重慶豐都煙區(qū)田間煙草病毒病及其Dot-ELISA檢測(cè)

時(shí)洪偉，劉陳晨，李 科，孫 淼，代先強(qiáng)，馬冠華，青 玲*（.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，植物病害生物學(xué)重慶市高校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 北碚 40076；.重慶市豐都縣煙草專賣局，重慶 豐都 404000）

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重慶豐都煙區(qū)田間煙草病毒病及其Dot-ELISA檢測(cè)

時(shí)洪偉1，劉陳晨1，李 科1，孫 淼1，代先強(qiáng)2，馬冠華1，青 玲1*
（1.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，植物病害生物學(xué)重慶市高校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 北碚 400716；2.重慶市豐都縣煙草專賣局，重慶 豐都 404000）

摘 要：為明確重慶市豐都煙區(qū)田間煙草病毒病的發(fā)生情況，開展了病毒病調(diào)查，并于還苗期、伸根期、旺長(zhǎng)期和成熟期共采集病毒病樣品117份，利用TMV、CMV、PVY、TEV、PVX、TuMV和BBWV-2等7種病毒的特異性抗體對(duì)其進(jìn)行Dot-ELISA檢測(cè)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，病毒病癥狀主要包括花葉、畸形、壞死斑、脈壞死、矮化和蝕紋等類型。9個(gè)調(diào)查點(diǎn)煙草病毒病的發(fā)病率在28%～84%，病情指數(shù)最低為6.67，最高為60.89。Dot-ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，還苗期樣品未檢出病毒；伸根期沒有檢測(cè)到PVX；旺長(zhǎng)期和成熟期均檢測(cè)到7種病毒，其中TMV和CMV的檢出率較高，其次為TuMV和PVY，PVX的檢出率較低。此結(jié)果表明，煙草病毒病在豐都煙區(qū)發(fā)生較普遍，且TMV和CMV為田間煙草病毒病的優(yōu)勢(shì)毒源。

關(guān)鍵詞：煙草病毒病，病毒種類，Dot-ELISA檢測(cè)

煙草病毒病是全世界煙草種植區(qū)的重要病害之一，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)。世界范圍內(nèi)常見的煙草病毒種類約 20余種，主要包括煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mo saic virus， CMV）、煙草曲莖病毒（Tobacco curly shoot virus， TbCSV）、中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（Tomato yel low leaf curl Chi na virus， TYLCCNV）等［1-5］。隨著氣候、耕作方式的改變，煙草病毒病的危害程度和侵染煙草的病毒種類也在不斷發(fā)生變化，在我國(guó)廣西、云南和重慶等煙區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)了一些新的病毒種類，如番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV）、蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus， TuMV）和番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus， ToMV）［2，6-12］。

近年來，重慶煙區(qū)煙草病毒病的發(fā)生呈逐年加重的趨勢(shì)，且病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量下降，嚴(yán)重制約煙葉生產(chǎn)發(fā)展。已有報(bào)道利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）從重慶武隆地區(qū)煙草上檢測(cè)到CMV、TMV、TuMV及馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y， PVY）4種病毒；從重慶黔江、酉陽(yáng)、南川及涪陵地區(qū)煙草上鑒定到 CMV、TuMV、TMV、PVY及ToMV 5種病毒；從涪陵、彭水、萬(wàn)州、黔江、武隆和酉陽(yáng)地區(qū)檢測(cè)到CMV、PVY、TMV、TEV（Tobacco etch virus， TEV）、TuMV、BBWV-2（Broad bean wilt virus 2， BBWV-2）和馬鈴薯X病毒（Potato virus X， PVX）等7種病毒［2，12-14］。豐都縣是重慶市重要的煙草種植區(qū)，目前該地區(qū)煙草病毒病發(fā)生情況還沒有相關(guān)報(bào)道。為了摸清該煙區(qū)煙草病毒病發(fā)生情況及煙草病毒種類，以及病毒復(fù)合侵染情況，分別于煙草還苗期（從移栽到成活）、伸根期（從成活到團(tuán)棵）、旺長(zhǎng)期（從團(tuán)棵到現(xiàn)蕾）和成熟期（從現(xiàn)蕾到煙葉采收結(jié)束）對(duì)豐都煙區(qū)開展了煙草病毒病田間調(diào)查，并利用斑點(diǎn)雜交法（Dot-ELISA）對(duì)田間采集樣本進(jìn)行了檢測(cè)，以期為該地區(qū)煙草病毒病的綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查地點(diǎn)

