貴陽地區(qū)2013年手足口病非EV71、非CVA16型腸道病毒的檢測(cè)分析*

楊興林，梁躍東，洪章萍，熊金鳳，王云芬，黃　海

(1.貴州省貴陽市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科　550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系,貴陽 550004)

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貴陽地區(qū)2013年手足口病非EV71、非CVA16型腸道病毒的檢測(cè)分析*

楊興林1，梁躍東1，洪章萍1，熊金鳳1，王云芬1，黃海2

(1.貴州省貴陽市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系,貴陽 550004)

[摘要]目的了解貴陽地區(qū)引起手足口病(HFMD)的非腸道病毒71型(EV71)、非柯薩奇病毒A(CVA)16型腸道病毒的病原構(gòu)成及優(yōu)勢(shì)型別，為貴陽地區(qū)HFMD防治工作提供依據(jù)。方法收集2013年4～6月檢測(cè)為非EV71、非CVA16型腸道病毒的HFMD患者肛拭子標(biāo)本共107例。提取病毒核酸，用巢式RT-PCR法擴(kuò)增病毒VP4區(qū)序列，對(duì)PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過與GenBank收錄的序列BLAST比對(duì)確定病毒型別；并對(duì)優(yōu)勢(shì)型別進(jìn)行序列和進(jìn)化分析。結(jié)果107例標(biāo)本中共有100例標(biāo)本巢式RT-PCR檢測(cè)為陽性(93%)，其中100例PCR產(chǎn)物測(cè)序成功，經(jīng)BLAST比對(duì)后，100例標(biāo)本病毒型別均得到確定：CVA6為46例，CVA10為30例，CVA5為10例，CVA2為6例，CVA3和CVA4各2例，CVB2和ECHO16各2例。CVA6在型別確定的非EV71、非CVA16型腸道病毒中占42.99%，為優(yōu)勢(shì)腸道病毒型別。結(jié)論貴陽地區(qū)引起HFMD的腸道病毒型別多樣，CVA6為非EV71、非CVA16型腸道病毒中的優(yōu)勢(shì)型別。

[關(guān)鍵詞]手足口病；腸道病毒；基因型

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)主要由腸道病毒(enteroviruses,EV) 引起的出疹發(fā)熱急性傳染病，引起HFMD的病毒屬于小RNA病毒科EV屬，引發(fā)HFMD 的有20多個(gè)血清型，包括柯薩奇病毒A組(CVAsckievirus A,CVA)的2、4、5、7、9、10、16 型等，B組(CVAsckievirus B,CVB)的1、2、3、4、5 型等；EV71型(human enterovirus 71,EV71)；?？刹《?echovirus,ECHO)等。其中以EV71及CVA16型較為常見。盡管非EV71型非CVA16型EV在HFMD病原譜中占一定比例，但目前對(duì)其構(gòu)成和分子流行病學(xué)特征尚不清楚。HFMD的疫情有傳播快、易于流行的特點(diǎn)，但仍以輕型普通病例為主，HFMD常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)主要用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)對(duì)EV通用型、EV71型和CVA16型核酸進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于引起HFMD的其他型別EV的病原構(gòu)成其報(bào)道較少，不同地區(qū)病原構(gòu)成其分布情況也有不同。

對(duì)2011年4～10月在貴陽市第五人民醫(yī)院住院期間臨床診斷為HFMD病例采集肛拭子標(biāo)本1 379 份運(yùn)用RT-PCR檢出率分別為EV通用型46.99%，EV71型5.80%，EV71 和柯薩奇病毒A16型2.18%[1]。2012年的檢測(cè)數(shù)據(jù)同樣以EV通用型，說明本地區(qū)其HFMD原主要以其他型EV為主。為進(jìn)一步了解貴陽地區(qū)引起HFMD的非EV71、非CVA16型EV的病原構(gòu)成，筆者針對(duì)EV VP4區(qū)設(shè)計(jì)的一套分型引物進(jìn)行RT-PCR，通過測(cè)序和序列比對(duì)分析對(duì)2013年4～6月其他型EV進(jìn)行型別鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集2013年4月1日至6月30日，在貴陽市第五人民醫(yī)院(貴陽市HFMD的定點(diǎn)醫(yī)院)感染科住院治療的HFMD患兒1 410例，年齡1個(gè)月至15歲，其中，男876例、女534例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照均符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》HFMD診斷標(biāo)準(zhǔn)及《手足口病診療指南》(2010年版)HFMD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的采集在患兒住院當(dāng)天用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后,迅速將棉簽放入病毒采樣管(北京友康基業(yè)生物科技有限公司)中，采樣管外表貼上帶有惟一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。于2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃低溫保存，2 d內(nèi)用RT-PCR檢測(cè)EV通用型、EV71、CVA16核酸，對(duì)EV通用型陽性、EV71核酸陰性、CVA16核酸陰性的標(biāo)本-80 ℃低溫保存。

