NOX 4對高糖代謝乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用

李雪娜，尹雅芙，杜補林，李亞明

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽　110001)

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NOX 4對高糖代謝乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用

李雪娜，尹雅芙，杜補林，李亞明

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽110001)

摘要：利用2-氟[18F-2]脫氧葡萄糖([18F]fluorodeoxyglucose,18F-FDG)乳腺癌細胞攝取實驗篩選高糖酵解率的乳腺癌細胞；采用基因沉默技術(shù)，降低細胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 (NOX 4)表達；采用免疫印跡方法檢測三組細胞(空白對照組、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組和特異性NOX 4-siRNA轉(zhuǎn)染組)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)相關(guān)分子HIF-1α和TGF-β表達水平；通過細胞侵襲實驗分析三組細胞的侵襲能力差異。結(jié)果顯示,高侵襲力的MDA-MB-231較低侵襲力的MCF-7乳腺癌細胞系具有高糖酵解率(t=10.52,P<0.05)；抑制MDA-MB-231細胞的NOX 4表達，降低了細胞EMT相關(guān)因子HIF-1α、TGF-β表達(P均<0.01)與細胞侵襲能力(t=-8.0,P<0.01)。本研究初步證實NOX 4失活能夠降低高糖代謝乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；氟18-脫氧葡萄糖；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4；腫瘤轉(zhuǎn)移

乳腺癌是威脅人類健康的主要疾病，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的重要原因，腫瘤細胞活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)增加會影響腫瘤轉(zhuǎn)移。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, NOX 4)由細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，主要在成人和胎兒腎臟組織表達。在硬化發(fā)病過程中，NOX 4表達增高使ROS生成增高，引起平滑肌細胞凋亡[1]；氧化的低密度脂蛋白能使動脈內(nèi)皮細胞的NOX 4促進ROS生成[2]。NOX 4在不同腫瘤中表達并與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[3-7]，包括乳腺癌[8]。NOX 4在腫瘤中的表達與腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)性為研究熱點[9-11]，正常細胞生物能量主要依賴線粒體氧化磷酸化，腫瘤細胞能量主要依賴于有氧糖酵解，但NOX 4在高糖代謝腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中的作用尚不明確。近年來，腫瘤線粒體功能障礙與腫瘤生物學(xué)行為以及轉(zhuǎn)移的關(guān)系越來越受關(guān)注。Kozie等[12]發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細胞年齡-衰老模型中，持續(xù)增高NOX 4活性能降低線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的功能。ROS被證實與腫瘤的增殖和侵襲相關(guān)，其產(chǎn)生重要來源是NOX 蛋白和線粒體。線粒體內(nèi)的抗氧化劑在細胞中水平最高，并在維持細胞氧化還原狀態(tài)發(fā)揮重要作用，在疾病情況下，NOX 蛋白能作用于線粒體而影響其氧化還原反應(yīng)。NOX 蛋白主要定位于核周區(qū)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但也存在于質(zhì)膜，并與線粒體有關(guān)[13-16]。Kelly等[17]應(yīng)用線粒體定位信號(MLS)進行示蹤分析，發(fā)現(xiàn)NOX 4蛋白的N端含有MLS，證明NOX 4定位于線粒體上。因此，NOX 4與腫瘤的能量代謝關(guān)系密切。

本研究通過18F-FDG 細胞攝取實驗篩選出高糖代謝的乳腺癌細胞系，探究NOX 4對高糖代謝乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響,為乳腺癌轉(zhuǎn)移機制提供依據(jù)。

1實驗部分

1.1主要材料

人乳腺癌細胞系(MDA-MB-231，MCF-7)：中國科學(xué)院上海細胞庫，細胞接種在含10%胎牛血清、10 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)；NOX 4抗體：Abcam公司；兔抗人TGF-β單克隆抗體、多克隆抗體、HIF-1α兔抗人多克隆抗體：Cell signal公司；羊抗兔IgG-HRP、胰酶：碧云天公司；內(nèi)參抗體 β-actin：WanLei Life Sciences公司；DMEM培養(yǎng)基：美國Invitrogen公司；胎牛血清：美國Hyclone公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)：雙螺旋公司；Transwell小室：美國Corning公司。

1.218F-FDG乳腺癌細胞攝取

按照參考文獻[18]中方法，孵育MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞攝取18F-FDG。分為不同的細胞鋪板密度組：1×105、2×105、5×105、1.0×106；不同的細胞孵育時間組：60、90、120、180 min。確定最佳細胞攝取實驗條件，并篩選高糖酵解的乳腺癌細胞。

