烤煙基因型間多元有機(jī)酸含量差異性分析

王國平，王海波，李艷麗，羅成剛，曹建敏，張 玉，馮全福，常愛霞*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.河南省煙草公司三門峽市公司，河南 三門峽 472000；3.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司濟(jì)南雪茄煙制造中心，濟(jì)南 250104）

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烤煙基因型間多元有機(jī)酸含量差異性分析

王國平1，王海波2，李艷麗3，羅成剛1，曹建敏1，張 玉1，馮全福1，常愛霞1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.河南省煙草公司三門峽市公司，河南 三門峽 472000；3.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司濟(jì)南雪茄煙制造中心，濟(jì)南 250104）

摘 要：為了解煙草不同基因型在不同生態(tài)條件下多元有機(jī)酸含量差異性，以52個(gè)不同基因型烤煙種質(zhì)在山東和四川兩個(gè)不同生態(tài)區(qū)試驗(yàn)得到的原煙樣品，利用氣相色譜進(jìn)行了多元有機(jī)酸含量檢測。檢測結(jié)果分析表明，蘋果酸、草酸和檸檬酸是烤煙各基因型的主要多元有機(jī)酸，其中蘋果酸含量占多元有機(jī)酸總量的 75%左右；兩產(chǎn)區(qū)多元有機(jī)酸總量均高于平均值的基因型種質(zhì)有17份，多為國外引進(jìn)品種，兩產(chǎn)區(qū)多元有機(jī)酸總量均低于平均值的基因型種質(zhì)有18份，多為國內(nèi)育成品種，這35個(gè)品種多元有機(jī)酸含量遺傳相對(duì)穩(wěn)定；四川產(chǎn)區(qū)整體上多元有機(jī)酸絕對(duì)含量較低、相對(duì)含量較高，特別是丙二酸、檸檬酸等絕對(duì)含量在所有基因型中普遍較低，丁二酸、草酸、蘋果酸等相對(duì)含量普遍較高，山東產(chǎn)區(qū)則與之相反；基因型和生態(tài)條件對(duì)烤煙多元有機(jī)酸含量均有明顯影響，相對(duì)而言基因型的作用較大。

關(guān)鍵詞：烤煙；多元有機(jī)酸；基因型；產(chǎn)區(qū)

有機(jī)酸是煙草的重要組成部分，不僅在煙草生長過程中對(duì)生理代謝起著重要作用，而且對(duì)煙葉和卷煙制品的品質(zhì)有重要影響［1-2］。因此，了解基因型與環(huán)境對(duì)有機(jī)酸的影響對(duì)于育種以及卷煙工業(yè)原料利用具有重要指導(dǎo)意義。煙草有機(jī)酸通常分為揮發(fā)性酸、半揮發(fā)性酸和非揮發(fā)性酸。揮發(fā)性酸主要是C12以下的低級(jí)脂肪酸和部分芳香酸，在卷煙吸食過程中對(duì)感官的吃味和香氣有良好的作用，如小分子揮發(fā)性有機(jī)酸是香料煙的特征香氣成分［3］。半揮發(fā)性酸主要指C12以上的高級(jí)脂肪酸。非揮發(fā)性酸主要指非揮發(fā)的二元酸、三元酸等多元酸。研究表明，非揮發(fā)性多元有機(jī)酸能調(diào)節(jié)質(zhì)子化和游離態(tài)煙堿的比例，可減輕煙草吸食中的刺激性進(jìn)而影響勁頭和吃味，在煙氣中起平衡作用。如蘋果酸、檸檬酸、草酸等是卷煙加料的常用成分［4-5］，因此，煙葉中多元有機(jī)酸的分析研究對(duì)評(píng)定煙葉品質(zhì)及指導(dǎo)葉組配方具有重要意義。以往曾有人對(duì)不同地區(qū)、不同類型、不同等級(jí)、不同部位、不同栽培和不同陳化條件的煙葉以及卷煙產(chǎn)品中多元酸含量的差異進(jìn)行了研究，也有人對(duì)少數(shù)基因型煙葉多元酸的差異進(jìn)行過比較［6-12］，但尚未見烤煙多基因型間和不同產(chǎn)地生態(tài)條件下進(jìn)行多元酸的差異性比較。本研究選用52個(gè)烤煙基因型分別在山東、四川不同生態(tài)區(qū)種植獲取的煙葉樣品進(jìn)行了多元有機(jī)酸含量檢測和分析比較，進(jìn)一步了解了不同烤煙基因型在不同產(chǎn)區(qū)的多元有機(jī)酸含量差異和特點(diǎn)，可為煙草品質(zhì)育種和卷煙工業(yè)葉組配方利用提供參考。

