NtC3H基因?qū)煵蓊慄S酮及綠原酸合成的影響

李 洋，唐雪冰，李曉峰，李 明，儲(chǔ)昭輝，丁新華*

（1.作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018；2.黑龍江煙草工業(yè)有限責(zé)任公司海林卷煙廠，黑龍江 海林 157100）

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NtC3H基因?qū)煵蓊慄S酮及綠原酸合成的影響

李 洋1，唐雪冰2，李曉峰2，李 明1，儲(chǔ)昭輝1，丁新華1*

（1.作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018；2.黑龍江煙草工業(yè)有限責(zé)任公司海林卷煙廠，黑龍江 海林 157100）

摘 要：為驗(yàn)證NtC3H是否參與煙草中類黃酮和綠原酸等次生代謝物質(zhì)的合成，構(gòu)建了pCXSN∶∶NtC3H超量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將NtC3H基因轉(zhuǎn)入野生型煙草三生煙，并通過HPLC檢測轉(zhuǎn)基因煙草中綠原酸以及蘆丁、山奈酚蕓香苷等類黃酮的含量變化。結(jié)果顯示，與野生型三生煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中綠原酸及蘆丁的含量最高，分別提高了3.6倍和6.1倍，山奈酚蕓香苷含量提高了24.6倍。研究結(jié)果證實(shí)了NtC3H基因參與煙草中類黃酮和綠原酸等次生代謝物質(zhì)的合成。

關(guān)鍵詞：煙草；NtC3H基因；綠原酸；類黃酮

細(xì)胞色素P450（cytochrome，CYP450）是一類存在一個(gè)由半胱氨酸和含鐵血紅素組成的活性中心的酶類家族［1-2］。對-香豆酸 3-羥化酶（pcoumarate 3-hydroxylase，C3H）屬于細(xì)胞色素P450家族，催化對-香豆酰莽草酸/奎寧酸到咖啡酰莽草酸/奎寧酸C3位置的羥基化反應(yīng)，決定木質(zhì)素單體的碳源流向，并控制植物生長過程中木質(zhì)素不同單體的組成［3-5］。超量表達(dá)煙草NtC3H基因?qū)煵葜芯G原酸及蘆丁、山奈酚蕓香苷等次生代謝物質(zhì)積累的影響，目前鮮有報(bào)道。

次生代謝物質(zhì)在植物對環(huán)境脅迫和病蟲害的防御過程中起到重要作用［6-8］。此外，植物次生代謝物質(zhì)對人類抗氧化、延緩衰老、抗擊癌癥以及預(yù)防心腦血管疾病等方面也存在重要作用［9-11］。分析煙草中NtC3H基因超量表達(dá)對煙草次生代謝物質(zhì)含量的影響，是研究煙草次生代謝合成機(jī)制的有效方式，同時(shí)也可作為提高煙草葉片中營養(yǎng)物質(zhì)含量及煙草抗逆性的研究基礎(chǔ)。本研究對煙草NtC3H基因在煙草次生代謝途徑中的作用做了初步探討。

1　材料與方法

1.1 材料

煙草品種三生煙（Nicotiana tabacum cv. samsun）及其轉(zhuǎn)基因煙草T0和 T1代均在培養(yǎng)室進(jìn)行，培養(yǎng)室條件如下：培養(yǎng)溫度25 ℃；光暗周期16 h/8 h；相對濕度（70±10）%。待煙草植株生長至8葉期，取中部葉片進(jìn)行檢測。