1.3siRNA干擾和細胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)siRNA設(shè)計原則，選取人NOX 4 RNA中的特異性核酸片段為靶目標，應(yīng)用Ambion公司iRNA軟件設(shè)計NOX 4的RNAi序列(上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成)。實驗分三組：空白對照組、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組(NC)和特異性siRNA轉(zhuǎn)染組(分三個siRNA序列進行特異性轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染具體方法按照說明書進行。NOX 4 siRNA序列如下：

非特異性siRNA序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

特異性NOX 4-siRNA序列：

1：5’-GCCUCAGCAUCUGUCUUATTUAAGAACAGAUGCUGAGGCTT-3’；

2：5’-CCCUCAACUUCUCAGUGAATTUUCACUGAGAAGUUGAGGGTT-3’；

3：5’-GCCUCUACAUAUGCAAUAATTUUAUUGCAUAUGUAGAGGCTT-3’。

1.4免疫印跡檢測

胰酶消化細胞，離心(4 ℃、1 000 r/min、5 min)，用PBS清洗細胞1次，加入適量M-PER細胞裂解液并吹打均勻，放置冰上裂解30 min，期間間隔混勻，離心(4 ℃、12 000 r/min、15 min)，取上清液，棄去沉淀的細胞碎片。根據(jù)二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒的說明，測定裂解液蛋白濃度。

參照參考文獻[19] 中免疫印跡(Western blot)檢測方法，以β-actin作為內(nèi)參對照，提取細胞總蛋白進行檢測，檢測三組細胞(空白對照組、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組和特異性NOX 4-siRNA轉(zhuǎn)染組)的HIF-1α、TGF-β、NOX 4蛋白表達水平。實驗中一抗為NOX 4抗體(1∶1 000)、HIF-1α(1∶2 000)和TGF-β(1∶2 000)；二抗為羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)。

1.5細胞侵襲實驗

實驗Matrigel膠4 ℃過夜解凍，將Matrigel置冰上后放入超凈臺，用無血清培養(yǎng)基將膠以1∶2稀釋，下室加入800 μL 30% FBS培養(yǎng)液；上室加入200 μL細胞懸液，細胞數(shù)為每孔2×104個。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。0.5%結(jié)晶紫染液染色5 min，在倒置顯微鏡下(200×)對遷移至微孔膜下層的細胞計數(shù)。

1.6統(tǒng)計分析

2實驗結(jié)果

2.118F-FDG 細胞攝取

圖1　MCF-7細胞的18F-FDG攝取率Fig.1　18F-FDG uptake rates of MCF-7 cells

MCF-7和MDA-MB-231在不同細胞鋪板密度，不同18F-FDG孵育時間下18F-FDG放射性攝取率分別示于圖1、圖2。相同細胞攝取實驗條件下(90 min孵育時間、1.0×106細胞計數(shù))，MDA-MB-231放射性攝取率為(32.37±0.81)%ID/g，高于MCF-7的(15.49±5.08)%ID/g，差異具有顯著性(t=10.52，P<0.05)。因此，篩選出高糖酵解乳腺癌細胞系為MDA-MB-231。

圖2　MDA-MB-231細胞的18F-FDG攝取率Fig.2　18F-FDG uptake rates of MDA-MB-231 cells

2.2NOX 4 siRNA 瞬時轉(zhuǎn)染

應(yīng)用三個siRNA序列進行特異性轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞，分為MDA-MB-231細胞、NC細胞、NOX 4-siRNA-1細胞、NOX 4-siRNA-2細胞、NOX 4-siRNA-3細胞。

不同特異性siRNA轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231乳腺癌細胞的NOX 4表達示于圖3。由圖3可知，進行siRNA-2序列轉(zhuǎn)染后，MDA-MB-231細胞NOX 4 表達下降，篩選出NOX 4基因沉默效率高的為siRNA-2細胞系。

圖3　不同乳腺癌細胞NOX 4表達Fig.3　Expression of NOX 4in different breast cancer cells

驗證siRNA-2轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞系的NOX 4基因表達沉默效率，分為MDA-MB-231細胞、NC細胞、轉(zhuǎn)染的NOX 4 siRNA-2細胞。

不同細胞系的NOX 4表達示于圖4，Western blot的灰度定量分析示于圖5。結(jié)果顯示，siRNA-2序列轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細胞NOX 4 表達下降，與未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231相比具有顯著性差異(P<0.01)；NC細胞NOX 4表達與未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231相比無顯著性差異(P=0.76)。