2013年在重慶市豐都縣7個(gè)鎮(zhèn)的9個(gè)煙葉種植點(diǎn)進(jìn)行田間病毒病害調(diào)查，9個(gè)調(diào)查點(diǎn)分別為南天湖鎮(zhèn)三撫鄉(xiāng)、暨龍鎮(zhèn)回龍場(chǎng)、太平鎮(zhèn)關(guān)山、雙路鎮(zhèn)蓮花村、三壩鄉(xiāng)廂壩、三壩鄉(xiāng)野桃壩、三壩鄉(xiāng)碾場(chǎng)壩、包鸞鎮(zhèn)文家壩和高家鎮(zhèn)方斗山。

1.2 田間調(diào)查及數(shù)據(jù)計(jì)算

于煙草病毒病發(fā)病盛期在豐都縣煙區(qū)9個(gè)調(diào)查點(diǎn)分別選取1塊煙田，采用5點(diǎn)取樣方法，每塊煙田調(diào)查50株，采用GB/T 23222—2008煙草病蟲害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［15］，對(duì)調(diào)查煙株進(jìn)行病害分級(jí)，按如下公式分別計(jì)算病株率和病情指數(shù)：

發(fā)病率/%=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%；

病情指數(shù)=［Σ（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)或葉數(shù)×最高級(jí)值）］×100。

1.3 樣品采集

豐都煙區(qū)的主栽品種為云煙87。在豐都縣高家鎮(zhèn)方斗山調(diào)查點(diǎn)于煙草還苗期、伸根期、旺長(zhǎng)期和成熟期共采集病毒病樣品117份用于檢測(cè)，其中還苗期樣品3份，伸根期樣品38份，旺長(zhǎng)期樣品38份，成熟期樣品38份，于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)抗原和抗體

TMV、CMV、BBWV-2和TuMV相應(yīng)抗原及單克隆抗體由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所周雪平教授惠贈(zèng)，TEV和PVX購(gòu)自ADGEN，PVY的抗原及多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.5 Dot-ELISA檢測(cè)

參考郭思瑤等［16］的方法進(jìn)行Dot-ELISA檢測(cè)。將采集到的煙草樣品每次每份取 0.1g，按 m/v=1g/10 mL分別加1mol/L PBS研磨，8000r/min離心3min，取2 μL上清液點(diǎn)到硝酸纖維素膜（NC膜）上，每個(gè)樣品點(diǎn)3個(gè)點(diǎn)作為重復(fù)。室溫干燥10min后，將NC膜浸入含5%脫脂奶粉緩沖液中，室溫封閉30min。然后將NC膜放入1：5000倍稀釋的單克隆抗體中室溫孵育30～60min，PBST洗膜3～4次，每次3min。將NC膜放入用5%的脫脂奶粉1：8000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG中室溫孵育30～60min；然后PBST洗膜4～5次。顯色底物NBT 66 μL和BCIP 33 μL加到10 mL底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)，待陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)明顯紫色，而陰性對(duì)照呈現(xiàn)淡綠色，空白對(duì)照沒有任何顏色顯示時(shí)終止反應(yīng)（顯色5～20min），隨即在自來水中漂洗一下，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 煙草病毒病田間癥狀

在重慶豐都煙區(qū)9個(gè)調(diào)查點(diǎn)進(jìn)行病毒病調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)田間煙草病毒病癥狀可分為以下6種類型（圖1）：A花葉：葉片局部褪綠黃化，部分顏色變深；B葉片畸形：葉片扭曲皺縮，葉面變窄，葉尖變細(xì)，葉面出現(xiàn)皰斑；C脈壞死：葉脈褐色壞死，癥狀首先從支脈表現(xiàn)，發(fā)展到主脈，嚴(yán)重時(shí)葉片從下到上依次黃化萎蔫，最后整株死亡；D蝕紋：葉面出現(xiàn)點(diǎn)狀白色線條或不規(guī)則環(huán)狀線；E植株矮化：該癥狀常與其他癥狀同時(shí)表現(xiàn)，尤其是和壞死及畸形等癥狀相伴隨；F壞死斑：葉面會(huì)先出現(xiàn)褐色壞死環(huán)斑，可沿主側(cè)脈進(jìn)一步擴(kuò)展呈深褐色閃電狀壞死斑。

圖1 重慶豐都煙草病毒病癥狀Fig.1 Symptoms on tobacco in Fengdu county of Chongqing

2.2 田間病害調(diào)查

在豐都煙區(qū)9個(gè)調(diào)查點(diǎn)共調(diào)查450棵煙株，以株為單位進(jìn)行分級(jí)調(diào)查，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T23222—2008）將煙草花葉病毒病劃分為1、3、5、7和9級(jí)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，450棵煙株中有189棵為0級(jí)，全株無病；70棵為1級(jí)，呈輕微花葉癥狀；56棵為3級(jí)，三分之一葉片呈花葉但不變形；52棵為 5級(jí)，呈花葉且少數(shù)葉片變形；28棵為 7級(jí)，表現(xiàn)側(cè)脈壞死或者二分之一至三分之二葉片呈花葉癥狀；55棵為9級(jí)，全株葉片呈花葉癥狀，嚴(yán)重變形或壞死（表1）。

