殼寡糖席夫堿納米銀溶液對煙草花葉病防治及煙葉色素的影響

孫翠紅，徐翠蓮，尤方芳，施守杰，王一丁，趙銘欽*，孫 雙，劉 芳，杜林洳

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州 450002；3.贛州市寧都縣煙草專賣局，江西 贛州 342800）

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殼寡糖席夫堿納米銀溶液對煙草花葉病防治及煙葉色素的影響

孫翠紅1，徐翠蓮2，尤方芳1，施守杰1，王一丁1，趙銘欽1*，孫 雙1，劉 芳1，杜林洳3

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州 450002；3.贛州市寧都縣煙草專賣局，江西 贛州 342800）

摘 要：為開發(fā)防治煙草花葉病的新型藥劑，采用大田試驗(yàn)研究了殼寡糖納米銀溶液、殼寡糖席夫堿納米銀溶液及寧南霉素對煙草花葉病的田間防治效果。結(jié)果表明，殼寡糖和殼寡糖席夫堿的納米銀溶液對煙草花葉病的防治效果均優(yōu)于寧南霉素，以預(yù)防和治療效果分別達(dá)到53.32%、24.95%的殼寡糖席夫堿納米銀溶液為最好，能夠減輕病株葉綠素和類胡蘿卜素含量的下降幅度，增強(qiáng)煙株的光合作用強(qiáng)度，使煙株的抗病性得到提高。殼寡糖及其衍生物的納米銀溶液對煙草花葉病具有較好的防治效果，為今后開發(fā)綠色、高效的抗TMV藥劑提供了新思路。

關(guān)鍵詞：殼寡糖納米銀；殼寡糖席夫堿納米銀；煙草花葉?。环乐涡Ч?；葉綠素

殼寡糖（Chitooligosaccharides，COS）是殼聚糖的降解產(chǎn)物，它是將殼聚糖經(jīng)生物技術(shù)降解而成的相對分子質(zhì)量較低、聚合度為3～10的低聚β-（1，4）-2-脫氧-2-氨基葡萄糖［1］。由于殼寡糖分子中存在著氨基、一級羥基和二級羥基等活性官能團(tuán)，因此這些官能團(tuán)的化學(xué)修飾大大的拓寬了殼寡糖在不同領(lǐng)域的應(yīng)用［2-4］。殼寡糖是植物識別病原真菌入侵的非特異性信號，可以對許多植物顯示出強(qiáng)烈的免疫誘導(dǎo)活性，從而可以激發(fā)植物的抗病基因的表達(dá)［5］，產(chǎn)生能抑制或殺滅病菌的與植物抗病性相關(guān)的物質(zhì)如甲殼素酶、殼聚糖酶、植保素和免疫蛋白質(zhì)［6-8］，已有研究表明［9-10］，殼寡糖可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。

席夫堿是一類具有廣泛生物活性的化合物，其在抑制煙草花葉病毒活性中的研究已有不少報(bào)道［11-12］，我們也報(bào)道了殼寡糖席夫堿對煙草花葉病毒具有較好的抑制作用［13-14］。納米銀是一種新型、綠色、抗菌材料，它具有抗病毒活性［15-16］，殼寡糖衍生物納米銀的抗人體病毒活性和抗煙草花葉病毒活性也已有報(bào)道［17-19］。煙草花葉病不僅對煙葉產(chǎn)量造成很大的損失，還造成了煙葉品質(zhì)的下降，使煙葉等級降低，無法滿足卷煙行業(yè)對優(yōu)質(zhì)卷煙原料的要求，因此急需研究開發(fā)出一種綠色有效的抗煙草花葉病的藥劑。筆者分別以殼寡糖和具有席夫堿結(jié)構(gòu)的新型殼寡糖衍生物合成了其納米銀，并對田間感染煙草花葉病的煙株防治效果進(jìn)行了試驗(yàn)，以期為新型、綠色、高效的抗煙草花葉病藥劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2%的寧南霉素水劑（2% ningnanmycin AS）是德強(qiáng)生物股份有限公司產(chǎn)品；殼寡糖（COS，分子量平均約為5000）來自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸銀（AgNO3），分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。采用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司的TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行紫外分析。

1.2 殼寡糖納米銀溶液（COS-Ag）和殼寡糖席夫堿納米銀溶液（S-COS-Ag）的制備

殼寡糖席夫堿（S-COS）的制備參照文獻(xiàn)［20］，分別將50 mL 1 mg/mL殼寡糖溶液和殼寡糖席夫堿溶液加入100 mL燒杯中，再分別向其中加入5 mL 10 mg/mL的硝酸銀溶液，在80 ℃條件下分別攪拌70、30 min，得到殼寡糖納米銀溶液（COSAg）和殼寡糖席夫堿納米銀溶液（S-COS-Ag）。