試驗(yàn)用菌株：大腸桿菌Escherichia coli DH5ɑ，農(nóng)桿菌LBA4404，以及含有35S啟動(dòng)子的真核超量表達(dá)載體pCXSN均由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。DNA聚合酶LAmp-Taq、反轉(zhuǎn)錄試劑及試劑盒購自康為生物公司，DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA Biotek公司，限制性內(nèi)切酶Xcm I和T4 DNA連接酶等均購自NEB公司。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成，DNA測序由華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 NtC3H的克隆 按照 Trizol（Invitrogen）說明書中描述方法提取煙草葉片總 RNA，1.5 μg上述總RNA用DNaseI（NEB，美國）37 ℃處理15 min，75 ℃放置10 min，去除基因組DNA后以其為模板進(jìn)行第一鏈NtC3H cDNA的合成，反應(yīng)條件如下：在上述除去基因組的 RNA中加入1.5 μL oligo（dT）15寡聚引物，70 ℃反應(yīng)10 min后冰上急速冷卻2 min。加入5×M-MLV Buffer，1.5 μL dNTP（10 μM），0.5 μL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV （Invitrogen，USA），最后加入DEPC水補(bǔ)充至20 μL。42 ℃條件下反應(yīng)時(shí)間為1 h，70 ℃處理15 min得到cDNA第一鏈產(chǎn)物。以上述反應(yīng)得到的cDNA為模板，根據(jù)NCBI［12］上煙草NtC3H基因序列（GeneBank DQ350326）和EST序列特征，設(shè)計(jì) NtC3H基因擴(kuò)增引物 NtC3HF1：5?-ATGT ACTCTCATAGGTCAAAAGT-3?和NtC3HR1：5?-TTACATATCCACTGGCACAC-3?，選取高保真DNA聚合酶LAmp（康為，北京）對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：20～50 ng模板，10×PCR緩沖液，4 μL dNTPs（2.5 mM），1 μL引物（10 μM），1 UDNA聚合酶，最后加入滅菌雙蒸水補(bǔ)充至50 μL。PCR具體反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s（30～60 s/kb速度）循環(huán)數(shù)35；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 NtC3H表達(dá)載體的構(gòu)建 通過限制性內(nèi)切酶Xcm I（NEB，美國）對超量表達(dá)載體pCXSN進(jìn)行酶切，對酶切后載體進(jìn)行酶的滅活和純化。將通過高保真聚合酶擴(kuò)增到的NtC3H基因片段連接到純化后的表達(dá)載體上，形成煙草超量表達(dá)轉(zhuǎn)化載體pCXSN∶∶NtC3H轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ɑ，挑白斑擴(kuò)繁后用菌液PCR的方法進(jìn)行初篩，挑選陽性克隆送出測序。經(jīng)驗(yàn)證測序結(jié)果與NCBI上煙草C3H基因序列（GeneBank DQ350326）一致后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化 將已構(gòu)建好的超量表達(dá)載體 pCSXN∶∶NtC3H 通過農(nóng)桿菌（LBA4404）介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法［13］，轉(zhuǎn)入受體材料三生煙草的葉片。待轉(zhuǎn)基因煙草根系在生根培養(yǎng)基中發(fā)育良好后，移栽到土壤中。采用CTAB［14］法提取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組 DNA，以 35S啟動(dòng)子內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物 35SF：5?-ACGCACAATCCCACTATCCTT-3?和基因序列內(nèi)部設(shè)計(jì)的引物 NtC3HR1：5?-TTACATATCC ACTGGCACAC-3?組合進(jìn)行PCR陽性檢測。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，擴(kuò)增出1500 bp左右片段，為陽性植株。

1.2.4 類黃酮提取和HPLC測定 取轉(zhuǎn)基因及野生型煙草葉片用液氮研磨至粉末狀，各取 0.3 g，3 mL 100%色譜甲醇-20 ℃提取2 h，每15分鐘振蕩1次。對提取物進(jìn)行4 ℃、10000 rpm離心2 min，上清經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶，取10 μL濾液用于 HPLC分析，按照 Li［15］等設(shè)置HPLC條件。標(biāo)準(zhǔn)品為綠原酸（購自Sigma），蘆?。ㄙ徸?Sigma），山奈酚蕓香苷（購自Extrasynthese）。

2　結(jié)果

2.1 NtC3H基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

按照 NCBI中提供的三生煙草中 NtC3H （GeneBank DQ350326）已知序列設(shè)計(jì)引物，以三生煙草葉片cDNA為模板，通過高保真DNA聚合酶PCR擴(kuò)增獲得長為1562 bp的清晰目標(biāo)條帶（圖1），對獲得片段進(jìn)行切膠回收。將Xcm I酶切后的pCXSN載體與切膠回收后片段相連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ɑ，挑白斑擴(kuò)增繁殖過夜后用菌液PCR的方法進(jìn)行初篩，并挑選3個(gè)陽性克隆提取質(zhì)粒，通過載體上啟動(dòng)子引物35SF和基因擴(kuò)增引物NtC3HR1 進(jìn)行PCR陽性驗(yàn)證（圖2），將驗(yàn)證成功的陽性質(zhì)粒送出測序。所獲測序結(jié)果與目標(biāo)序列比對，二者序列比對一致，證明成功克隆到三生煙草中NtC3H的完整基因序列。

