酒精發(fā)酵過程中脅迫因子對(duì)酵母海藻糖積累的影響

許宏賢，周　鵬，王　欣，張曉萍，段　鋼（杜邦工業(yè)生物應(yīng)用科技部杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司，江蘇無錫214028）

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酒精發(fā)酵過程中脅迫因子對(duì)酵母海藻糖積累的影響

許宏賢，周鵬，王欣，張曉萍，段鋼
（杜邦工業(yè)生物應(yīng)用科技部杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司，江蘇無錫214028）

摘要：針對(duì)酒精生產(chǎn)酵母可能面臨的受迫性因子對(duì)海藻糖形成的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，不同碳源如蔗糖、葡萄糖對(duì)酒精發(fā)酵液中海藻糖的含量幾乎沒有差別；黃曲霉毒素Afb1對(duì)酒精發(fā)酵海藻糖的累積有一定的影響；發(fā)酵起始pH值過高（6.5）或過低（3.5）都會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中游離海藻糖含量/海藻糖總量增高，發(fā)酵起始pH值過低（3.5）還會(huì)導(dǎo)致酵母胞內(nèi)海藻糖含量升高；發(fā)酵溫度過高（38℃）會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中游離海藻糖/胞內(nèi)海藻糖/海藻糖總量升高；氮源不足會(huì)引起發(fā)酵液中海藻糖/胞內(nèi)海藻糖/海藻糖總量顯著升高，并且氮源對(duì)胞內(nèi)海藻糖累積的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于溫度。

關(guān)鍵詞：海藻糖；碳源；pH值；毒素；溫度；氮源；酒精

海藻糖是由2個(gè)吡喃型葡萄糖通過α，α-1，1-糖苷鍵連接而成的雙糖，是一種穩(wěn)定的非還原性雙糖，廣泛存在于藻類、細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲等動(dòng)植物和微生物中。它既是一種貯藏性糖類，又是生物體抵御脅迫環(huán)境的應(yīng)激代謝物，特性非常穩(wěn)定，能夠在高滲、高溫、高寒、干燥失水等惡劣的條件下于細(xì)胞表面形成特殊的保護(hù)膜，有效地保護(hù)生物分子結(jié)構(gòu)不被破壞，從而維持生命體的生命過程和生物特征。

目前已知的微生物體內(nèi)生物合成海藻糖的途徑有3種［1］，見圖1。其中OtsAB是酵母菌和大腸桿菌抵御脅迫環(huán)境最常規(guī)的合成途徑。從UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸，之后經(jīng)去磷酸化形成游離的海藻糖。該反應(yīng)由海藻糖-6-磷酸合成酶（OtsA）和海藻糖-6-磷酸磷酸酶（OtsB）分別催化。

圖1　　海藻糖在細(xì)菌體內(nèi)生物合成途徑

濃醪發(fā)酵是酒精生產(chǎn)的發(fā)展方向［2］。在高濃度發(fā)酵初期，高濃度底物（如葡萄糖）及后期逐漸積累的乙醇會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，影響發(fā)酵。海藻糖作為酵母受脅迫的指標(biāo)性物質(zhì)之一，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究持續(xù)不斷。早在1998年，史戈峰等［3］的研究就表明，當(dāng)起始葡萄糖濃度達(dá)到24%，發(fā)酵時(shí)間為65～70 h時(shí)，酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖可高達(dá)細(xì)胞干重的20%；喬長(zhǎng)晟等［4］研究表明，加壓有利于酵母菌胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的積累，并且酵母菌株應(yīng)激產(chǎn)物海藻糖積累越高，其越有利于適應(yīng)體外環(huán)境劇烈的改變，相應(yīng)的酵母菌株對(duì)壓力的敏感性越強(qiáng)，加壓導(dǎo)致酵母菌形態(tài)變化越明顯，反應(yīng)體系中pH值降低是影響酵母菌活性的主要因素，由此可認(rèn)為，高壓條件下的CO2酸化作用是影響面包酵母海藻糖生成的主要因素。丁春磊［5］2014年研究了不同質(zhì)量的原材料如粉狀木薯、黃木薯、正常塊狀木薯，在發(fā)酵過程中，由于在一定程度上受到木薯原料質(zhì)量影響，導(dǎo)致微生物發(fā)酵產(chǎn)生有害因子，對(duì)酵母代謝產(chǎn)生抑制作用，海藻糖含量增高。Hottiger等［6］的研究表明，熱刺激可導(dǎo)致酵母大量積累海藻糖；Hounsa等［7］于1998年研究了滲透壓對(duì)海藻糖積累的影響；Mahmud等［8-14］及眾多學(xué)者研究了鹽的因素對(duì)酵母積累海藻糖的影響。這些對(duì)酵母積累海藻糖抵抗惡劣環(huán)境作用及作用機(jī)理的研究有助于酒精工業(yè)的發(fā)展，然而工業(yè)化酒精生產(chǎn)過程中，酵母的受脅迫因子遠(yuǎn)不止于此，常見的因素匯總?cè)鐖D2［15］。由此可見除了醪液濃度、壓力、原材料質(zhì)量、溫度、離子濃度之外，還有很多因素都會(huì)使酵母處于極端環(huán)境。為此本研究針對(duì)酒精生產(chǎn)酵母可能面臨的受迫性因子如不同碳源、黃曲霉毒素、pH值、溫度和氮源對(duì)海藻糖形成的影響進(jìn)行了研究。

