大鼠早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨結(jié)構(gòu)與骨改建相關(guān)基因表達(dá)研究*

蘭貴華，張　波，劉　蘋，翁土軍，鄧蔓菁△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所:1.口腔科;2.第四研究室創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室,重慶 400042)

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大鼠早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨結(jié)構(gòu)與骨改建相關(guān)基因表達(dá)研究*

蘭貴華1，張波2，劉蘋2，翁土軍2，鄧蔓菁1△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所:1.口腔科;2.第四研究室創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室,重慶 400042)

[摘要]目的考察創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨的微結(jié)構(gòu)變化和基因表達(dá)變化，探索軟骨下骨的骨重建特點及其在關(guān)節(jié)軟骨退變中的作用。 方法選擇13只SD大鼠，利用內(nèi)側(cè)半月板撕裂(MMT)模型模擬創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎，右側(cè)膝關(guān)節(jié)行MMT手術(shù)，左側(cè)行假手術(shù)，術(shù)后3周處死大鼠并取膝關(guān)節(jié)組織標(biāo)本4%PFA固定。取10只SD大鼠的造模側(cè)及對照側(cè)脛骨關(guān)節(jié)，利用micro-CT 掃描并重建分析軟骨下骨的微結(jié)構(gòu)變化。標(biāo)本脫鈣后石蠟包埋切片，番紅O固綠染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察攝片。另取3只SD大鼠，提取軟骨下骨的組織RNA，RT-PCR檢測兩組之間骨形成標(biāo)志基因(ALP、RUNX2、OCN)與骨吸收相關(guān)基因(TRAP、CTSK、MMP9)mRNA水平的表達(dá)變化。結(jié)果MMT術(shù)后3周，脛骨關(guān)節(jié)micro-CT掃描顯示模型組軟骨下骨的小梁骨結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨下骨小梁骨的骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁連接密度(Conn.D)、骨小梁厚度(Tb.Th)降低(P<0.05)，骨小梁間隔(Tb.Sp)增大(P<0.05)。組織病理結(jié)果顯示，模型組關(guān)節(jié)軟骨未發(fā)生明顯結(jié)構(gòu)變化、軟骨下骨骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏。與對照組比較，模型組骨形成標(biāo)記基因mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05),骨吸收相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。結(jié)論大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)MMT誘導(dǎo)的創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)模型早期，軟骨下骨體積分?jǐn)?shù)降低、骨小梁厚度變薄，成骨細(xì)胞的標(biāo)志基因表達(dá)下降，破骨細(xì)胞的功能基因表達(dá)增加。

[關(guān)鍵詞]骨關(guān)節(jié)炎；軟骨下骨；微結(jié)構(gòu)；micro-CT

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種關(guān)節(jié)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。其主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的丟失，軟骨下骨的硬化和骨贅的形成等。引起OA的主要因素有衰老、炎癥和創(chuàng)傷等。目前，關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨在OA中的作用尚未完全闡明，以往研究認(rèn)為關(guān)節(jié)軟骨的退變導(dǎo)致了軟骨下骨的繼發(fā)改變[1]，越來越多的研究表明軟骨下骨在OA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在結(jié)構(gòu)上，由于軟骨下骨與關(guān)節(jié)軟骨緊密相連，關(guān)節(jié)軟骨的退變必然導(dǎo)致軟骨下骨的改變。本研究通過考察創(chuàng)傷性O(shè)A早期軟骨下骨微結(jié)構(gòu)變化和基因表達(dá)變化，明確軟骨下骨的骨重建特點。

1材料與方法

1.1材料動物為8周齡雄性SD大鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。Trizol(美國Invitrogen公司)，GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)，micro-CT(瑞士VivoCT公司)，病理切片機(jī)(德國Laica公司)，番紅O(美國Sigma公司)，固綠FCF(生工生物)，RNAlater(美國Life公司)，分光光度計(美國Thermo公司)，實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1分組及造模 取8周齡健康SD大鼠13只，雄性，體質(zhì)量200～220 g，無關(guān)節(jié)病變。分為兩組，第1組10只，第2組3只。術(shù)前1 d用8%硫化鈉溶液將雙側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮，范圍為關(guān)節(jié)上下各2 cm。3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg大鼠腹腔注射麻醉，麻醉成功后動物仰臥，消毒鋪巾，備皮。模型側(cè)：取右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)長約0.8 cm切口，沿內(nèi)側(cè)副韌帶切斷，打開內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)腔進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，找到內(nèi)側(cè)半月板，用微創(chuàng)剪剪斷，生理鹽水沖洗，依層縫合，術(shù)中不損傷軟骨面。假手術(shù)側(cè)：同時取對側(cè)膝關(guān)節(jié)，入路同前，打開關(guān)節(jié)腔，沖洗，關(guān)閉切口[2]。大鼠術(shù)后不做任何處理，分開飼養(yǎng)，自由活動及進(jìn)食。