對(duì)豐都煙區(qū)9個(gè)調(diào)查點(diǎn)煙草病毒病的發(fā)病率進(jìn)行分析（表 1），暨龍鎮(zhèn)回龍場(chǎng)的發(fā)病率最低，為28%，在調(diào)查的50棵煙株中有36棵未發(fā)??；三壩鄉(xiāng)野桃壩發(fā)病率最高，為84%，僅8株未發(fā)病。病情指數(shù)分析表明，南天湖鎮(zhèn)病情指數(shù)最低，僅為6.67；高家鎮(zhèn)方斗山病情指數(shù)最高，為60.89。其他調(diào)查點(diǎn)的病情指數(shù)均低于40。

表1 豐都縣煙草病毒病調(diào)查結(jié)果Table 1 Results of virus disease survey in Fengdu county

2.3 Dot-ELISA檢測(cè)

2.3.1 病毒種類檢測(cè) 利用TMV、CMV、PVY、PVX、TEV、TuMV及BBWV-2等7種病毒的特異性血清對(duì)田間采集的不同生育期的煙草樣品進(jìn)行了Dot-ELISA檢測(cè)（圖2）。結(jié)果表明，煙草還苗期采集的3份樣品均未檢測(cè)到這7種病毒（表2）。在伸根期采集的樣品中，TMV的檢出率最高，為60.53%；其次為 CMV和TuMV，分別 44.74%和36.84%。在旺長(zhǎng)期樣品中，TMV和CMV的檢出率均較高，分別為55.26%和47.37%。在成熟期樣品中，CMV的檢出率最高，為52.63%。

隨著煙草生育期的變化，7種病毒的陽(yáng)性檢出率也有所變化（表2）。其中CMV、PVY和TEV 這3種病毒的陽(yáng)性檢出率隨著時(shí)間推移而上升，且上升幅度較大；TMV和TuMV陽(yáng)性檢出率前期高，到成熟期有所下降，TMV下降為47.37%，TuMV陽(yáng)性檢出率下降幅度較大，從伸根期的36.84%降到5.26%。BBWV-2的檢出率從伸根期開始就沒有發(fā)生變化，PVX到旺長(zhǎng)期已趨于穩(wěn)定。

圖2 煙草樣品的Dot-ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Dot-ELISA result of tobacco samples

表2 煙草不同生育期的病毒種類檢測(cè)Table 2 Detection of virus types infecting tobacco at different growth stages

2.3.2 病毒復(fù)合侵染分析 表3檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在117份樣品中有82份煙草樣品與7種病毒供試血清中的一種或多種發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，其中有 62份煙草樣品檢出兩種或兩種以上病毒的復(fù)合侵染。共有20種復(fù)合侵染類型，其中兩種病毒的復(fù)合侵染有8種類型，占 62.90%；3種病毒侵染有 6種類型，占24.19%；4種病毒侵染有3種類型，占8.06%；5種病毒侵染有2種類型，占3.23%；6種病毒侵染的類型僅1種，為CMV+TMV+PVY+TuMV+ BBWV-2+TEV。在病毒復(fù)合侵染類型中，CMV+TMV所占比例最高，占37.10%。

表3 煙草樣品的病毒復(fù)合侵染類型和比例Table 3 Infection types and percentage of viruses on tobacco

3 討 論

本研究在重慶豐都煙區(qū)9個(gè)調(diào)查點(diǎn)進(jìn)行了煙草病毒病田間調(diào)查和Dot-ELISA檢測(cè)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙草病毒病發(fā)生普遍，但9個(gè)調(diào)查點(diǎn)的發(fā)病程度有所不同。其中，三壩鄉(xiāng)野桃壩發(fā)病率最高，為84%，但由于病株主要集中在1級(jí)和3級(jí)，因而總體發(fā)病較輕；高家鎮(zhèn)方斗山雖發(fā)病率較低，但病株大多為9級(jí)，故發(fā)病程度較嚴(yán)重，病情指數(shù)高達(dá)60.89。

