秈粳稻基因組295個(gè)InDel標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

初志戰(zhàn)郭海濱曾棟昌劉耀光，*華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 5064；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東廣州 5064

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秈粳稻基因組295個(gè)InDel標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

初志戰(zhàn)1郭海濱2曾棟昌1劉耀光1，*1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東廣州 510642

摘 要：插入/缺失（InDel）分子標(biāo)記具有使用簡(jiǎn)單，結(jié)果清晰可靠的優(yōu)點(diǎn)。本研究通過(guò)比對(duì)粳稻品種日本晴和秈稻品種93-11的基因組序列，在全基因組范圍內(nèi)設(shè)計(jì)了634對(duì)InDel候選標(biāo)記，通過(guò)PCR檢測(cè)比較2種粳稻（日本晴和臺(tái)中65）和2種秈稻（93-11和黃華占）的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)295對(duì)標(biāo)記在2種秈稻間及2種粳稻間均帶型一致，而在秈、粳亞種間有多態(tài)性，因此這套295對(duì)標(biāo)記可以在涉及秈粳亞種的基因定位和分子育種中應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：InDel標(biāo)記；水稻；基因定位

本研究由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（SKL-CUSAb-2013-04）和廣東省自然科學(xué)基金-博士啟動(dòng)項(xiàng)目（2015A030310485）資助。

This study was supported by the Open Fund Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources （SKL-CUSAb-2013-04） and the Natural Science Fund of Guangdong Province-the Launch Program for Doctor （2015A030310485）.

第一作者聯(lián)系方式∶ E-mail∶ chuben@scau.edu.cn

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160314.1444.004.html

自2002年完成水稻基因組測(cè)序后，水稻基因組的研究重心開(kāi)始轉(zhuǎn)向功能基因［1］的鑒定。目前大多水稻基因功能的研究還是以正向遺傳學(xué)為主∶ 先通過(guò)物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)基因突變，再經(jīng)過(guò)構(gòu)建定位群體，利用分子標(biāo)記定位和篩選突變基因。分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記后發(fā)展起來(lái)的一種更理想的遺傳標(biāo)記。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，到目前為止己經(jīng)建立20多種，例如RFLP （restriction fragment length polymorphisms）標(biāo)記、RAPD （random amplified polymorphic DNAs）標(biāo)記、AFLP （amplified fragment length polymorphisms）標(biāo)記等，其中被廣泛用于基因定位的有 SSR （simple sequence repeat）標(biāo)記、InDel （Insertion/Deletion）標(biāo)記和SNP （single nucleotide polymorphisms）標(biāo)記。栽培稻在長(zhǎng)期的栽培馴化過(guò)程中，形成秈稻和粳稻2個(gè)主要的亞種，由于這2個(gè)亞種的農(nóng)藝性狀、生理生化特性及基因組序列存在明顯差異，常被用來(lái)作為構(gòu)建定位群體的雙親。雙親間DNA序列的多態(tài)性是發(fā)展分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。Shen等［2］比對(duì)粳稻（japonica）品種日本晴和秈稻（indica）品種93-11的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)平均每268 bp有1個(gè)SNP，每953 bp有1個(gè)InDel，這2種標(biāo)記均有很高的密度，尤其 SNP分子標(biāo)記在理論上具有極大的潛力，但是目前由于檢測(cè)方法的限制，并未廣泛采用SNP分子標(biāo)記于基因定位尤其是初步定位。SSR標(biāo)記技術(shù)由Moore等于1991年創(chuàng)立［3］，GRAMENE網(wǎng)站提供了2240個(gè)水稻SSR標(biāo)記（http∶//archive.gramene.org/markers/）。在水稻基因組中平均每157 kb有1個(gè)SSR標(biāo)記［4-5］，而平均每10.36 kb有1個(gè)基因［6］，因此SSR分子標(biāo)記密度還遠(yuǎn)未達(dá)到圖位克隆的要求。馮芳君等［7］通過(guò)測(cè)驗(yàn)20對(duì)InDel標(biāo)記和53對(duì)SSR標(biāo)記在46份粳稻和47份秈稻的遺傳多樣性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，InDel標(biāo)記的PCR擴(kuò)增穩(wěn)定性比SSR標(biāo)記好，擴(kuò)增產(chǎn)物非特異條帶少，特異性更好，因此分離效果明顯好過(guò) SSR標(biāo)記。我們的大量應(yīng)用實(shí)踐也表明，InDel分子標(biāo)記具有使用簡(jiǎn)單和電泳結(jié)果比 SSR標(biāo)記清晰可靠的優(yōu)點(diǎn)。

本研究通過(guò)比對(duì)日本晴和93-11的全基因組序列，以缺失5～20 bp為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)634對(duì)InDel候選標(biāo)記，以期找出覆蓋全基因組的具有秈粳共同差異的高通用性的InDel標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

