［11］。空腹情況下，Thr54型個(gè)體血脂具有更高的甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平和較低的高密度脂蛋白膽固醇水平［12］。此外，該多態(tài)位點(diǎn)還和肥胖、Ⅱ型糖尿病等相關(guān)［13－14］。鴨60位氨基酸突變位點(diǎn)緊鄰該蛋白門戶入口區(qū)，且野生型與突變型氨基酸親疏水性不同。在本次試驗(yàn)用于檢測多態(tài)位點(diǎn)的紹興鴨樣本中，未檢測到CC基因型，這可能由所選用品種特性決定。關(guān)于鴨I－FABP基因的這個(gè)有義突變能否對脂肪酸的結(jié)合能力產(chǎn)生影響，以及該位點(diǎn)與鴨脂類代謝相關(guān)性狀的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究確定。

I－FABP與L－FABP同在小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，是參與長鏈脂肪酸吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白。但兩者在小腸中的表達(dá)豐度、表達(dá)模式以及與脂肪酸的結(jié)合能力等均存在差異。鴨小腸中I－FABP的表達(dá)豐度遠(yuǎn)高于L－FABP。鴨I－FABP在空腸前段表達(dá)量最高，在十二指腸與空腸中段也具有較高的表達(dá)量，而L－FABP在空腸中段表達(dá)量最高，且遠(yuǎn)高于十二指腸和空腸。這兩個(gè)基因在不同腸段的表達(dá)模式與鼠的研究結(jié)果存在差異：小鼠I－FABP在靠近回腸段表達(dá)量最高，L－FABP在空腸近端表達(dá)量最高［15］，這可能是家禽消化系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物存在差異的結(jié)果。I－FABP與長鏈脂肪酸的親和力高于L－FABP［16］，I－FABP特異性的于小腸表達(dá)，一分子蛋白可與一分子長鏈脂肪酸結(jié)合；而L－FABP除在小腸表達(dá)外，在肝和腎也表達(dá)，且一分子蛋白可以結(jié)合兩分子長鏈脂肪酸［17］；在標(biāo)準(zhǔn)飲食條件下，IFABP主要參與TG的合成與分泌，而L－FABP更傾向于PL合成、膜保護(hù)以及基因調(diào)控等［15］；IFABP轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞采取的是與細(xì)胞膜碰撞的方式，而L－FABP則不需與膜發(fā)生反應(yīng)且促進(jìn)脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的水溶擴(kuò)散［18］；除此之外，I－FABP和L－FABP缺陷型小鼠具有明顯的表型差異證明了兩者在小腸上皮細(xì)胞中功能的差異性［19］。在干擾I－FABP表達(dá)后，L－FABP基因的表達(dá)未發(fā)生顯著的變化，兩者的差異性可能是產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因。本試驗(yàn)選擇進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的為小腸空腸前半段，在該段中L－FABP的表達(dá)量較低，這也可能是產(chǎn)生該結(jié)果的原因。關(guān)于小腸中幾種脂肪酸結(jié)合蛋白之間的相互作用關(guān)系還需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖5 L－FABP、MTTP與ApoB基因在鴨小腸不同腸段的表達(dá)Fig.5 Relative abundance of duck L－FABP，MTTPand ApoBmRNA in different intestine segments

圖6 鴨小腸上皮細(xì)胞干擾I－FABP基因表達(dá)后對L－FABP，MTTP和ApoB基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of I－FABPknockdown on the mRNA expression of L－FABP，MTTPand ApoBin duck primary small intestinal epithelia cells

MTTP和ApoB基因參與小腸脂類的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。家禽食物中長鏈脂肪酸運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，會(huì)重新酯化生成甘油三酯并以乳糜微粒的形式分泌到血液循環(huán)中，而小腸上皮細(xì)胞中乳糜微粒的組裝和分泌依賴于MTTP和ApoB［20－21］。本試驗(yàn)分析了不同腸段MTTP和ApoB基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，兩基因在小腸的表達(dá)模式很相似，均在空腸前半段和十二指腸中高表達(dá)，在空腸后段和回腸中低表達(dá)。在干擾I－FABP基因表達(dá)后，MTTP和ApoB基因mRNA的表達(dá)水平都明顯下調(diào)。這證明了I－FABP基因在小腸脂肪酸吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)中的重要作用。

總之，I－FABP在長鏈脂肪酸的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及脂類合成分解代謝中起重要的作用，研究I－FABP基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、多態(tài)性、組織分布及其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制對深入了解脂類代謝異常的發(fā)生機(jī)制及為家禽育種和營養(yǎng)調(diào)控尋找有效的靶點(diǎn)具有重要的意義。

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（編輯 郭云雁）

Molecular Cloning，Expression Pattern and Function of Duck I－FABP Gene

CHEN Fang1，2，3*，ZHANG Hao1，2，3，LU Li－zhi3
（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China；2.Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China；3.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou310021，China）

Abstract：This study aimed to analyze the structure and function of duck I－FABPgene.The Shaoxing duck was used.The sequence of duck I-FABPmRNA was cloned by RACE and RT－PCR.The expression patterns of I－FABPin different parts of small intestine were detected by qRTPCR.The function was analyzed by siRNA and qRT－PCR.The duck I－FABPgene encodes a 132－amino acid protein.A mutation from T to C resulting in a substitution from Ile to Thr was found at codon 60in exon 2of the I－FABP.I－FABP，MTTPand ApoBmRNA had high expression levels in duodenum and the first half of jejunum and had slight differences with the expression of L－FABP.After the I－FABPinterfered，the expression of MTTPand ApoBwere decreased significantly，but no obvious change at the expression level of L－FABP.The results verify the important role of I－FABPin uptake and translocation of fatty acid in small intestine of ducks and provide the foundation for further research.

Key words：duck；I－FABP；intestine；fatty acids

中圖分類號：S834；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－1041－08

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.023

收稿日期：2015－06－25

基金項(xiàng)目：湖北省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2016－620－000－001－028）；動(dòng)物胚胎及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題及湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金（2015NKYJJ27）

作者簡介：陳 芳（1987－），女，四川眉山人，助理研究員，博士，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控機(jī)理研究

*通信作者：陳 芳，E－mail：zhhchenfang0730@hotmail.com