Dot-ELISA是在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）的基礎(chǔ)上以纖維素膜代替聚丙乙烯微量反應(yīng)板而建立的一種免疫檢測(cè)方法。該方法不僅保留了ELISA快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)，而且還可彌補(bǔ)抗原或抗體在載體上包被不牢固等缺點(diǎn)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、被檢樣品用量少、節(jié)約試劑材料等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測(cè)［13］。已有報(bào)道在重慶煙草上檢出TMV、CMV、PVY、PVX、TEV、TuMV 及 BBWV-2等病毒［1，9-11］，本研究運(yùn)用 Dot-ELISA技術(shù)從豐都煙草樣品中也檢出了這7種病毒，其中，TMV和CMV是侵染該地區(qū)煙草的主要病毒種類，屬優(yōu)勢(shì)毒原；PVY、TEV及TuMV為次要病毒種類，PVX及BBWV-2危害較小。且TMV和CMV的復(fù)合侵染所占比例最高，病株表現(xiàn)花葉、葉片皺縮、扭曲等不同癥狀，嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量。

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)煙草病毒病癥狀主要包括花葉、畸形、壞死環(huán)斑、脈壞死和蝕紋等多種類型。在本研究中，將樣品癥狀和Dot-ELISA檢測(cè)結(jié)果相結(jié)合進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示受 PVY單獨(dú)侵染的不同煙株表現(xiàn)出典型花葉、莖及葉脈壞死及葉片皺縮等多種癥狀，說明一種病毒侵染煙草也能引起多種癥狀表現(xiàn)。

結(jié)合田間調(diào)查和檢測(cè)結(jié)果可見，煙草病毒病目前仍是豐都煙草上的重要病害，由于生產(chǎn)上還缺乏有效的防治藥劑，因而需高度重視，加強(qiáng)對(duì)病毒病的田間監(jiān)控，及時(shí)清除病株，并控制介體蚜蟲的數(shù)量，盡可能減少病害造成的損失。本研究雖已明確了TMV、CMV、PVY、PVX、TEV、TuMV及BBWV-2在重慶豐都的發(fā)生、分布和侵染情況，為豐都煙區(qū)病毒病的防治工作提供了依據(jù)，但由于僅應(yīng)用了這7種病毒的供試血清對(duì)樣品進(jìn)行Dot-ELISA檢測(cè)，因而重慶豐都煙草上是否還存在其他病毒種類的侵染還需作進(jìn)一步檢測(cè)。

4 結(jié) 論

重慶市豐都煙區(qū)田間煙草病毒病發(fā)生普遍，癥狀類型多樣，共檢出TMV、CMV、PVY、PVX、TEV、TuMV及BBWV-2等7種植物病毒，其中TMV和CMV為優(yōu)勢(shì)毒源，該地區(qū)應(yīng)以TMV和CMV為主要靶標(biāo)，有針對(duì)性的制定相應(yīng)防控措施。

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Detection of Field Viral Diseases on Tobacco in Fengdu County of Chongqing with the Dot-ELISA Technique

SHI Hongwei1， LIU Chenchen1， LI Ke1， SUN Miao1， DAI Xianqiang2， MA Guanhua1， QING Ling1*
（1.Chongqing Key Laboratory of Plant Disease Biology， College of Plant Protection， Southwest University， Beibei， Chongqing 400716， China； 2.Fengdu Tobacoo Monopoly Administration， Fengdu， Chongqing 404000， China）

Abstract:In order to survey the occurrence of tobacco viral diseases in Fengdu， Chongqing， 117 tobacco leaf samples with viral symptoms were collected at different growth stages （seeding， stem elongation， vigorous growing and mature） and detected with the Dot-ELISA technique using the specific antibodies against 7 viruses including TMV， CMV， PVY， TEV， PVX， TuMV and BBWV-2.Field investigation showed that virus-induced symptoms of tobacco include mosaic， leaf malformation， necrotic rings， vein necrosis，dwarf and etch.The incidence of tobacco virus diseases at nine survey spots is between 28%-84% and the disease index is between 6.67-60.89.The results revealed that no virus was detectable in samples at the seeding stage and PVX was undetectable in samples at the elongating stage.All of the 7 viruses were detected at the late growth stages.Both TMV and CMV had higher detection ratios than those of TuMV and PVY while PVX had the lowest detection ratio.These results showed that tobacco viral diseases commonly occur in Fengdu and TMV and CMV are the prevalent pathogenic viruses.

Keywords:tobacco viral disease； virus types； Dot-ELISA detection

中圖分類號(hào)：S435.72

文章編號(hào)：1007-5119（2016）02-0006-05

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.02.002

基金項(xiàng)目：國(guó)家煙草專賣局項(xiàng)目“全國(guó)煙草有害生物調(diào)查研究”（NY2010060103007）

作者簡(jiǎn)介：時(shí)洪偉（1989-），男，碩士，研究方向：植物保護(hù)。E-mail：honyshi@163.com。*通信作者，E-mail：qling@swu.edu.cn

收稿日期：2015-07-27 修回日期：2015-09-09