1.3 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)田設(shè)在河南省漯河市臨潁縣繁城鎮(zhèn)馬井村，供試品種為中煙100（感普通花葉?。?。該田地連續(xù)3年以上種植煙草，煙草花葉病常年較明顯。試驗(yàn)地地勢平坦、灌溉方便、肥力中等、通風(fēng)向陽，土壤質(zhì)地為砂質(zhì)-粘質(zhì)潮土（其中氯離子28.400 mg/kg，速效鉀99.814 mg/kg，速效磷24.769 mg/kg，pH 6.34，有機(jī)質(zhì)17.095 g/kg，堿解氮77 mg/kg）。4月底移栽，株行距為120 cm×55 cm，每個(gè)處理（小區(qū)）面積533.36 m2，隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，四周設(shè)保護(hù)行。其他管理措施與大田管理一致。

1.4 病情分級標(biāo)準(zhǔn)

煙草花葉病分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［21］。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為T1：稀釋260倍的寧南霉素水劑；T2：質(zhì)量濃度為10 μg/mL的COSAg溶液；T3：質(zhì)量濃度為10 μg/mL的S-COS-Ag溶液；CK：清水（對照）。在大田環(huán)境下進(jìn)行，煙株生長健壯，長勢均勻，自然發(fā)病。試驗(yàn)分為預(yù)防試驗(yàn)和治療試驗(yàn)。

預(yù)防試驗(yàn)：在煙株移栽后15 d選擇沒有發(fā)病的煙田噴灑藥劑，連續(xù)噴藥4次，每次間隔10 d。

治療試驗(yàn)：于2014年5月25號、6月4號、6月14號、6月24號進(jìn)行噴藥。5月25號對試驗(yàn)田進(jìn)行普查，發(fā)現(xiàn)有零星煙草花葉病煙株，6月18號達(dá)到發(fā)病高峰。

在3次噴藥后每7天時(shí)間觀察記載發(fā)病情況，根據(jù)煙草花葉病的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記錄。在5月25號時(shí)，掛牌隨機(jī)選取幾株感染煙草花葉病的煙株，以中部煙葉為研究對象，分別在5月25號、6月4號、6月14號和6月24號取樣（4個(gè)取樣日期分別記作1、2、3、和4次），采用乙醇提取法［22］研究不同處理下煙葉色素含量變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，采用Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2　結(jié)果

2.1 COS-Ag和S-COS-Ag的紫外分析

COS、S-COS、COS-Ag和S-COS-Ag的紫外圖譜掃描曲線如圖1所示，COS在270 nm處有一個(gè)強(qiáng)而窄的吸收峰，與COS相比，S-COS在319 nm處存在著吸收強(qiáng)度較弱的酚亞胺基團(tuán)的吸收峰，COS-Ag在410 nm左右處出現(xiàn)了納米銀粒子的特征等離子共振吸收峰；與 S-COS相比，SCOS-Ag也在410 nm左右處出現(xiàn)了納米銀粒子的特征等離子共振吸收峰；因此，由上面分析可知有納米銀粒子的形成。

2.2 藥劑對煙草花葉病毒的預(yù)防效果

各處理藥劑對感染煙草花葉病毒煙株的預(yù)防效果如表1所示，與對照相比，各個(gè)處理對感病煙株均有較好的抑制作用，且各個(gè)時(shí)期下的病情指數(shù)與對照之間的病情指數(shù)存在著極顯著和顯著性差異；由預(yù)防效果可以看出，以防治效果53.32% 的T3處理（S-COS-Ag處理）為最佳，COS-Ag處理和S-COS-Ag處理對感染煙草花葉病毒的煙株的防治效果均優(yōu)于寧南霉素處理。

2.3 藥劑對煙草花葉病毒的治療效果

圖1　殼寡糖及其衍生物的紫外光譜圖Fig.1 The UV-Vis of COS and its derivatives

由表2所示，各個(gè)處理（對照除外）對感病煙株均有較好的抑制作用，與對照相比，各個(gè)處理下各個(gè)時(shí)期煙株的病情指數(shù)均得到了有效的控制，T1處理與對照之間存在著顯著性差異，T2和T3處理與對照之間的病情指數(shù)存在著顯著性和極顯著性差異；從防治效果可以看出，不同調(diào)查時(shí)期下COS-Ag處理和S-COS-Ag處理對感染煙草花葉病毒的煙株的防治效果均優(yōu)于寧南霉素處理，其防效比寧南霉素處理分別高出了 59.51%、79.76%。故殼寡糖以及其衍生物納米銀對感染煙草花葉病的煙株有很好的抑制作用，尤殼寡糖衍生物納米銀的效果較佳。