1.2.2EV核酸PCR熒光檢測(cè)采用上海之江生物科技有限公司生產(chǎn)的EV71、 CVA16 RT-PCR試劑和EV通用型RT-PCR試劑。EV通用型包括柯薩奇病毒A組4、5、6、7、9、10、16型，柯薩奇病毒B組2、5、13型，埃可病毒和EV71型特異性核酸片段，EV71型只含 EV71的特異性RNA核酸片段，CVA16型只對(duì)16型特異性RNA核酸片段，采用一步法RT-PCR技術(shù)結(jié)合熒光探針技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。病毒 RNA 的提取，采用磁珠柱提取法，按照上海之江生物科技有限公司RNA抽提試劑盒說明書操作。擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件按照說明書操作和設(shè)置，在羅氏Cobas′z 480 RT-PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。熒光通道檢測(cè)選擇：選用FAM通道。結(jié)果判斷：按照說明書，檢測(cè)Ct≤38，檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為陽性；檢測(cè)Ct值在38～40，重復(fù)檢測(cè)1次，如果重復(fù)檢測(cè)Ct值仍在38～40，則判為陰性。EV通用型試劑檢測(cè)為陽性而EV71和CVA16特異性試劑檢測(cè)為陰性的標(biāo)本，則判為其他血清型EV陽性。對(duì)判為其他血清型腸道通用陽性的標(biāo)本(非16、71型)，用上海之江生物科技有限公司生產(chǎn)CVA6型核酸測(cè)定檢測(cè)試劑、CVA10型核酸測(cè)定檢測(cè)試劑檢測(cè)，對(duì)其篩查陰性樣本進(jìn)行如下方法測(cè)序鑒定。

1.2.3其他血清型EV檢測(cè)采用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒,按照說明書操作從140 μL肛拭子病毒保存液提取RNA,提取的RNA最終溶解在50 μL無菌無核酸酶水中備用。參考Ishiko等[2]針對(duì)EV VP4區(qū)設(shè)計(jì)的一套分型引物進(jìn)行RT-PCR。以O(shè)L68-1/MD91為引物，按OneStep RT-PCR Kit(購(gòu)自QIAGEN公司)說明書配制第1輪PCR體系，反應(yīng)條件如下： 50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取第1輪PCR產(chǎn)物5 μL，以O(shè)L68-1/EVP4為引物，進(jìn)行第2輪PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ lrain，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。其他血清型EV檢測(cè)引物序列見表1。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1% TAE 瓊脂糖凝膠電泳。PCR陽性產(chǎn)物送北京諾賽基因公司切膠純化回收后測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的EV核苷酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定病毒型別。

表1　其他血清型EV檢測(cè)引物序列

2結(jié)果

2.1臨床EV RT-PCR檢測(cè)結(jié)果在1 410例臨床標(biāo)本中，EV通用型的陽性為702例，檢出率為49.79%。其中EV71 75例，占5.32%；CVA16陽性73例，占5.18%；EV71與CVA16同時(shí)陽性2例，占0.14%，其他血清型EV552例，占39.15%，分布比例見表2，檢測(cè)EV部分標(biāo)本熒光RT-PCR曲線見圖1。

表2　1 410例標(biāo)本PCR熒光檢測(cè)EV結(jié)果

圖1　EV通用型RT-PCR檢測(cè)

圖2　電泳圖

EV型別陽性數(shù)(n)檢出率(%)(陽性/標(biāo)本總數(shù),n/n)CVA64642.99(46/107)CVA103028.04(30/107)CVA265.61(6/107)CVA321.87(2/107)CVA421.87(2/107)CVA5109.35(10/107)CVB221.87(2/107)ECHO1621.87(2/107)無擴(kuò)增76.54(7/107)總計(jì)107100.00(107/107)