1.2.2標(biāo)本采集和處理3周后，將兩組大鼠脫頸處死，取雙側(cè)脛骨近端，第1組用4%多聚甲醛固定。第2組去除脛骨關(guān)節(jié)軟骨，獲得軟骨下骨組織，并將組織放置于RNAlater中，備用。

1.2.3顯微CT檢查將脛骨標(biāo)本垂直固定在適配容器內(nèi)，沿標(biāo)本長軸方向，從脛骨近端骨骺上極掃描至干骺端下極。掃描條件:球管電壓55 kV，球管電流145 μA，8 W，矩陣2 048×2 048，分辨率19 μm。將掃描所得 DICOM圖像,用SCANCO工作站軟件V6.1進(jìn)行軟骨下骨分析和三維重建，觀察分析創(chuàng)傷性O(shè)A模型中早期軟骨下骨的影像表現(xiàn)。

1.2.4組織學(xué)觀察完成顯微CT掃描后，將大鼠的雙側(cè)脛骨標(biāo)本用4%多聚甲醛固定24 h，0.5 mol/L EDTA 脫鈣，針刺反應(yīng)陽性后進(jìn)行乙醇梯度脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，從冠狀面對每個樣本進(jìn)行6 μm連續(xù)切片，并進(jìn)行番紅O固綠染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測軟骨下骨骨形成與骨吸收相關(guān)基因mRNA的表達(dá)通過液氮保護(hù)下研磨軟骨下骨，利用Trizol一步法抽提軟骨下骨組織總RNA，分光光度計測吸光度(A)260/280及RNA水平。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA備用，應(yīng)用ABI step one實時PCR System進(jìn)行操作。使用Primer5.0設(shè)計引物GAPDH上游：5′-CAA GTT CAA CGG CAC AGT CA-3′,GAPDH下游：5′-ACA TAC TCA GCA CCA GCA TCA C-3′；Runx2上游：5′-AAC TTC CTG T-GC TCC GTG CT-3′，Runx2下游：5′-CTC CGG CCT ACA AAT CTC AGA-3′；OCN上游：5′-GAC AAG TCC CAC ACA GCA AC-3′，OCN下游：5′-CCG GAG TCT ATT C-AC CAC CT-3′；ALP上游：5′-AAA TGC CCT GAA ACT CCA AA-3′，ALP下游 ：5′-ATC TCC AGC CGT GTC TCC TC-3′；CTSK上游：5′-TGA CTC TGA AGA CGC TT-ACCC-3′，CTSK下游：5′-CAC ATT ATC ACG GTC GCA GTT-3′；TRAP上游：5′-ACG GCT ACC TAC GCT TTC AC-3′，TRAP下游：5′-CCC TCC CTC AGA CCC ATT-AG-3′；MMP9上游：5′-ATG GTT TCT GCC CCA GTG AG-3′，MMP9下游：5′-CCT TTA GTG GTG CAG GCA GA-3′。RT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性10 min，95 ℃，變性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)40個循環(huán)。結(jié)果分析：目的基因的相對表達(dá)量=2-△△Ct(Ct=Ct1-Ct2，Ct1：待測基因的臨界循環(huán)數(shù)，Ct2：GAPDH的臨界循環(huán)數(shù))。

2結(jié)果

2.1考察軟骨下骨微結(jié)構(gòu)改變的影像學(xué)表現(xiàn)術(shù)后3周，脛骨近端通過micro-CT掃描與分析，模型側(cè)較假手術(shù)側(cè)關(guān)節(jié)小梁骨結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(圖1)，軟骨下骨小梁骨的骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁連接密度(Conn.D)降低(P<0.05)，骨小梁間距(Tb.Sp)增加(P<0.05)，骨小梁數(shù)目(Tb.N)減少但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

A、C：假手術(shù)側(cè)；B、D：模型側(cè)。

圖1　脛骨micro-CT掃描結(jié)果

*：P<0.05，與假手術(shù)側(cè)比較。

2.2番紅O固綠染色為明確術(shù)后3周軟骨下骨的病理學(xué)改變，行脛骨組織切片分析，兩組中關(guān)節(jié)軟骨未發(fā)生明顯退變，而模型側(cè)軟骨下骨骨小梁結(jié)構(gòu)較假手術(shù)側(cè)稀疏。結(jié)果顯示骨關(guān)節(jié)炎早期將影響軟骨下骨結(jié)構(gòu)的改建，見圖2。