圖2　　酵母所受脅迫性因子

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與培養(yǎng)基

釀酒高活性干酵母（耐高溫型）：安琪酵母公司。

酒精發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：碳源，葡萄糖200（或根據(jù)試驗(yàn)要求調(diào)節(jié)）；氮源，蛋白胨20，酵母粉10（或根據(jù)試驗(yàn)要求調(diào)節(jié)），pH5.5（根據(jù)試驗(yàn)要求調(diào)節(jié)）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料

黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品Afb1購(gòu)于sigma；蛋白胨、酵母粉購(gòu)于Oxford公司；葡萄糖、蔗糖、三氯乙酸等其他試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，木薯粉由國(guó)內(nèi)某酒精廠提供；酶制劑SPEZYME ALPHA、DISTILLASE POWERSACC由杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司提供。

1.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備

ICS-5000型離子色譜，Dionex公司；高效液相色譜（1260型），Agilent公司；電子天平，梅特勒公司；離心機(jī)、水浴鍋，賽默飛世爾科技公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酒精發(fā)酵

取適量干酵母，加入適量無菌水，配制成1 g/L，室溫活化20 min。每個(gè)250 mL三角瓶中裝入150 mL培養(yǎng)基，加入活化酵母后32℃（或根據(jù)試驗(yàn)要求調(diào)節(jié)）靜置發(fā)酵一定時(shí)間，發(fā)酵液用于分析。

1.2.2胞內(nèi)海藻糖的提取

取一定體積的發(fā)酵液，在12000 r/ min條件下離心10 min，將沉淀的酵母細(xì)胞用蒸餾水洗滌3次，離心后用三氯乙酸萃取。

1.2.3海藻糖的測(cè)定

采用離子色譜測(cè)定發(fā)酵液及胞內(nèi)海藻糖含量。Dionex，ICS-500型離子色譜。包括在線脫氣裝置的四元梯度泵GP50、電化學(xué)檢測(cè)器ED50，Au為工作電極，Ag/ AgCl為參比電極，脈沖安培檢測(cè)器工作參數(shù)E1 = 0.1V，t1 = 400 ms；E2 = 2V，t2 = 20 ms；E3 = 0.6V，t3 = 10 ms；E4 = 0.1V，t4 = 70 ms。CarboPakTM PA200色譜柱，流動(dòng)相100 mmol/L NaOH，流速0.5 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量25 μL。

1.2.4發(fā)酵液的分析

采用HPLC測(cè)定發(fā)酵液的組成成分。取0.5 mL發(fā)酵上清液，0.005 mol/L稀硫酸稀釋10倍，過0.22 μm膜，Agilent 1260型HPLC，Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相0.005 mol/L稀硫酸，流速0.6 mL/min，柱溫60℃；示差檢測(cè)器。

2結(jié)果與討論

2.1不同碳源（蔗糖、葡萄糖）對(duì)海藻糖形成的影響

蔗糖是酒精工業(yè)中使用范圍僅次于葡萄糖的碳源，為此選取葡萄糖和蔗糖，分別配制不同濃度的培養(yǎng)基（100 g/L或200 g/L），離子色譜分析酒精發(fā)酵液中游離海藻糖的含量，結(jié)果見表1。