包括2份秈稻（93-11和黃華占）和2份粳稻（日本晴和臺(tái)中65）。

1.2 InDel標(biāo)記的設(shè)計(jì)

以每隔 1～2 Mb的距離從 RGP網(wǎng)站（http∶//rgp.dna. affrc.go.jp/）或者 GRAMENE網(wǎng)站（http∶//www.gramene.org/）下載對(duì)應(yīng)的 BAC克隆序列，然后在 NCBI網(wǎng)站（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）的 BLAST網(wǎng)頁(yè)，將此BAC序列與93-11基因組序列進(jìn)行BLAST比較，以中間缺失 5～20個(gè)堿基，兩邊高度保守的區(qū)域?yàn)槔硐氲?InDel設(shè)計(jì)區(qū)。為了后續(xù)檢測(cè)方便，InDel設(shè)計(jì)長(zhǎng)度一般為100～160 bp，盡量不超過(guò)200 bp，引物的Tm值為55～60℃。

1.3 DNA提取方法

在三至四葉期，從4種材料中各選1個(gè)單株采集新鮮葉片，以略加修改的SDS法［8］提取葉片基因組總DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

20 μL的PCR體系中包含模板DNA 0.5 μL、10 mmol L-1dNTPs 0.3 μL、10 μmol L-1正反引物各0.5 μL、10 × PCR buffer 2 μL和Taq DNA聚合酶0.5～0.6 U，ddH2O 17 μL。

PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 25 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min。

1.5 電泳檢測(cè)及記錄方法

20 μL PCR產(chǎn)物加4 μL 6×loading buffer于52孔電泳槽，每孔上樣4 μL，8.8%聚丙烯酰胺凝膠180V穩(wěn)壓電泳70 min，用銀染法［9］染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel標(biāo)記的篩選結(jié)果

對(duì)供試的634對(duì)候選InDel標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測(cè)，選出在2種秈稻和2種粳稻之間顯示共同多態(tài)的標(biāo)記（圖1），共獲得 295對(duì)秈-粳差異 InDel標(biāo)記。這些標(biāo)記在每條染色體上的數(shù)目為14～35個(gè)，平均間隔為0.76～1.60 Mb （表1）。這套標(biāo)記的引物信息列在表2。

圖1 InDel候選標(biāo)記在4個(gè)品種的PCR檢測(cè)Fig. 1 Detection of candidate InDel markers among four rice cultivars by PCR amplification

表1 各染色體的InDel標(biāo)記分布Table 1 Distribution of InDel markers on the chromosomes

表2 秈粳間有共同多態(tài)性的295對(duì)InDel標(biāo)記引物Table 2 Primer sets of 295 InDel markers polymorphic between indica and japonica rice

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

3 討論

水稻不僅是世界上最主要的糧食作物之一，也是遺傳學(xué)和基因組研究的模式植物。隨著分子標(biāo)記種類(lèi)的不斷開(kāi)發(fā)，標(biāo)記數(shù)量的不斷增加，分子標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷拓展。目前分子標(biāo)記技術(shù)除了被廣泛應(yīng)用于基因定位外，還大量應(yīng)用于水稻秈、粳分類(lèi)［10-12］，作物育種［13］，物種進(jìn)化關(guān)系研究［14］，作物種子純度鑒定及材料的品種鑒定［15-16］等諸多領(lǐng)域。在水稻基因定位方面，由于InDel分子標(biāo)記比SSR標(biāo)記密度更大，因此應(yīng)用前景更好。本研究獲得295對(duì)InDel標(biāo)記可以作為以秈、粳（尤其是這4種材料）為親本的圖位克隆分子標(biāo)記。每條染色體上的標(biāo)記間隔在0.7～1.6 Mb之間，相當(dāng)于遺傳距離約4～10 cM，基本上可以滿足初定位的需要。

致謝： 本文中有些標(biāo)記由本實(shí)驗(yàn)室多位研究生提供，在此一并致謝。

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Development of 295 InDel Markers for Indica and Japanica Rice

CHU Zhi-Zhan1，GUO Hai-Bin2，ZENG Dong-Chang1，and LIU Yao-Guang1，*1College of Life Sciences，South China Agricultural University / State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Guangzhou 510642，China；2Center of Experimental Teaching for Common Basic Course，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China

Abstract：Insertion/Deletion （InDel） markers have advantages of simplicity and reliability for genotyping. We selected 634 candidate InDel markers distributing throughout the 12 chromosomes of rice by comparing genome sequences between the japonica cultivar Nipponbare and the indica cultivar 93-11. PCR results of these candidate markers between two japonica （Nipponbare and Taizhong 65） and two indica （93-11 and Huanghuazhan） cultivars revealed that 295 InDel markers displayed common polymorphisms between the japonica and indica cultivars which are useful for gene mapping and molecular breeding involving in indica and japonica subspecies.

Keywords：InDel marker；Rice；Gene mapping

DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00932

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 劉耀光，E-mail∶ ygliu@scau.edu.cn

收稿日期Received（）∶ 2015-11-09；Accepted（接受日期）∶ 2016-01-11；Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）∶ 2016-03-14.