2.3軟骨下骨組織RT-PCRRT-PCR結(jié)果顯示，術(shù)后3周軟骨下骨的成骨細(xì)胞相關(guān)基因ALP、RUNX2、OCN大量表達(dá)，MMT側(cè)小于假手術(shù)側(cè)(P<0.05),表明骨形成降低。破骨細(xì)胞相關(guān)基因TRAP、CTSK、MMP9表達(dá)升高，且MMT側(cè)高于假手術(shù)側(cè)(P<0.01)，結(jié)果表明，創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨重建加快，骨吸收大于骨形成，見圖3。

A：假手術(shù)側(cè)；B：模型側(cè)。

圖2番紅O固綠染色的組織病理學(xué)切片(×20)

A：ALP基因表達(dá)；B:RUNX2基因表達(dá)；C：OCN基因表達(dá)；D：TRAP基因表達(dá)；E：CTSK基因表達(dá)；F：MMP9基因表達(dá);*：P<0.05，**：P<0.01。

圖3軟骨下骨mRNA中骨形成與骨吸收基因的表達(dá)

3討論

目前，通過實驗動物模型模擬人OA來研究其發(fā)生、發(fā)展，其具有造模周期相對較短，操作簡便，能模擬OA隨時間進(jìn)展的基本病理過程，能復(fù)制出OA的退變過程，以及軟骨下骨骨重建的特點。OA動物模型包括自發(fā)性和誘發(fā)性動物模型，從實驗周期、成本控制等方面考慮，誘發(fā)性動物模型應(yīng)用更為廣泛。誘發(fā)性O(shè)A模型的主要方法包括機(jī)械制動、藥物注射和手術(shù)方法[3]。本研究中所使用的模型骨關(guān)節(jié)炎實驗動物模型由Bendele[2]提出，術(shù)后3周就能造成關(guān)節(jié)退行性變，特點是軟骨細(xì)胞和蛋白多糖減少，骨贅形成等。此實驗動物模型得到了廣大學(xué)者的認(rèn)可[4-7]。

以往研究認(rèn)為OA的主要病理變化為軟骨的退變引起了軟骨下骨的改變，近年來越來越多的研究表明軟骨下骨的改變是OA的始因，軟骨下骨的結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)性能及生物學(xué)方面的變化與OA密切相關(guān)[8]。本研究表明，3周時關(guān)節(jié)軟骨未出現(xiàn)明顯組織學(xué)變化，而軟骨下骨小梁體積減小，骨小梁變薄，表現(xiàn)為輕度的骨吸收，表明在OA早期,軟骨下骨轉(zhuǎn)換活躍,骨吸收大于骨形成，軟骨下骨的改變早于關(guān)節(jié)軟骨的退變。OA早期軟骨下骨骨重建加快，軟骨下骨轉(zhuǎn)換的增加，以及之后軟骨下骨的硬化與OA的進(jìn)展密切相關(guān)。因此，考察軟骨下骨骨體積有利于全面了解OA的病理變化過程。在Hayami等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)OA早期軟骨下骨量減少，骨轉(zhuǎn)換加快，骨吸收大于骨形成。軟骨下骨骨改建與OA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在OA的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，抑制軟骨下骨的異常骨轉(zhuǎn)換可能減緩OA進(jìn)展。Stupina等[10]研究發(fā)現(xiàn)，改變軟骨下骨的微結(jié)構(gòu)和改善其血管化能增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的新陳代謝,實現(xiàn)軟骨和軟骨下骨的體內(nèi)平衡和改善組織營養(yǎng)，恢復(fù)其功能。在Botter等[11]用micro-CT三維成像技術(shù)觀察大鼠OA動物模型4周后造模處骨組織的變化，發(fā)現(xiàn)軟骨下骨板的厚度下降，骨小梁之間的連接減少，體積減小，骨小梁間距增加。OA早期常伴有骨重塑加快引起的骨量丟失，晚期可見骨轉(zhuǎn)換率降低并引起軟骨下骨板致密化及軟骨全部丟失。OA 早期軟骨下骨重塑過程加快，軟骨下骨板變薄[12]。OA早期未出現(xiàn)臨床癥狀時，OA患者受累骨關(guān)節(jié)骨吸收標(biāo)志物水平明顯升高，提示OA軟骨下骨重塑加快早于軟骨受損的發(fā)生[13]。