表1　藥劑對煙草花葉病毒的預(yù)防效果Table 1 The prevention effect of reagents on TMV

表2　藥劑對煙草花葉病毒的治療效果Table 2 The treatment effect of reagents on TMV

2.4 藥劑對煙株色素的影響

2.4.1 各處理下煙葉葉綠素a和葉綠素b的含量變化 不同處理下煙葉葉綠素a含量的變化如圖2所示，各個(gè)處理下煙葉葉綠素a含量隨著取樣時(shí)間的推進(jìn)逐漸降低，與農(nóng)業(yè)上防治煙草花葉病常用的寧南霉素相比，COS-Ag處理和S-COS-Ag處理下葉綠素降幅較小，尤以S-COS-Ag處理下效果最好。T3處理與對照之間差異性較明顯。因此，S-COS-Ag處理可有效的緩解感染煙草花葉病煙葉葉綠素a的下降幅度。

各個(gè)處理下煙葉葉綠素b含量隨時(shí)間的變化如圖3所示，各個(gè)處理下葉綠素b含量隨時(shí)間變化同葉綠素 a，與對照和寧南霉素處理相比，SCOS-Ag處理下的葉綠素b降幅最?。籗-COS-Ag處理與對照相比存在著顯著性差異。因此，S-COSAg處理可有效的減小感染煙草花葉病煙葉葉綠素b的下降幅度。

圖2　不同處理下煙葉中葉綠素a的含量變化Fig. 2 The changes of the contents of chlorophyll a under different treatments

圖3　不同處理下葉綠素b的含量變化Fig. 3 The changes of the contents of chlorophyll b under different treatments

2.4.2 各處理下煙葉類胡蘿卜素含量的變化 不同處理下煙葉類胡蘿卜素含量隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢（圖4），COS-Ag處理和S-COSAg處理均可有效的緩解類胡蘿卜素含量的下降，尤以S-COS-Ag處理效果最好；T3處理與對照之間差異性較明顯。因此，S-COS-Ag處理在一定程度上對感染煙草花葉病的煙株進(jìn)行光合作用具有一定的保護(hù)作用。

圖4　不同處理下類胡蘿卜素的含量變化Fig. 4 The changes of the contents of carotenoid under different treatments

3　討論

與農(nóng)業(yè)上廣泛使用的寧南霉素相比，殼寡糖納米銀和殼寡糖席夫堿納米銀對大田感染煙草花葉病的煙株具有較好的預(yù)防和治療效果，最大防治效果可分別達(dá)到53.32%、24.95%，這比已報(bào)道的［23-24］顯著提高，因此可對煙株采取以預(yù)防為主、治療為輔的措施，藥劑的防治效果可能與殼寡糖自身或者席夫堿的抗病性有關(guān)，也有可能與納米銀的抗病性有關(guān)［17-18，25-28］。

植物葉片的葉綠素含量與植物的抗病性有著密切的關(guān)系，葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，葉綠素含量高，光合作用相對較強(qiáng)，植物的抗病性增強(qiáng)［29］。研究表明，受到病毒侵染的植物葉綠體受到破壞，葉綠素含量降低，植物的光合電子傳遞活力下降，光合磷酸化作用降低［30］，進(jìn)而植物的抗病性減弱。本研究表明，感病的煙株葉綠素含量隨著時(shí)間的變化表現(xiàn)為下降的趨勢，藥劑處理可有效的緩解葉綠素a和葉綠素b的下降幅度，這可能是因?yàn)樗巹┨幚砜墒狗纸馊~綠素的酶活性降低，從而緩解葉綠素含量的下降。類胡蘿卜素是植物進(jìn)行光合作用不可缺少的光合色素，植物在受到迫害的脅迫下，類胡蘿卜素含量也受到相應(yīng)的影響，進(jìn)而影響植物的光合作用，研究得出，殼寡糖以及其衍生物納米銀可有效的緩解類胡蘿卜素含量的下降幅度。因此，殼寡糖席夫堿納米銀有望成為一種新型農(nóng)藥。