2.3Western blot檢測

不同細胞的HIF-1α與TGF-β表達示于圖6，HIF-1α與TGF-β Western blot 灰度定量分析示于圖7。結(jié)果表明，特異性siRNA轉(zhuǎn)染組細胞HIF-1α蛋白和TGF-β表達低于未轉(zhuǎn)染MDA-MB-231(P均<0.01)，NC細胞HIF-1α和TGF-β表達與MDA-MB-231相比無顯著性差異(P=0.158，P=0.821)，表明特異性siRNA轉(zhuǎn)染抑制NOX 4表達，降低了乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)水平。

a——HIF-1α；b——TGF-β圖6　不同細胞的HIF-1α與TGF-β表達a—HIF-1α；b—TGF-βFig.6　Expression of HIF-1α and TGF-β in different breast cancer cells

a——HIF-1α；b——TGF-β圖7　HIF-1α與TGF-β Western blot 灰度定量分析a——HIF-1α；b——TGF-βFig.7　HIF-1α and TGF-β quantitative analysis of gray scale of Western blot

2.4細胞侵襲

細胞侵襲結(jié)果示于圖8，定量分析示于圖9。結(jié)果顯示，特異性轉(zhuǎn)染NOX 4-siRNA MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)較未轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)顯著性降低(分別為38.6±4.5vs94.6±11.1，t=-8.0,P<0.01)，非特異性轉(zhuǎn)染組NC細胞與未轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)相比無顯著性差異(分別為94.00±13.5vs94.6±11.1，t=-0.06,P=0.71)。

a——MDA-MB-231；b——NC；c——NOX 4-siRNA圖8　細胞侵襲顯微鏡圖(200×)a——MDA-MB-231；b——NC；c——NOX 4-siRNAFig.8　The microscope chart of invasion experimental

圖9　細胞侵襲實驗的定量分析Fig.9　Quantitative analysis of cell invasion assay

3討論

腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生后，通過破壞細胞間的連接、活化金屬蛋白酶改變間質(zhì)環(huán)境、激活與細胞運動能力相關(guān)的Rho通路而獲得更強的細胞遷徙能力。研究引發(fā)EMT的機制對于治療腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要意義。采用免疫印跡方法檢測細胞EMT相關(guān)分子HIF-1α和TGF-β表達水平，結(jié)果顯示，特異性siRNA轉(zhuǎn)染組較對照組乳腺癌細胞HIF-1α、TGF-β表達降低，與Boudreau 等[20]報道的NOX 4依賴ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231的EMT結(jié)果一致。有研究報道，NOX 4通過參與TGF-β和SMAD3驅(qū)動誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生侵襲[21]，TGF-β通過Smad轉(zhuǎn)錄作用直接增加NOX 4蛋白的表達量而使ROS升高；但也有研究提出，EGF因子的加入能抑制TGF-β引起的FAO細胞NOX 4蛋白量升高，但并不能影響Smad的磷酸化水平[22]。

細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，特異性siRNA轉(zhuǎn)染組較對照組乳腺癌細胞的遷徙能力明顯下降，表明在高糖代謝乳腺癌細胞中，NOX 4失活能降低高糖代謝乳腺癌細胞MDA-MB-231的HIF-1α和TGF-β的表達，抑制乳腺癌細胞的侵襲能力，NOX 4可能是高糖代謝乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移治療的重要靶點。

4小結(jié)

通過攝取實驗篩選出高糖酵解乳腺癌細胞系MDA-MB-231；NOX 4-siRNA 瞬時轉(zhuǎn)染實驗篩選出沉默效率高的NOX 4-siRNA-2特異性轉(zhuǎn)染組細胞系，siRNA-2序列轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細胞NOX 4 表達下降，HIF-1α、TGF-β表達降低，乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)顯著性降低。

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Effect of NOX 4 on the Invasion and Metastasis of Breast Cancer Cells with High Glucose Metabolism

LI Xue-na, YIN Ya-fu, DU Bu-lin, LI Ya-ming

(DepartmentofNuclearMedicine,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Abstract:The breast cancer cells with high glucose metabolism were screened by18F-FDG cell uptake experiment. The gene silencing technique was used to reduce NOX 4 expression in cells. The experiment was divided into three groups: control group, the non-specific transfection group and specific transfection group. Western blotting was used to detect differences in the expression of HIF-1α and TGF-β in three groups. The invasion ability of the three groups by transwell cell invasion assay was analyzed. The results showed that MDA-MB-231 breast cancer cells had a higher rate of glycolysis than MCF-7 tumor cells(t=10.52,P<0.05). The expression of HIF-1α and TGF-β and the invasiveness of cells were reduced by inhibiting the level of NOX 4. This study showed that inhibition of NOX 4 expression was able to inhibit the invasion of breast cancer cell with high glucose metabolism.

Key words：breast cancer;18F- FDG; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4; tumor metastasis

收稿日期：2015-12-30;修回日期：2016-02-14

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81271605)；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目 (2012225013)

作者簡介：李雪娜(1980—)，女，遼寧盤錦人，主治醫(yī)師，核醫(yī)學(xué)專業(yè) 通信作者：李亞明，E-mail: ymli2001@163.com

中圖分類號：R817.1

文獻標志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)02-0076-06

doi：10.7538/tws.2016.29.02.0076