1　材料與方法

1.1 供試材料

根據(jù)常愛霞等［13］對(duì)烤煙品種系譜遺傳分析結(jié)果，篩選獲得不同親緣系譜分支中的52份烤煙基因型種質(zhì)作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于 2012年在山東諸城和四川西昌兩個(gè)產(chǎn)地進(jìn)行。供試材料采用小區(qū)試驗(yàn)，小區(qū)面積150 m2，行株距為1.2 m×0.5 m。田間栽培管理措施按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行。盛花期打頂，單株留葉18～20片?？竞笤瓱熈羧3F或相當(dāng)?shù)燃?jí)的煙葉樣品1 kg，用于多元有機(jī)酸含量測定。

1.2.2 測定方法 樣品處理：樣品經(jīng)研磨后，稱取1 g粉末置于100 mL錐形瓶中，加入25 mL 10% H2SO4-CH3OH溶液，加入500 μL內(nèi)標(biāo)溶液，搖勻后低速震蕩過夜，進(jìn)行甲酯化反應(yīng)后，濾紙過濾到盛50 mL蒸餾水的250 mL分液漏斗中，搖勻，用二氯甲烷萃取，每次 15 mL，萃取液用無水硫酸鈉干燥，合并3次萃取液，并用10 mL二氯甲烷沖洗無水硫酸鈉，0.45 μm尼龍濾膜過濾后，待測。

氣相色譜條件：6890氣相色譜儀（帶FID檢測器，美國安捷倫公司）；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；色譜柱：HP-FFAP 50.0 m×320 μm×0.50 μm；檢測器溫度：270 ℃；載氣（N2）流量：1.8 mL/min；助燃?xì)饬髁浚嚎諝猓?00 mL/min，氫氣，30 mL/min；尾吹氣（N2）：30 mL/min；分流比：10∶1；柱箱溫度：80～150 ℃（10 ℃/min）～220 ℃（8 ℃/min，保持15 min）；檢測器：火焰離子化檢測器；進(jìn)樣量：1 μL。

2　結(jié)果

2.1 不同基因型與不同產(chǎn)地有機(jī)酸總體含量表現(xiàn)

分析兩產(chǎn)地不同基因型烤煙多元有機(jī)酸含量狀況如表1。從絕對(duì)含量看，山東產(chǎn)地樣品多元有機(jī)酸各成分含量的平均值均高于四川產(chǎn)地，兩產(chǎn)地間平均值差異最大的為檸檬酸。從相對(duì)含量看，山東產(chǎn)地除丙二酸、檸檬酸高于四川產(chǎn)地外，其他3種多元酸低于四川產(chǎn)地。綜合兩個(gè)產(chǎn)地樣品含量結(jié)果，烤煙中主要多元有機(jī)酸是蘋果酸、草酸和檸檬酸，含量最高的均為蘋果酸，占多元酸總含量的75%左右；山東產(chǎn)地不同基因型間草酸和檸檬酸含量平均值基本相當(dāng)，分別占多元酸總含量的10%左右；四川產(chǎn)地檸檬酸含量平均值僅占山東產(chǎn)地的 52.3%；兩產(chǎn)地丙二酸相對(duì)含量平均值差異不大，占多元有機(jī)酸總量的 3.8%左右。

2.2 不同基因型間有機(jī)酸含量的差異

由不同基因型在不同產(chǎn)地多元有機(jī)酸含量測定結(jié)果（表2）可見，在山東產(chǎn)地的52份不同基因型烤煙中，有27份烤煙的多元有機(jī)酸總量超過平均值101.19 mg/g，含量較高的前10位烤煙種質(zhì)依次是Hicks.BL、86-3002、NC95、82-3041、豫煙3號(hào)、K346、By4、G80、大白筋599和K326；多元有機(jī)酸各項(xiàng)指標(biāo)均超過平均值的烤煙有8份，分別為Hicks.BL、86-3002、NC95、82-3041、G80、K326、G28和RG8（具體數(shù)據(jù)未列出）。

表1　兩產(chǎn)區(qū)不同基因型烤煙多元有機(jī)酸含量總體狀況Table 1 Overall condition of multiple organic acid contents of different flue-cured tobacco varieties from two areas