4　結(jié)論

殼寡糖及其衍生物的納米銀溶液在大田誘導(dǎo)煙株抗煙草花葉病方面具有較好的防治效果，這為今后開發(fā)新的抗TMV藥劑提供了新思路。關(guān)于殼寡糖及其衍生物納米銀對 TMV的農(nóng)藥殘留尤其是銀離子殘留量對煙葉氯離子的影響和煙葉品質(zhì)的影響缺乏深入的研究，因此，圍繞上述問題開展相關(guān)研究成為下一步的研究目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

［1］ Zhang H，Du Y G，Yu X J. Preparation of chitooligosaccharides from chitosan by a complex enzyme［J］. Carbohydrate Research. 1999，320∶ 257-260.

［2］ 蔣挺大. 殼聚糖［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：60-219.

［3］ SINGLA A K，CHAWLA M. Chitosan∶ some pharmaceutical aspects update［J］. Journal of Pharmacy and Pharmacology，2001，53（8）∶ 1047-1067.

［4］ FEREIDOON S，JANAK K V A，YOU J J. Food applications of chitin and chitosan［J］. Trends in Food Science & Technology，1999，10（2）∶ 37-51.

［5］ CHEN Y F，ZHAN Y，ZHAO X M，et al. Function of oligochitosan induced protein kinase in tobacco mosaic virus resistance and pathogenesis related proteins in tobacco［J］. Plant Physiology & Biochemistry，2009，47∶724-731.

［6］ XU Q S，DOU J L，WEI P，et al. Chitooligosaccharides induce apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells via up-regulation of Bax［J］. Carbohydrate Polymers，2008，71∶ 509-514.

［7］ JEON Y J，PARK P J，KIM S K. Antimicrobial effects of chitooligosaccharides produced by bioreactor［J］. Carbohydrate Polymers，2001，44∶ 71-76.

［8］ JEON Y J，KIM S K. Production of chitooligosaccharides using an ultrafiltration membrane reaction and their antibacterial activity［J］. Carbohydrate Polymers，2000，41∶ 133-141.

［9］ 裘迪紅，吳漢民. 甲殼低聚糖制備及在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用［J］. 寧波大學(xué)學(xué)報(bào)：理工版，2001，14（2）：60-63.

［10］ ZHAO X M，SHE X P，DU Y G，et al. Induction of antiviral resistance and stimulary effect by oligochitosan in tobacco［J］. Pesticide Biochemistry Physiology，2007，87∶ 78-84.

［11］ 高興文，蔡學(xué)建，宋寶安，等. 4（3H）-喹唑啉酮類Schiff堿的合成與抗煙草花葉病毒活性［J］. 有機(jī)化學(xué)，2008，28（10）：1785-1791.

［12］ 孟凡德，趙全芹，李明霞，等. 銀-氨基酸席夫堿配合物的合成、表征及對煙草花葉病毒抑制作用初探［J］.化學(xué)試劑，2000，22（3）：176-177.

［13］ 楊楠，徐翠蓮，楊國玉，等. 殼寡糖席夫堿金屬配合物的合成及其對煙草花葉病毒的抑制活性［J］. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（1）：31-36.

［14］ 趙龍杰，王瑩，徐翠蓮，等. 殼寡糖衍生物對煙草花葉病的田間防效試驗(yàn)［J］. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，26 （5）：68-71.

［15］ Sun raymond wai-yin，Chen Rong，Chuang Nancy P Y，et al. Silver nanoparticles fabricated in hepes buffer exhibit，cytoprotective activities toward HIV-1 infected cells［J］. Chem Communications，2005∶ 40 （40） 5059-5061.

［16］ Lu Lei，Sun raymond wai-yin，Chen Rong，et al. Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication［J］. Antiviral Therapy，2008，13（2）∶ 253-262.

［17］ Mori Yasutaka，Ono Takeshi，Miyahira Yasushi，et al. Antiviral activity of silver nanoparticle/chitosan composites against H1N1 influenza A virus［J］. Nanoscale research letters，2013，8∶ 93-99.

［18］ Russo E，Gaglianone N，Baldassari S，et al. Preparation，characterization and in vitro antiviral activity evaluation of foscarnet-chitosan nanoparticles［J］. Colloids and Surfaces B∶ Biointerfaces，2014，118∶ 117-125.

［19］ 孫翠紅，徐翠蓮，趙銘欽，等. 殼寡糖及其衍生物抗煙草花葉病毒機(jī)理的初步研究［J］. 中國煙草科學(xué)，2015，36（2）：87-92.