表1　不同碳源（蔗糖、葡萄糖）對(duì)海藻糖形成的影響

由表1可知，蔗糖、葡萄糖對(duì)酒精發(fā)酵液中海藻糖的形成的影響幾乎沒有差別，這大概是由于兩者都是酵母可利用的碳源，并且濃度都沒有達(dá)到使酵母受脅迫的程度所致。

2.2毒素（黃曲霉毒素Afb1）對(duì)海藻糖形成的影響（葡萄糖為底物）

黃曲霉毒素是陳化糧中最常見的毒素之一。近年來我國(guó)糧食年年豐收，某些地區(qū)出現(xiàn)相對(duì)過剩，庫(kù)存量不斷上升，由于氣候、儲(chǔ)存條件限制等種種原因，導(dǎo)致部分糧食受微生物污染，發(fā)霉變質(zhì)，毒素水平超標(biāo)從而無法食用，只能用于燃料乙醇生產(chǎn)。為此我們研究了毒素（黃曲霉毒素Afb1）對(duì)發(fā)酵液中游離海藻糖含量的影響，同時(shí)測(cè)定酵母胞內(nèi)海藻糖含量，結(jié)果見表2。

表2　毒素（黃曲霉毒素Afb1）對(duì)海藻糖形成的影響

由表2可知，黃曲霉毒素Afb1對(duì)酒精發(fā)酵海藻糖形成有一定的影響，隨著黃曲霉毒素Afb1升高，發(fā)酵液中的海藻糖（胞外）和酵母胞內(nèi)的海藻糖含量都呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，毫無疑問黃曲霉毒素是酵母受迫性因素之一，酵母細(xì)胞通過調(diào)節(jié)自身海藻糖的合成來抵御它的傷害。

2.3發(fā)酵起始pH值對(duì)海藻糖形成的影響（葡萄糖為底物）

在酒精生產(chǎn)企業(yè)中［16］，由于傳統(tǒng)、廣泛使用的源自黑曲霉的糖化酶的最佳pH值為4.2～4.5，乳酸菌的生長(zhǎng)在pH值低于5.0的情況下會(huì)受到抑制，這兩方面因素使得絕大多數(shù)酒精廠在液化后通過加入硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵起始pH值，通?？刂圃?.0左右，有時(shí)為了控制或預(yù)防染菌，甚至?xí)?.5左右。為此我們研究了發(fā)酵起始pH值對(duì)酒精發(fā)酵和海藻糖形成的影響，用HPLC對(duì)發(fā)酵液成分進(jìn)行分析，結(jié)果見表3；同時(shí)采用離子色譜分析酒精發(fā)酵液中游離海藻糖含量和酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量，結(jié)果見表4。

由表3的HPLC結(jié)果來看，過低的起始pH值（3.5）會(huì)導(dǎo)致整個(gè)過程中反應(yīng)體系的pH值都比較低，殘余葡萄糖含量升高，發(fā)酵遲緩，最終酒度降低，另一個(gè)受迫性指標(biāo)甘油的含量也隨之上升。由表4可知，發(fā)酵起始pH值對(duì)酒精發(fā)酵海藻糖的形成有一定影響，發(fā)酵起始pH值過高（6.5）或過低（3.5）都會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中游離海藻糖含量/海藻糖總量增高，發(fā)酵起始pH值過低（3.5）還會(huì)導(dǎo)致酵母胞內(nèi)海藻糖含量升高，因此綜合來看，酵母酒精發(fā)酵控制起始pH4.5～5.5比較合適。

表3　發(fā)酵不同起始pH值對(duì)發(fā)酵液成分的影響

2.4溫度和氮源對(duì)海藻糖形成的影響（葡萄糖為底物）

高溫是公認(rèn)的導(dǎo)致酵母分泌積累海藻糖的主要因素之一，但是到目前為止鮮有氮源對(duì)酵母分泌積累海藻糖影響的報(bào)道，然而在濃醪發(fā)酵過程中，氮源無疑是酵母最主要的受迫性因素之一［17］，為此我們耦合溫度這一因素，對(duì)不同氮源濃度對(duì)海藻糖形成的影響進(jìn)行了研究。HPLC發(fā)酵液成分分析結(jié)果見表5，發(fā)酵過程中發(fā)酵液中游離海藻糖含量、胞內(nèi)海藻糖含量、菌體量、發(fā)酵液海藻糖總量分別見圖3—圖6。