在四川產(chǎn)地的52份不同基因型烤煙中，有25份的多元有機(jī)酸總量超過平均值 81.64 mg/g，有機(jī)酸含量較高的前10位烤煙依次是G28、09-53、NC567、潘圓黃、臺(tái)煙9號(hào)、K346、9201、NC89、NC95、云煙87；多元有機(jī)酸各項(xiàng)指標(biāo)均超過平均值的烤煙有8份，分別為G28、潘圓黃、K346、大白筋599、Hicks.BL、RG8、Coker176、豫煙3號(hào)。

從兩產(chǎn)地對(duì)比分析，兩個(gè)產(chǎn)地多元有機(jī)酸總含量均高于平均值的烤煙有 17份，分別為Hicks.BL、NC95、豫煙3號(hào)、K346、大白筋599、G28、RG8、By 4、中煙100、Coker139、Va116、NC567、9201、龍江925、NC55、云煙87、TI245，其中國外引進(jìn)的基因型種質(zhì)居多；在兩個(gè)產(chǎn)地多元有機(jī)酸含量相對(duì)較低的烤煙有18份，分別為中煙14、CV87、單育2號(hào)、中煙98、龍江911、抗88、中煙103、中煙90、Special 401、V2、中煙15、革新三號(hào)、云煙85、中煙102、翠碧一號(hào)、紅花大金元、RG13、RG17，其中國內(nèi)育成的基因型種質(zhì)居多。以上35份種質(zhì)多元有機(jī)酸含量在不同產(chǎn)地表現(xiàn)相對(duì)一致，多元有機(jī)酸含量的遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較好。其余17份烤煙種質(zhì)在不同產(chǎn)地多元有機(jī)酸含量變異相對(duì)較大，說明這些烤煙種質(zhì)可能對(duì)生態(tài)條件的反應(yīng)較敏感。

2.3 不同產(chǎn)地間相同基因型有機(jī)酸含量的差異

表2　不同基因型烤煙在兩產(chǎn)地多元有機(jī)酸含量 mg/gTable 2 Multiple organic acid contents of different fluecured tobacco varieties from two areas mg/g

從同一基因型烤煙在兩產(chǎn)地多元有機(jī)酸各項(xiàng)指標(biāo)絕對(duì)含量差值（表3）可見，52份種質(zhì)中，草酸含量四川產(chǎn)地高于和低于山東產(chǎn)地的分別有26份種質(zhì)；丙二酸含量除BY4在四川高于山東外，其余51份種質(zhì)在四川產(chǎn)地均低于山東產(chǎn)地；丁二酸含量四川產(chǎn)地高于和低于山東產(chǎn)地的分別有15和37份種質(zhì)；蘋果酸含量四川產(chǎn)地高于和低于山東產(chǎn)地的分別有14和38份種質(zhì)；檸檬酸含量除CV87、龍江911、潘園黃3個(gè)品種在四川高于山東外，其余49份種質(zhì)在四川產(chǎn)地均低于山東產(chǎn)地；多元酸總含量四川產(chǎn)地高于和低于山東產(chǎn)地的分別有12和40份種質(zhì)。這說明生態(tài)條件對(duì)多元酸含量具有較大影響，整體上四川產(chǎn)地多元有機(jī)酸絕對(duì)含量相對(duì)較低，特別是丙二酸、檸檬酸，這可能是四川產(chǎn)區(qū)煙葉的主要特點(diǎn)，山東反之。

表3　同一基因型烤煙在兩產(chǎn)地多元有機(jī)酸絕對(duì)含量差值（四川-山東） mg/gTable 3 Difference of multiple organic acid absolute contents of the same flue-cured tobacco varieties from two areas （Sichuan-Shandong） mg/g

從同一基因型烤煙在兩產(chǎn)地多元有機(jī)酸各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)含量差值（表4）可見，52份種質(zhì)中，草酸相對(duì)含量四川產(chǎn)地高于和低于山東產(chǎn)地的分別有37和15份種質(zhì)；丙二酸相對(duì)含量四川產(chǎn)地高于和低于山東產(chǎn)地的分別有21和31份種質(zhì)；丁二酸相對(duì)含量四川產(chǎn)地高于和低于山東產(chǎn)地的分別有41和11份種質(zhì)；蘋果酸相對(duì)含量四川產(chǎn)地高于和低于山東產(chǎn)地的分別有37和15份種質(zhì)；檸檬酸相對(duì)含量除大白筋599、龍江925這2個(gè)品種在四川高于山東外，其余50份種質(zhì)在四川產(chǎn)地均低于山東產(chǎn)地。這說明整體上四川產(chǎn)地多元有機(jī)酸相對(duì)含量較高，特別是草酸、丁二酸、蘋果酸。山東反之。但檸檬酸四川的相對(duì)含量卻低于山東。