圖1　NtC3H擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 Cloning electrophoresis pattern of NtC3H

2.2 轉(zhuǎn)NtC3H基因煙草的獲得

將測序成功的大腸桿菌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LAB4404。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法［13］，轉(zhuǎn)入受體材料三生煙草的葉片獲得轉(zhuǎn)NtC3H基因煙草植株，進(jìn)一步通過PCR的方法驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株。共獲得12棵轉(zhuǎn)基因材料，其中有9棵擴(kuò)增到了目標(biāo)基因序列，確認(rèn)為陽性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為75%（圖3）。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草葉片類黃酮和綠原酸含量檢測

待轉(zhuǎn)基因陽性及野生型煙草長到8葉期，參照 Li［15］等的方法用 HPLC檢測了 3種物質(zhì)的含量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)NtC3H基因的煙草葉片中綠原酸、蘆丁及山奈酚蕓香苷的含量都有較為明顯的提高（圖4，表1）。

與野生型相比，轉(zhuǎn)NtC3H基因的煙草葉片中綠原酸的含量提高了 0.3～3.6倍，最高含量為1167.1 μg/g（鮮重）；蘆丁的含量提高了0.7～6.1倍，最高含量為177.3 μg/g（鮮重）；山奈酚蕓香苷含量提高了1.2～24.6倍，最高含量達(dá)到了302.6 μg/g（鮮重），均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型煙草（圖4，表1）。

圖2　NtC3H質(zhì)粒檢測圖Fig. 2 NtC3H verification by plasmid PCR

圖3　T0代NtC3H轉(zhuǎn)基因煙草植株陽性檢測Fig. 3 Positive detection of transgenic tobacco in T0generation

表1　轉(zhuǎn)基因煙草T0代葉片中次生代謝物質(zhì)含量Table 1 Quantification of main secondary metabolites in the T0generation of NtC3H-expressing tobacco and wild-type （SS） leaves

圖4　T0代轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草葉片中次生代謝物質(zhì)含量HPLC檢測Fig. 4 HPLC analysis of methanol extracts from leaves of wild-type and NtC3H-expressing T0generation plants

在PCR檢測陽性的植株中選擇T0代3個(gè)株系，編號(hào)為（1，2和5），進(jìn)行T1代陽性檢測，并對陽性植株葉片混合后進(jìn)行HPLC檢測，測定上述3種物質(zhì)含量。轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株綠原酸及山萘酚蕓香苷含量與T0代基本一致，蘆丁含量略高于T0代，說明NtC3H轉(zhuǎn)基因煙草高含類黃酮及綠原酸等次生代謝物質(zhì)的優(yōu)勢可以穩(wěn)定遺傳（圖5，表2）。

圖5　轉(zhuǎn)基因煙草T1葉片中次生代謝物質(zhì)含量Fig. 5 HPLC analysis secondary metabolites contents of NtC3H transgenic tobacco leaves in T1generation and control

表2　T1代轉(zhuǎn)基因煙草葉片中次生代謝物質(zhì)含量Table 2 Quantification of main secondary metabolites in the T1generation of NtC3H-expressing tobacco and wild-type （SS） leaves

3　討論

對-香豆酸 3-羥化酶（C3H）屬于細(xì)胞色素P450單氧化酶，催化苯丙烷苯環(huán)C3位置的羥基化反應(yīng)，決定了木質(zhì)素代謝過程中H單體向G/S單體轉(zhuǎn)化的碳源流向，近年來得到廣泛驗(yàn)證［3-5］。在煙草植株中，通過超量表達(dá)載體將煙草自身NtC3H基因進(jìn)行超量表達(dá)，通過分析煙草中3種次生代謝物質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因煙草中綠原酸，蘆丁及山萘酚蕓香苷含量均提高數(shù)倍，這種含量的提高在后代中穩(wěn)定遺傳。這種變化很可能是由于C3H在次生代謝途徑中起到的作用不僅僅是調(diào)節(jié)木質(zhì)素的合成過程，也同時(shí)對綠原酸，蘆丁及山萘酚蕓香苷所在的合成途徑中其他相關(guān)酶的表達(dá)產(chǎn)生了影響［16］，促進(jìn)其在煙草植株體內(nèi)的累積。