［20］ 楊楠，徐翠蓮，王彩霞，等. 殼寡糖希夫堿配合物的微波合成及結(jié)構(gòu)表征［J］. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27（3）：867-871.

［21］ 楊新成，端永明，王曉霞，等. 青霉菌滅活菌絲體對烤煙漂浮育苗生長和抵抗煙草花葉病的影響［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，28（2）：169-174.

［22］ 李虎林，白青竹，姬文秀，等. 不同類型煙草葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量比較分析［J］. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（3）：153-156.

［23］ 雷呂英. 防治煙草花葉病的藥劑試驗(yàn)［J］. 中國煙草科學(xué)，2002，23（1）：28-29.

［24］ 喻大招，周忠泉，楊振榮，等. 病毒抑制劑防治煙草花葉病田間試驗(yàn)［J］. 煙草科技，2003（8）：46-48.

［25］ Chen Y F，Zhan Y，Zhao X M，et al. Functions of oligochitosan induced protein kinase in tobacco mosaic virus resistance and pathogenesis related proteins in tobacco［J］. Plant physiology and biochemistry，2009 （47）∶ 724-731.

［26］ Gnanadesigan M，Anand M，Ravikumar S，et al. Antibacterial potential of biosynthe-sized silver nanoparticles using Avicennia marina mangrove plant［J］. Applied nanoscience，2012 （2）∶ 143-147.

［27］ Qi L F，Xu Z R，Jiang X，et al. Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticles［J］. Carbohydrate research，2004 （339）∶ 2693-2700.

［28］ Wei D W，Sun W Y，Qian W P，et al. The synthesis of chitosan-based silver nanoparticles and their antibacterial activity［J］. Carbohydrate research，2009（344）∶ 2375-2382.

［29］ Balachandran S，Osmond C B，Daley P F. Diaynosis of the earliest stra-specific interactions between tobacco mosaic virus and chloroplastes of tobacco leaves in vivo by means of chlorophyll fluorescence imagng［J］. Plant Physiology，1994，104（3）∶ 1059-1065.

［30］ 郭興啟，溫孚江，朱漢城. 煙草感染馬鈴薯 Y病毒（PVY）后光合作用的變化規(guī)律［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2000，26（1）：75-78.

The Control Efficiency of COS-Ag to TMV in Tobacco and Its Effect on Tobacco Pigment

SUN Cuihong1，XU Cuilian2，YOU Fangfang1，SHI Shoujie1，WANG Yiding1，ZHAO Mingqin1*，SUN Shuang1，LIU Fang1，DU Linru3
（1. National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center，College of Tobacco，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2. College of Science Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；3. Ningdu Tobacco Monopoly Bureau，Ganzhou，Jiangxi 342800，China）

Abstract:In order to develop a new kind of green and high efficiency agent against tobacco mosaic virus （TMV），chitooligosaccharides silver nanoparticles （COS-Ag） solution and chitooligosaccharides schiff base silver nanoparticles （S-COS-Ag）solution were synthesized and tested for their control efficiency on TMV in the field. The results showed that not only COS-Ag solution had good control efficiency on TMV，but also the solution of S-COS-Ag. The S-COS-Ag solution was better than COS-Ag solution. The prevention and treatment effect of S-COS-Ag solution on TMV was up to 53.32% and 24.95% in the field，respectively. The SCOS-Ag solution could inhibit the decrease of chlorophyll content and carotenoid content，with the intensity of photosynthesis enhanced at the same time. As a result，the resistance of tobacco was improved. Therefore，chitooligosaccharides silver nanoparticles （COS-Ag） solution can improve the resistance of tobacco to TMV.

Keywords:chitooligosaccharides silver nanoparticles（COS-Ag）；chitooligosaccharides schiff base silver nanoparticles（S-COS-Ag）；tobacco mosaic virus（TMV）；control efficiency；chlorophyll

中圖分類號：S435.72

文章編號：1007-5119（2016）01-0061-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.011

基金項(xiàng)目：河南省煙草公司重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目“預(yù)防煙草病毒病的新型生物制劑應(yīng)用技術(shù)與示范”［HYKJ201015］，“預(yù)防煙草花葉病毒病的生物制劑納米增效研究”［HYKJ201307］

作者簡介：孫翠紅（1988-），女，碩士，主要從事煙草化學(xué)研究。E-mail：13838144121@163.com。*通信作者，E-mail：zhaomingqin@126.com

收稿日期：2015-05-20 修回日期：2016-01-21