2.4 產(chǎn)地和基因型對(duì)多元有機(jī)酸含量的綜合影響

從同一基因型烤煙在兩產(chǎn)地多元有機(jī)酸絕對(duì)含量差值來看（表 3），草酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、檸檬酸，總多元酸絕對(duì)含量最大差值分別是5.48、1.95、0.31、81.1、17.02、100.21 mg/g；從同一產(chǎn)地不同基因型多元有機(jī)酸的絕對(duì)含量差值看（表1），在山東草酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、檸檬酸，總多元酸絕對(duì)含量最大差值分別是10.27、2.16、0.2、89.2、18.4、111.06 mg/g；在四川草酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、檸檬酸，總多元酸絕對(duì)含量最大差值分別是12.01、1.82、0.48、85.1、14.21、88.01 mg/g?？傮w上看，產(chǎn)地和基因型均對(duì)多元有機(jī)酸絕對(duì)含量有較大影響，從山東產(chǎn)地可以看出，基因型對(duì)煙葉多元酸絕對(duì)含量的影響更大。從同一基因型烤煙在兩產(chǎn)地多元有機(jī)酸相對(duì)含量差值來看（表4），草酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、檸檬酸相對(duì)含量最大差值分別是22.57、3.7、0.38、15.72、15.1個(gè)百分點(diǎn)。從同一產(chǎn)地不同基因型多元有機(jī)酸的相對(duì)含量差值看（表1），在山東草酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、檸檬酸相對(duì)含量最大差值分別是16.87、4.65、0.19、21.41、15.21個(gè)百分點(diǎn)；在四川草酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、檸檬酸相對(duì)含量最大差值分別是28.13、3.93、0.43、29.83、10.71個(gè)百分點(diǎn)?？傮w上看，產(chǎn)地和基因型均對(duì)多元有機(jī)酸相對(duì)含量有較大影響，基因型對(duì)煙草多元有機(jī)酸相對(duì)含量的影響程度相對(duì)更大。

表4　同一基因型烤煙在兩產(chǎn)地多元有機(jī)酸相對(duì)含量差值（四川-山東） %Table 4 Difference of multiple organic acid relative contents of the same flue-cured tobacco varieties from two areas（Sichuan-Shandong） %

3　討論

有機(jī)酸是煙葉品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，對(duì)卷煙吸食品質(zhì)具有重要影響。煙葉中多元有機(jī)酸占煙葉總干重的10%左右，占煙葉總有機(jī)酸含量的70%左右，其中含量最多的是蘋果酸、草酸、檸檬酸等多元有機(jī)酸［14］。本研究結(jié)果與上述一致，而且兩個(gè)產(chǎn)地蘋果酸含量占到總多元有機(jī)酸含量的75%。以往施豐成等［15］曾在河南、四川、重慶、云南4個(gè)產(chǎn)區(qū)對(duì)K326、云煙85、紅大3個(gè)品種煙葉多元有機(jī)酸含量進(jìn)行研究，結(jié)果表明同一產(chǎn)區(qū)品種間多元酸含量差異不明顯，主要原因可能是3個(gè)品種親緣關(guān)系太近造成的，這也進(jìn)一步說明了遺傳基礎(chǔ)（即基因型）對(duì)有機(jī)酸含量具有重要影響。王樹會(huì)等［16］在云南對(duì)8個(gè)烤煙品種有機(jī)酸比較研究中，其中有6個(gè)品種也是本研究供試材料，在本研究四川產(chǎn)區(qū)檢測結(jié)果中，這6個(gè)品種多元酸含量排序，與王樹會(huì)等的研究結(jié)果基本一致?？梢姡蛐蛯?duì)烤煙多元酸含量有較大影響。通過品種選擇或遺傳改良手段可有效調(diào)控?zé)熑~多元有機(jī)酸的含量。

