CK7、CK19在不同級別宮頸上皮內(nèi)病變和宮頸癌中的表達及臨床意義

趙媛媛，譚雄暢，陳 宇，黃遠港，楊林幅，阮 萍

（廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在中國15～44歲女性惡性腫瘤死亡率中，宮頸癌位居第三，僅次于乳腺癌及肺癌，中國每年約有61 700例宮頸癌新發(fā)病例，約29 600例宮頸癌患者死亡［1］。目前人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗在我國已正式上市，但我國人群對于HPV 及其疫苗的認知度低，疫苗的普及率低，接種率也不理想［2］。因此，我們不僅要關(guān)注已經(jīng)接種疫苗的人群中宮頸癌的發(fā)生是否降低，也應同時關(guān)注已被診斷為宮頸癌前病變的人群?；谛螒B(tài)學分級的局限性，并不能有效預測宮頸病變是否進展，特異性分子生物標記物輔助宮頸篩查成為目前研究的熱點之一。近年的研究顯示鱗柱交界（Squamo?columnar junction，SCJ）細胞是宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)內(nèi)一種獨特的上皮細胞群，被認為是HPV 感染宮頸細胞的起始部位［3］。細胞角蛋白7（Cytokeratin 7，CK7）作為SCJ 的免疫標記物，與HPV 介導的宮頸癌前病變和宮頸癌有關(guān)［4］。目前對于CK7、細胞角蛋白19（Cyto?keratin 19，CK19）與SCJ細胞轉(zhuǎn)化為癌組織這三者之間的聯(lián)系研究較少。本研究擬探討檢測CK7、CK19在不同級別子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌中的表達，評價其在宮頸癌前病變和宮頸癌中的診斷效能及作為預測子宮上皮內(nèi)病變進展和腫瘤預后評估手段的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2016年6月至2019年11月廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院收治的行宮頸電切環(huán)形切除術(shù)、宮頸錐切術(shù)或全子宮切除術(shù)患者72例，其中經(jīng)術(shù)后病理證實為低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（Lowgrade squamous intraepithelial lesion，LSIL）16例（LSIL組）、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（High-grade squa?mous intraepithelial lesion，HSIL）42例（HSIL 組）；同期收治的行全子宮切除術(shù)或廣泛子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)患者14例，經(jīng)術(shù)后病理證實為宮頸鱗癌（SCC 組）。所有研究對象均未合并其他內(nèi)外科疾病，術(shù)前未進行免疫性治療；排除宮頸病變術(shù)后復發(fā)的患者。

1.2 免疫組化EnVision 檢測所用鼠抗人CK7 單克隆抗體、鼠抗人CK19單克隆抗體及EnVision 兩步法試劑盒均為北京中杉金橋公司生產(chǎn)。常規(guī)脫蠟、水化組織切片；按說明書進行檸檬酸鹽高溫高壓修復；0.3% 或3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 或TBS沖洗；滴加CK7、CK19一抗4℃過夜；按試劑盒說明書滴加二抗；滴加DAB 溶液顯色；蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。采用該公司提供的陽性切片為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 判定標準采用組織學評分，所得免疫組化切片表達結(jié)果由廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院病理科專家閱片審核。CK7 及CK19 均在細胞質(zhì)表達，CK7及CK19陰性定義為完全陰性或局灶、模糊的單個細胞染色。CK19 陽性定義為5～6 個連續(xù)的細胞顯示胞漿和/或胞膜染色。CK7 陽性定義為≥1% 細胞胞漿的彌漫染色。根據(jù)病變處上皮細胞內(nèi)的染色情況，CK7可分為三種染色模式：陰性、斑片狀陽性、彌漫陽性。根據(jù)染色細胞百分比進行評分：陰性（0分），少于1%的細胞染色；斑片狀陽性（1 分），介于1%到40%的細胞染色；彌散陽性（2 分），超過40%的細胞染色［4］。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher’s 檢驗；CK7 和CK19 的表達相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)性分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CK7 在不同級別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達CK7 在正常的宮頸上皮往往是陰性；在高、低級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變及鱗狀細胞癌中，CK7 的表達表現(xiàn)為表層斑片狀陽性，或全層彌漫陽性，但表層斑片狀染色加深，呈現(xiàn)“由上至下”的染色模式（見圖1）。各組中CK7 表達率由高到低依次為HSIL 組（76.19%）、SCC 組（64.29%）、LSIL 組（25.00%）。CK7 在LSIL 組、HSIL 組、SCC 組中的表達率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.531，P＜0.05）。其中LSIL 組CK7 表達率與HSIL 組、SCC 組差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=13.352、4.693，均P＜0.05）；HSIL 組CK7表達率與SCC 組差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.759，P＞0.05）。見表1。