2.2其他型EV的檢測(cè)結(jié)果在RT-PCR檢測(cè)EV通用型陽性，而EV71和CVA16檢測(cè)陰性的標(biāo)本1 410例樣本中，抽取107例樣本，用RT-PCR法進(jìn)行CVA6、CVA10檢測(cè)，對(duì)CVA6、CVA10檢測(cè)性樣本用EVVP4區(qū)設(shè)計(jì)的一套分型引物進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank EV核苷酸序列經(jīng)BLAST比對(duì)。107例標(biāo)本病毒型別得到結(jié)果：CVA10型30例，CVA6型46例，CVA5型10例，CVA2型6例，CVA3型2例，CVA4型2例，CVB2型2例，ECHO16型2例，另有7份PCR產(chǎn)物沒有擴(kuò)增，需進(jìn)一步研究(表3)，部分條帶電泳圖，見圖2。

3討論

HFMD自1957年在新西蘭首次報(bào)道后呈世界范圍內(nèi)流行,1958 年在加拿大分離并鑒定出CVA16為本病病原，1959 年將本病命名為“手足口病”，同時(shí)發(fā)現(xiàn)早期HFMD的主要病原以CVA16為主要病原。1974年Kennett等[3]對(duì)1969～1974年美國(guó)加利福尼亞地區(qū)20例腦膜炎或腦炎的患者進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，首次從l例腦炎患兒(1969年)的糞便標(biāo)本中分離出病毒并鑒定為EV71。1981年HFMD首次在我國(guó)上海報(bào)道，以后相繼在北京、河北、天津、福建、吉林、上東、湖北和廣東等十幾個(gè)省(市)發(fā)現(xiàn)此病。而且自2008年安徽阜陽出現(xiàn)大范圍暴發(fā)和流行以來，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。2008年5月，原國(guó)家衛(wèi)生部將HFMD歸為國(guó)家法定丙類傳染病管理。

本研究運(yùn)用RT-PCT對(duì)2013年貴陽地區(qū)的1 410例臨床HFMD病例進(jìn)行核酸檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病原體主要為其他EV為主，其次為EV71和CVA16。其檢測(cè)數(shù)據(jù)與貴陽地區(qū)2010年報(bào)道數(shù)據(jù)EV通用型陽性率為 68.27%，CVA16陽性率為6.73%，EV71 陽性率為13.46%[1]。2011年報(bào)道EV通用型核酸、EV71和CVA16核酸檢出率分別為46.99%、5.80%、2.80%相比變化不大[4]。通過近年來對(duì)本地區(qū)EV病原監(jiān)測(cè)，說明本地區(qū)的HFMD病原體主要是非EV71、非CVA16型其他型EV感染，對(duì)這些未分型EV進(jìn)一步分型鑒定，將有助于全面了解本地區(qū)HFMD的病原譜，同時(shí)有助于分析是否存在非EV71、非CVA16的其他優(yōu)勢(shì)病毒型別，為HFMD防控工作提供明確的病原學(xué)依據(jù)。在目前常規(guī)的病原學(xué)核酸檢測(cè)除用EV通用引物進(jìn)行檢測(cè)外，只進(jìn)行EV71和CVA16的分型檢測(cè)。李靜等[5]報(bào)道南京2010年EV71陽性率為44.35%，CVA16陽性率為11.29%，其他EV陽性率為3.23%，胡海贅等[6]等報(bào)道上海2009～2011年檢出EV71陽性率為31.8%，CVA16陽性率為30.5%，其他EV陽性率為10.0%。王彥霞等[7]報(bào)道河南省2008～2010年普通病例中EV71、CVA16和其他EV感染分別占51.06%、14.89%、34.05%?，F(xiàn)已明確引起HFMD的EV有多種，以EV71和CVA16最為常見，但各地報(bào)道其病原構(gòu)成也不一樣，其病原構(gòu)成具有明顯的地域性。