不同生態(tài)地區(qū)的氣候條件差異對(duì)煙草成分含量具有重要影響，施豐成等［13］研究表明，不同產(chǎn)區(qū)間蘋果酸、檸檬酸差異顯著，含量的變化趨勢為：河南＞重慶＞云南和四川。楊虹琦等［15］研究表明，低緯度產(chǎn)區(qū)烤煙中的蘋果酸、檸檬酸和總有機(jī)酸含量顯著低于中緯度產(chǎn)區(qū)和高緯度產(chǎn)區(qū)。由于山東產(chǎn)區(qū)與河南同屬于黃淮煙區(qū)，而且山東產(chǎn)區(qū)緯度高于四川產(chǎn)區(qū)，本研究中的結(jié)果與以往研究基本一致。此外，本研究中，清香型風(fēng)格典型品種翠碧一號(hào)和紅花大金元在四川產(chǎn)區(qū)多元有機(jī)酸含量較低。根據(jù)長期經(jīng)驗(yàn)認(rèn)識(shí)，四川、云南屬于偏清香型風(fēng)格煙葉產(chǎn)區(qū)，而河南、山東屬于偏濃香型風(fēng)格煙葉產(chǎn)區(qū)。因此，蘋果酸、檸檬酸等多元有機(jī)酸含量較低可能是清香型風(fēng)格特色煙葉的特點(diǎn)之一，而多元有機(jī)酸含量較高可能是濃香型風(fēng)格特色煙葉的特點(diǎn)之一。本研究結(jié)果將為卷煙工業(yè)對(duì)不同產(chǎn)區(qū)或風(fēng)格的原料選擇及配方利用提供參考依據(jù)。

4　結(jié)論

蘋果酸、草酸和檸檬酸是烤煙中主要的多元有機(jī)酸，其中蘋果酸占主要部分，決定著多元有機(jī)酸總體含量的高低?；蛐秃蜕鷳B(tài)條件對(duì)烤煙多元有機(jī)酸含量均有影響，相對(duì)而言基因型的影響更大。整體上四川產(chǎn)區(qū)煙葉有機(jī)酸絕對(duì)含量較低、相對(duì)含量較高，而山東反之。整體上國外引進(jìn)品種多元有機(jī)酸含量比國內(nèi)育成品種多，其中Hicks.BL、NC95、G28、K346、RG8、大白筋599等品種可作為高多元有機(jī)酸含量種質(zhì)提供育種利用。

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Comparison of Multiple Organic Acid Contents in Different Flue-cured Tobacco Genotypes

WANG Guoping1，WANG Haibo2，LI Yanli3，LUO Chenggang1，CAO Jianmin1，ZHANG Yu1，F(xiàn)ENG Quanfu1，CHANG Aixia1*
（1. Key Laboratory for Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology，Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Qingdao 266101，China；2. Sanmenxia Branch of Henan Tobacco Corporation，Sanmenxia，Henan 472000，China；3. Shandong Industrial Co.，Ltd. Jinan Cigar Manufacturing Center，Jinan 250104，China）

Abstract:To investigate the difference of multiple organic acid contents in tobacco of different genotypes under two ecological conditions，the multiple organic acid contents in flue-cured tobacco of 52 genotypes from Zhucheng in Shandong and Xichang in Sichuan were determined by gas chromatography. The results showed that malic acid，oxalic acid and citric acid were the major multiple organic acids，especially malic acid which accounted for about 75% of the total amount of multiple organic acids. There were 17 fluecured tobacco varieties whose multiple organic acid contents were higher than the average，most of which were foreign varieties. Most of the 18 flue-cured tobacco varieties with multiple organic acid content lower than the average were internal varieties. The multiple organic acid contents of 35 flue-cured tobacco varieties had good genetic stability. Overall，the absolute contents of multiple organic acids from Sichuan were low and relative contents were high. In particular，the absolute contents of malonic acid，citric acid were low and the relative contents of oxalic acid，malic acid，succinic acid were high for all the tested varieties. Shandong was the opposite of Sichuan. Both genotype and ecological condition significantly affected the multiple organic acid contents in flue-cured tobacco，but the effect of genotype was relatively higher.

Keywords:flue-cured tobacco；multiple organic acid；genotype；growing area

中圖分類號(hào)：S572.01

文章編號(hào)：1007-5119（2016）01-0045-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.008

基金項(xiàng)目：中國煙草總公司科技重點(diǎn)項(xiàng)目“彰顯皖南‘焦甜香’、涼山‘清甜香’風(fēng)格特色的烤煙新品種選育”（110201302003）；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)“煙草增香減害關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（201203091）

作者簡介：王國平：男，在讀碩士，研究方向：分子育種。E-mail：738969794@qq.com。*通信作者，E-mail：changaixia75@126.com

收稿日期：2015-09-22 修回日期：2016-01-25