表1 CK7在不同級別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達情況 （例）

2.2 CK19 在不同級別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達在正常的宮頸鱗狀上皮中，CK19 多數(shù)在基底層表達。在高、低級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變及鱗狀細胞癌中，CK19表達多為全層表達或表達于癌巢周邊（見圖1）。各組中CK19 表達率由高到低依次為SCC 組（78.57%）、HSIL 組（76.19%）、LSIL 組（31.25%）。CK19 在LSIL 組、HSIL 組、SCC 組中的表達率差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=11.638，P＜0.05）。LSIL 組CK19 表達率與HSIL 組、SCC 組表達率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.131、6.718，均P＜0.05）；HSIL組CK19表達率與SCC 組差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.033，P＞0.05）。見表2。

圖1 各級別宮頸上皮病變HE染色、CK7及CK19表達情況

表2 CK19在不同級別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達情況 （例）

2.3 CK7、CK19的表達相關(guān)性經(jīng)Spearman秩相關(guān)性分析，CK7與CK19在不同級別子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌中的表達呈正相關(guān)，有統(tǒng)計學意義（r=0.365，P＜0.05），見表3。

表3 CK7及CK19在不同級別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達相關(guān)性 （例）

3 討 論

宮頸癌的發(fā)生歷經(jīng)低級別子宮上皮內(nèi)病變（LSIL）、高級別子宮上皮內(nèi)病變（HSIL）、宮頸鱗癌（SCC），是一個緩慢、漸進的過程。細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑P16 和細胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67是目前臨床上常用來輔助診斷子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌的標記物。P16、Ki-67 二者聯(lián)合檢測可反映腫瘤細胞的增殖狀態(tài)［5］。但這兩個指標并不能作為預測子宮上皮內(nèi)病變進展及分級的特異性標記物。

SCJ 細胞是宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)內(nèi)一種獨特的上皮細胞群，被認為是HPV 感染宮頸細胞的起始部位。目前認為SCJ 細胞作為殘留的胚胎細胞，容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化［6］，CK7、AGR2、CD63 等可作為SCJ 細胞的標記物［7］。

細胞角蛋白（CK）作為一種中間絲，是細胞骨架的一部分，起維持上皮細胞機械穩(wěn)定性和完整性的作用。CK 的表達參與細胞結(jié)構(gòu)調(diào)整、生長、增殖、凋亡整個過程［8］。它的表達水平受到細胞增殖和分化狀態(tài)的影響，在正常細胞發(fā)生惡變后，CK 的表達水平發(fā)生改變：出現(xiàn)異常表達或表達減少乃至缺失［9］。

CK7 是一種堿性的Ⅱ型細胞角蛋白，在許多腺上皮和移行上皮表達，同時作為一種中間絲，在細胞質(zhì)與其他輔助蛋白結(jié)合形成致密斑，維持上皮細胞的完整性［10］。CK7 多數(shù)表達在上皮腫瘤中，除了在宮頸鱗癌表達呈陽性，其他部位的鱗狀細胞癌CK7表達多呈陰性［11］。

HUANG 等［12］研究指出LSIL 中CK7 陽性與進展為HSIL 的風險增加有關(guān)。CAO 等［13］研究分析CK7在LSIL 中的表達，發(fā)現(xiàn)CK7 在LSIL 組、HSIL 組的表達率分別為48.6%、78.6%，病變等級與CK7 表達呈正相關(guān)（P=0.007），且CK7陽性和CK7陰性患者隨訪后的病變進展率顯著不同（分別為50% 和80.8%，P=0.022）,支持CK7 是LSIL 臨床預后的預測指標。其他國內(nèi)學者的實驗結(jié)果有著相似的結(jié)論：王維俊等［14］研究結(jié)果顯示，CK7 表達在LSIL 組中以弱陽性為主，在HSIL 組中CK7 表達范圍與強度明顯增加（P＜0.05）；潘嬙微等［15］研究結(jié)果顯示CK7在LSIL組、HSIL 組、SCC 組中的表達率分別是20%、58%、80%，隨著宮頸病變級別越高，CK7表達率越高，但宮頸病變不表達CK7，可能意味著消退或持續(xù)存在但不進展。本研究發(fā)現(xiàn)，CK7在LSIL 及HSIL 組表達的規(guī)律與前述研究一致。在表達模式方面，CK7 在LSIL 組中呈斑片狀陽性（50%）、彌漫陽性（50%）；在HSIL組、SCC 組中的表達主要呈彌漫陽性。CK7 的表達主要分布于上皮細胞的表皮層，隨著病變級別的增高，CK7 染色沿上皮細胞的表皮層向下延伸至基底層，呈現(xiàn)一種自上而下的染色模式。該結(jié)果支持通過檢測CK7在不同級別子宮上皮內(nèi)病變中的表達水平和表達模式，可以作為預測宮頸病變是否發(fā)生進展的評估手段。然而，目前對于CK7 陽性的SCJ 細胞和表皮層細胞參與宮頸癌形成的這一相關(guān)機制尚不清楚。有研究提示，CK7 表達與HPV 感染有關(guān)，HR HPV 感染的SCJ細胞誘導CK7陽性細胞增殖，是形成宮頸癌組織的前體細胞［6］。在HPV感染宮頸細胞之后，殘留的胚胎SCJ 細胞可能在炎癥或損傷過程中遷移到鄰近的鱗狀細胞中，此時CK7 陽性細胞化生或異常增生向下增殖擴張，類似Barrett 食管的病變模式［16］。