表5　發(fā)酵溫度和不同氮源濃度對(duì)發(fā)酵液成分的影響（葡萄糖為底物）

圖3　葡萄糖為底物溫度和氮源對(duì)游離海藻糖的影響

由表5可知，氮源不足或發(fā)酵溫度過高都會(huì)導(dǎo)致殘余葡萄糖大幅增高，酒精度下降；圖3揭示了發(fā)酵過程中海藻糖含量隨溫度和氮源濃度的不同而發(fā)生的變化，由此可見充足的氮源和適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度是保證發(fā)酵液中游離海藻糖能夠充分下降的必要條件；圖4揭示了發(fā)酵過程中酵母胞內(nèi)海藻糖的變化過程，氮源不足會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時(shí)胞內(nèi)海藻糖含量大幅度增加，并且看起來氮源對(duì)胞內(nèi)海藻糖累積的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于溫度，這是始料未及的結(jié)果；圖5揭示了發(fā)酵過程中菌體量的變化，高溫會(huì)導(dǎo)致菌體量大幅度減少；圖6表征了溫度和氮源對(duì)總的海藻糖含量的影響，若想海藻糖維持在較低水平，溫度和氮源都必須符合酵母的要求，任何一個(gè)條件不滿足都會(huì)導(dǎo)致最終總的海藻糖含量大幅度升高；比較圖6和圖3可知，總海藻糖量的變化趨勢(shì)與游離海藻糖量的接近。

圖4　葡萄糖為底物溫度和氮源對(duì)胞內(nèi)海藻糖的影響

圖5　葡萄糖為底物溫度和氮源對(duì)菌體量的影響

圖6　葡萄糖為底物溫度和氮源對(duì)總的海藻糖含量的影響

高熱環(huán)境在許多方面危及細(xì)胞，最主要的是造成膜的不完整以及使得蛋白質(zhì)變性與凝結(jié)。細(xì)胞暴露在高熱中造成蛋白質(zhì)凝結(jié)，最終死亡。Mike［18］以及其他學(xué)者［19-20］認(rèn)為海藻糖在酵母細(xì)胞遭受熱沖擊時(shí)起了穩(wěn)定蛋白的作用。最近又發(fā)現(xiàn)海藻糖也能抑制變性蛋白的凝結(jié)，維持他們的部分折疊狀態(tài)，在此狀態(tài)下，蛋白質(zhì)可被分子伴隨物重新激活，但是海藻糖的繼續(xù)存在將影響蛋白的重新折疊。筆者推測(cè)氮源不足導(dǎo)致的胞內(nèi)海藻糖大幅度累積也許與此有關(guān)。

酵母體內(nèi)除了存在與海藻糖生物合成有關(guān)的海藻糖-6-磷酸合成酶（OtsA）和海藻糖-6-磷酸磷酸酶（OtsB）之外，還存在中性海藻糖酶（NTH）和酸性海藻糖酶（ATH）［21］。NTH的pH值活性范圍在6.7～7.0；ATH的pH值在4.0～5.0；ATH和NTH在酵母的生命周期顯示相反的活力模式。NTH的活性在酵母的指數(shù)生長(zhǎng)期高，而當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入呼吸和穩(wěn)定期時(shí)迅速衰減；與此相反，ATH的活性僅在細(xì)胞進(jìn)入呼吸或/和穩(wěn)定期或生長(zhǎng)在呼吸底物如乙醇或甘油上時(shí)才能檢出。因此，ATH活性對(duì)應(yīng)的酵母生命周期是其產(chǎn)物、海藻糖已經(jīng)累積到相當(dāng)可觀的水平的階段；而NTH僅在指數(shù)生長(zhǎng)期即海藻糖水平很低時(shí)有活性。酵母的不同生命階段這兩個(gè)海藻糖酶是如何進(jìn)行功能協(xié)調(diào)的尚不為人知。但毫無疑問酵母體內(nèi)海藻糖合成酶系的活力變化和海藻糖酶系的活力變化共同導(dǎo)致了發(fā)酵期間游離海藻糖、胞內(nèi)海藻糖含量的變化。