RT-PCR結(jié)果顯示，MMT側(cè)骨形成基因表達(dá)降低，而骨吸收基因表達(dá)升高。CTSK和TRAP基因作為破骨細(xì)胞特殊生物學(xué)標(biāo)記物，可以作為檢測破骨細(xì)胞功能的指標(biāo)。有研究表明CTSK、TRAP和MMP9基因在OA軟骨下骨中表達(dá)明顯上調(diào)[14-16]。ALP、RUNX2及OCN基因在成骨過程中發(fā)揮重要作用，在早期OA中表達(dá)下調(diào)[17]。在OA的發(fā)生、發(fā)展中，軟骨下骨的重建可能起著至關(guān)重要的作用[18]，干預(yù)OA的骨重塑過程可能減緩其進(jìn)展。Hayami等[19]在ACLT OA模型中發(fā)現(xiàn)抑制CTSK能夠保持軟骨下骨的完整性，防止軟骨退化，減少骨贅的形成。抑制軟骨下骨的過快骨吸收可以延緩軟骨的退變。比如一些抑制破骨細(xì)胞功能的藥物通過改善軟骨下骨的骨重建能延緩軟骨退變，從而治療OA[20]。

綜上所述，在早期OA中，軟骨下骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，軟骨下骨在OA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，研究早期OA軟骨下骨的變化能預(yù)測隨后疾病的癥狀及結(jié)構(gòu)的發(fā)展。本研究考察了軟骨下骨的骨重建變化及骨改建特點，發(fā)現(xiàn)早期OA軟骨下骨骨小梁減少、骨吸收增強(qiáng)，為調(diào)控軟骨下骨的骨轉(zhuǎn)換防治早期OA提供了實驗依據(jù)。

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Research on the subchondral bone architecture and bone remodeling related genes change in the initial stage of osteoarthritis in rat*

Lan Guihua1,Zhang Bo2,Liu Ping2,Weng Tujun2,Deng Manjing1△

(1.DepartmentofStomatology,DapingHospital&ResearchInstituteofSurgery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China;2.Department4,DapingHospital&ResearchInstituteofSurgery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnsandCombinedInjury,Chongqing400042,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the changes of microarchitecture and gene expression of subchondral bone in the initial stage of traumatic arthritis,to explore the characteristics of subchondral bone remodeling and its role in the articular cartilage degeneration.MethodsThe medial meniscal tear (MMT) was performed on the right knees of 13 SD rats to simulate the traumatic osteoarthritis,while sham operation on the control group.Three weeks later, all the rats were executed and dissected,with proximal tibiae being kept and distributed into the two groups,10 respectively.Micro-computed tomography (micro-CT) was adopted to reconstruct and analyze the subchondral bone.After being fixed by 4% paraformaldehyde,all the samples were decalcified until six weeks passed,followed by paraffin-sectioning,safranin O and fast green staining,and examining and photographing under an ordinary optical microscope.The RNA of another 3 SD rats′ subchondral bone was extracted,and a real-time PCR test was carried out to illuminate the expression variation of bone-formation marker genes (ALP,RUNX2,and OCN),and bone-resorption marker genes(TRAP,CTSK and MMP9),between the two groups.ResultsThree weeks after MMT surgery,subchondral bone disorders were observed among the experimental samples through micro-CT scanning.There was lesser BV/TV,Conn.D and Tb.Th(P<0.05) and more Tb. Sp(P<0.05) in the experimental group compared with the control group.In the pathological section,arthritic degeneration was not spotted in both groups,but trabeculae of the experimental group were found to be sparse.Compared with control group,the level of mRNA expression of the bone-formation marker genes of the experimental group was decreased(P<0.05),while bone-resorption related genes increased(P<0.05).ConclusionThe model of initial traumatic osteoarthritis induced by MMT in rats′ knees showed an active bone remodeling,more bone absorbing than bone formation,lowered bone volume,and microarchitecture changing of the subchondral bone.

[Key words]osteoarthritis;subchondral bone;microarchitecture;micro-CT

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.004

*基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(2011CB964701)。

作者簡介：蘭貴華(1987-)，在讀碩士，主要從事口腔醫(yī)學(xué)院的研究?！魍ㄓ嵶髡撸琓el:(023)68757575；E-mail：iradeng@163.com。

[中圖分類號]R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2170-03

(收稿日期：2016-01-11修回日期：2016-03-22)