目前關(guān)于CK19 在子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌的研究少有報道。CK19 是一種酸性的Ⅰ型細胞角蛋白，但是與所有其他中間絲蛋白的不同之處在于其不顯示羧基末端的非α 螺旋尾結(jié)構(gòu)域，編碼CK19 的基因也是特例，導致CK19 僅包含5 個內(nèi)含子，它們出現(xiàn)在與其他中間絲蛋白基因中內(nèi)含子位置相對應的位置，盡管CK19可以和其他Ⅰ型細胞角蛋白一樣起到維持上皮細胞的機械穩(wěn)定性和完整性的作用，但在沒有Ⅱ型細胞角蛋白伴侶的情況下，它不會形成典型的中間絲［17］。在正常的細胞逐漸惡變?yōu)榘┘毎倪^程中，CK19 的結(jié)構(gòu)不會發(fā)生改變，保留原先的表達模式，因而CK19成為常用的腫瘤標記物之一。越來越多研究發(fā)現(xiàn)CK19 對于預測腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的重要性，包括甲狀腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等，是腫瘤診斷、治療和預后的有用研究工具［18］。LEE 等［4］研究CK7、CK19 在HSIL、SCC 中的表達及其與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，CK7 是CK19 的伴侶蛋白，兩者在宮頸癌中呈特異表達，CK7、CK19 和宮頸癌這三者之間存在某種關(guān)聯(lián)，但對于CK7、CK19 參與HPV 感染SCJ 而致宮頸癌這一系列變化的發(fā)生機制目前仍不太清楚，他們的研究結(jié)果提示CK7和CK19的表達有助于HPV 感染的宮頸細胞惡性轉(zhuǎn)化。此外，他們還發(fā)現(xiàn)CK19 在HSIL 組、SCC 組的表達率均為100%，但在SCC 組中CK19 陽性的病例中約有1/3 CK7 表達陰性。本研究結(jié)果顯示，與LSIL 組相比，CK19在HSIL組、SCC組中的表達增高，提示CK19與宮頸鱗狀上皮的高級別病變乃至癌變相關(guān)。通過Spearman 秩相關(guān)性分析，CK7 和CK19 在子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌中的表達呈正相關(guān)，提示CK19參與宮頸鱗狀上皮病變過程的作用機制可能與SCJ 有關(guān)。CK19的表達模式是自基底層向上延伸至表皮層，呈現(xiàn)一種自下而上的染色模式，與CK7 正好相反。HPV 首先感染宮頸上皮的基底細胞，基底細胞是鱗狀上皮的儲備細胞，受感染的基底細胞發(fā)生不典型增生，從基底層向表皮層自下而上增殖分化，導致子宮上皮內(nèi)病變甚至宮頸癌的發(fā)生［19］。而CK19 的表達有助于保留干細胞的自我增殖能力。因此，這些結(jié)果支持CK19 與HPV 感染均有可能作用于基底層的儲備細胞。我們觀察到，在宮頸癌前病變和宮頸癌發(fā)生過程中，宮頸上皮同時出現(xiàn)上層表皮細胞表達CK7 陽性和下層基底細胞表達CK19 陽性。盡管CK7是CK19的伴侶蛋白，但兩者沒有共同表達在相同部位的癌組織，可能是由于不同HPV 同時感染SCJ 細胞和基底細胞，導致SCJ 細胞和基底細胞同時發(fā)生癌變［20-21］。目前對于CK7、CK19 與HPV 感染導致宮頸癌前病變甚至宮頸癌這一系列變化過程的相關(guān)機制仍不清楚。

值得注意的是，本研究中CK7 在SCC 組中的表達低于HSIL組，與潘嬙微等［15］研究結(jié)果不一致。有研究表明，CK7 的缺失與早期宮頸癌的不良預后相關(guān)［22］。這提示我們，宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)展至浸潤癌的過程中，CK7 的缺失可能與腫瘤細胞的侵襲性增強有關(guān)，這有待后續(xù)實驗進一步證實。

綜上所述，CK7 和CK19 陽性率在不同級別的宮頸病變演變過程中逐漸上升，與病變程度相一致，二者聯(lián)合檢測可作為預測子宮上皮內(nèi)病變進展的評估指標。