2.5溫度和氮源對(duì)海藻糖形成的影響（木薯粉為底物）

鑒于2.4的研究是用葡萄糖做底物，而實(shí)際生產(chǎn)多采用淀粉質(zhì)原料邊糖化邊發(fā)酵工藝，故采用淀粉質(zhì)原料中蛋白質(zhì)含量相對(duì)較少的木薯粉進(jìn)行驗(yàn)證，具體的實(shí)驗(yàn)條件為：木薯粉漿濃度30%，pH值調(diào)節(jié)5.6，液化酶SPEZYME ALPHA，添加量0.2 kg/MT；85℃維持120 min；液化結(jié)束后不調(diào)節(jié)pH值，冷卻至室溫添加糖化酶DISTILLASE POWERSACC，添加量0.8 kg/MT；氮源采用不同濃度的尿素，接入酵母后在不同溫度下進(jìn)行發(fā)酵。HPLC發(fā)酵液分析結(jié)果見表6，發(fā)酵過程中發(fā)酵液中游離海藻糖含量的變化見圖7。

表6　發(fā)酵溫度和不同氮源濃度對(duì)發(fā)酵液成分的影響（木薯粉為底物）

比較表5和表6可知，采用木薯粉作原料得到了和葡萄糖做原料類似的結(jié)果，氮源不足或溫度過高都會(huì)導(dǎo)致殘余葡萄糖大幅增高，酒度下降；比較圖3和圖7可知，與葡萄糖為原料相一致，充足的氮源和適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度是保證發(fā)酵液中游離海藻糖含量能夠充分下降的必要條件；發(fā)酵過程中游離海藻糖的變化木薯粉原料和葡萄糖原料不完全一致，筆者認(rèn)為這是由于原料不同，導(dǎo)致酵母體內(nèi)海藻糖合成酶系的活力和海藻糖酶系的活力有所不同所致。

圖7　木薯粉為底物溫度和氮源對(duì)游離海藻糖的影響

3　展望

高濃度發(fā)酵近年來成為發(fā)酵工業(yè)的重要研究方向之一。過去十幾年美國(guó)酒精業(yè)已經(jīng)完成了從普通發(fā)酵（12%vol～15%vol）到濃醪發(fā)酵（16%vol～19%vol）的轉(zhuǎn)型［22］。酵母在濃醪條件下的受脅迫因子更具挑戰(zhàn)性。海藻糖是酵母受脅迫的指標(biāo)性物質(zhì)之一，由于外源性的海藻糖酶可以把發(fā)酵液中的游離海藻糖水解成葡萄糖從而被酵母利用提高酒精產(chǎn)出，故發(fā)酵液中海藻糖含量的研究對(duì)進(jìn)一步提高酒精發(fā)酵水平具有指導(dǎo)意義。

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中圖分類號(hào)：TS262.2；TS261.1；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）05-0065-05

收稿日期：2016-02-23； 2016-04-01

作者簡(jiǎn)介：許宏賢（1970-）女，江蘇無錫人，工學(xué)碩士，高級(jí)研究員，主要從事食品與發(fā)酵的研究，E-mail：sophia.xu@dupont.com。

通訊作者：段鋼（1966-），男，遼寧沈陽(yáng)人，工學(xué)博士，亞太地區(qū)技術(shù)總監(jiān)，主要從事工業(yè)酶應(yīng)用與開發(fā)，E-mail：gang.duan@dupont.com。優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-04-06；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160406.1454.001.html。

DOI：10.13746/j.njkj.2016060

Effects of Stress Factors on Trehalose Accumulation in the Process of Ethanol Fermentation

XU Hongxian，ZHOU Peng，WANG Xin，ZHANG Xiaoping and DUAN Gang
（DuPont Industrial Biosciences，Genencor（China）Bio-product Co. Ltd.，Wuxi，Jiangsu 214028，China）

Abstract：The effects of stress factors on trehalose accumulation in the process of ethanol fermentation were explored. The results showed that，there was almost no difference in the effects of different carbon sources such as glucose and sucrose on the content of trehalose；there was a little effects of aflatoxin Afb1 on trehalose accumulation；extreme pH values，such as too high pH（6.5）or too low pH（3.5），would lead to higher in vitro trehalose and total trehalose in the fermentation broth，while too low pH（3.5）might also lead to higher in vivo trehalose；higher fermentation temperature（38℃）might result in higher trehalose content both in vitro and in vivo（which meant higher total trehalose accumulation）；insufficient nitrogen source might lead to remarkable higher in vitro/ in vivo/total trehalose accumulation（reported for the first time），and it seemed that nitrogen source played a more important role than temperature.

Key words：trehalose；carbon source；pH；aflatoxin；temperature；nitrogen source；ethanol