已經(jīng)證實(shí)，在次生代謝物質(zhì)中具有代表性的類黃酮類物質(zhì)在植物對環(huán)境脅迫、昆蟲及病原微生物等的防御過程中起到重要作用［6-8］。另外科學(xué)家們也已經(jīng)證實(shí)，長期服食綠原酸以及蘆丁等次生代謝物質(zhì)對人類的健康非常有益，可以降低許多疾病發(fā)生的概率，如心腦血管疾病，癌癥等［17］。另外次生代謝物質(zhì)也提供豐富的香料及工業(yè)原料。在煙草中，綠原酸、蘆丁及山奈酚蕓香苷均是主要的酚類物質(zhì)，經(jīng)過燃吸均會(huì)裂解產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)從而對煙氣香味產(chǎn)生直接影響［18-20］。

野生煙草中3種主要的次生代謝物質(zhì)含量均不高，NtC3H作為煙草中自身含有的一種羥化酶，在煙草中超量表達(dá)后，上述物質(zhì)均有了明顯的提高，這既可以幫助我們提取豐量的上述次生代謝物質(zhì)，也可以幫助提高煙草對多種蟲害，病害等逆境的抗性，并提高煙氣香味對香煙品質(zhì)進(jìn)行改良。

4　結(jié)論

本研究通過超量表達(dá)煙草的NtC3H基因，獲取多株轉(zhuǎn)基因陽性植株，并分析了T0及T1代轉(zhuǎn)基因煙草中蘆丁、山奈酚蕓香苷和綠原酸等次生代謝物質(zhì)含量的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中綠原酸的含量最高提高了 3.6倍，最高含量達(dá)到1167.1 μg/g（鮮重）；蘆丁的含量最高提高了6.1倍，最高含量達(dá)到177.3 μg/g（鮮重）；山奈酚蕓香苷含量最高提高了24.6倍，最高含量達(dá)到了302.6 μg/g （鮮重）；并且這種優(yōu)勢可在后代中穩(wěn)定遺傳。

本研究為深入了解NtC3H在多個(gè)不同代謝途徑中的作用和功能提供了研究基礎(chǔ)。與此同時(shí)，提高煙草本身次生代謝物質(zhì)的研究有限，通過對次生代謝物質(zhì)合成基因的研究有助于了解次生代謝各個(gè)途徑之間的關(guān)聯(lián)性及合成機(jī)理，并能夠在生產(chǎn)實(shí)際中提高煙草對多種逆境的抗性，同時(shí)為提高煙氣品質(zhì)、減輕吸煙對健康的負(fù)面影響提供了理論支持。

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The Influence of NtC3H on the Synthesis of Flavonoids and Chlorogenic Acid in Tobacco

LI Yang1，TANG Xuebing2，LI Xiaofeng2，LI Ming1，CHU Zhaohui1，DING Xinhua1*
（1. State Key Laboratory of Crop Biology，Shandong Provincial Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Shandong Agricultural University，Tai'an，Shandong 271018，China；2. Heilongjiang Tobacco Industry Co.，Ltd.，Hailin Cigarette Factory，Hailin，Heilongjiang 157100，China）

Abstract:To test whether NtC3H participates in the biosynthesis of flavonoids，and chlorogenic acid （CGA） in tobacco and increases the contents of these secondary metabolites，we constructed the over-expression vector pCXSN∶∶NtC3H and introduced it into Nicotiana tabacum var. samsun via Agrobacterium-mediated transformation. The concentrations of the different secondary metabolites including CGA，rutin，and kaempferol rutinoside in leaves of wild-type and transgenic lines were determined by HPLC. Compared to wild-type samsun tobacco，in transgenic tobacco the concentrations of CGA were increased 3.6-fold，rutin and kaempferol rutinoside were increased 6.1- and 24.6-fold respectively. These results suggested that NtC3H positively regulated the synthesis of flavonoids and CGA in tobacco.

Keywords:tobacco；NtC3H；chlorogenic acid；flavonoids

中圖分類號(hào)：S572.03

文章編號(hào)：1007-5119（2016）01-0008-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.002

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“富含類黃酮及咖啡酰奎尼酸番茄品種的培育”（863，2010AA10Z103）

作者簡介：李 洋（1988-），女，博士研究生，研究方向?yàn)橹参锎紊x調(diào)控。E-mail：younuowanwan@126.com*通信作者，E-mail：xinhuading@hotmail.com

收稿日期：2015-08-31 修回日期：2015-10-18