HFMD病毒分離培養(yǎng)是HFMD病原診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因?yàn)槠浞蛛x鑒定繁瑣、費(fèi)力、耗時(shí)長(zhǎng)，給快速檢測(cè)和早期診斷工作帶來困難，也無法滿足疾病流行期間同時(shí)處理大量標(biāo)本的需要，近年來PCR技術(shù)已成為診斷EV感染最常用的一種方法，目前主要用于檢測(cè)EV通用、EV71和CVA16的分型。本研究通過VP4序列鑒定方法對(duì)1 410例臨床HFMD病例非EV71、非CVA16型的其他型EV隨機(jī)選出的107例進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列分析，結(jié)果為CVA6 46例、CVA10 30例、CVA5 10例、CVA2 6例，分別占其他EV的42.99%、28.04%、9.35%、5.61%；CVA3 2例、CVA4 2例、CVB2 2例、ECHO16 2例分別占其他EV的1.87%。有7例沒有擴(kuò)增成功，可能是病毒含量低，或者是病毒擴(kuò)增區(qū)序列變異，沒有進(jìn)行設(shè)計(jì)VP1引物檢測(cè)。在已檢測(cè)的107株EV中，有46株為CVA6，有30株為CVA10，說明本地區(qū)非EV71、非CVA16型EV中的優(yōu)勢(shì)型別主要為CVA6，其次為CVA10。近年來CVA6與CVA10引起的報(bào)道較多，芬蘭2008出現(xiàn)全國(guó)范圍的HFMD大暴發(fā)，病原為CVA6和CVA10[8]，在新加坡，CVA10在HFMD病原中也占較高比例[9],2005年日本HFMD流行期間，CVA6和CVA10傳播性比EV71強(qiáng)，但毒力比EV71弱[10],2009年，我國(guó)山東省也發(fā)現(xiàn)了由CVA10引起的HFMD暴發(fā)[11],且近年來報(bào)道CVA6和CVA10流行的文獻(xiàn)陸續(xù)出現(xiàn)，提醒人們需加強(qiáng)對(duì)CVA6和CVA10的監(jiān)測(cè)工作。

因此，在以后的HFMD病原學(xué)監(jiān)測(cè)中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)EV的分型鑒定，以全面動(dòng)態(tài)地了解其病原譜及優(yōu)勢(shì)病毒型別的變化，并進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性和分子流行病學(xué)特征，為HFMD的預(yù)測(cè)、預(yù)警和防治工作提供科技支撐。

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Etiology study of hand,foot and mouth disease related non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses in Guiyang area during 2013*

Yang Xinglin1,Liang Yuedong1,Hong Zhangping1,Xiong Jinfeng1,Wang Yunfen1,Huang Hai2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFifthPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang,Guizhou550004,China;2.DepartmentofMedicalTest,GuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the prevalence of non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses strains of hand,foot and mouth disease(HFMD) in Guiyang,and analyze the genetic evolution of these non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses strain,and to provide a basis for preventing and controlling (HFMD) in Guiyang.MethodsA total of 107 HFMD specimens tested positive for enteroviruses and negative for EV71 and CoxA16 were collected from April to June of 2013.The virus RNA was extracted,and the VP4 sequence was amplified by nested RT-PCR.The PCR positive products were sequenced and the enteroviruses type was identified by sequence BLAST.The sequence and phylogenetic analysis of the predominant virus type was performed.Results100 out of 107(93%)specimens were tested positive by nested RT-PCR,among which 100 PCR products were successfully sequenced.And the types of the 100 enterovirus strains were identifled by sequence BLAST：46 CoxA6,30 CoxA10,10 CoxA5,6 CoxA2,2 CoxA3 and 2 CoxA6,2 CoxB2 and 2 ECHO16.CoxA6 accounted for 42.99% in typed non-EV71,non-CoxA16 enterovimses,and was the predominant type.ConclusionHand,foot and mouth disease in Guiyang was conceded with diverse enteroviruses,and CoxA6 was the predominant type among non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses.

[Key words]hand,foot and mouth disease;enterovirus;genotype

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.012

*基金項(xiàng)目：貴陽市科技局項(xiàng)目(筑科合[2013103]9號(hào));貴陽市高層次創(chuàng)新型青年衛(wèi)生人才項(xiàng)目(筑衛(wèi)合[2013]創(chuàng)2號(hào))。

作者簡(jiǎn)介：楊興林(1976-)，主管檢驗(yàn)技師，本科，主要從事分子生物研究?！魍ㄓ嵶髡撸琓el:18685021938;E-mail:ldy302@163.com。

[中圖分類號(hào)]R512.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)17-2343-03

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-02-26)