新型液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)米香型白酒的研究(Ⅲ)
——純種培養(yǎng)釀酒酵母與傳統(tǒng)小曲協(xié)同糖化發(fā)酵的研究

唐取來，劉彩霞，肖冬光（教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

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新型液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)米香型白酒的研究(Ⅲ)
——純種培養(yǎng)釀酒酵母與傳統(tǒng)小曲協(xié)同糖化發(fā)酵的研究

唐取來，劉彩霞，肖冬光
（教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

摘要：在新型液態(tài)發(fā)酵條件下，對純種培養(yǎng)釀酒酵母與傳統(tǒng)小曲協(xié)同糖化發(fā)酵進(jìn)行研究。實驗結(jié)果表明，在傳統(tǒng)小曲發(fā)酵過程中接種一定量的純種培養(yǎng)的高產(chǎn)酯、適量低產(chǎn)高級醇的釀酒酵母，能明顯提高原料出酒率和乙酸乙酯的含量，并顯著降低高級醇含量；但釀酒酵母對產(chǎn)酸菌有明顯抑制作用，致使總酸含量下降，并影響乳酸乙酯的生成。采用分醪發(fā)酵工藝可減少酵母菌與傳統(tǒng)小曲協(xié)同糖化發(fā)酵過程中對產(chǎn)酸菌生長代謝的影響，在提高米香型白酒總酯含量的同時實現(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)之間的平衡。

關(guān)鍵詞：純種培養(yǎng)釀酒酵母；傳統(tǒng)小曲；液態(tài)發(fā)酵；白酒

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-23；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160323.1517.004.html。

傳統(tǒng)小曲作為米香型白酒釀造中微生物和生物酶的有效載體，在米香型白酒釀造過程中起糖化和發(fā)酵的作用，其質(zhì)量的好壞直接影響米香型白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量，自古就有“曲乃酒之骨”之說［1］。但小曲制造過程是開放式的，很容易受自然環(huán)境因素的影響，而且小曲中除含釀酒有益微生物外，同時也夾帶著對釀酒有害的微生物，最終會影響酒的質(zhì)量［2］。因此，釀造過程中采用純種培養(yǎng)的高產(chǎn)酯、適量低產(chǎn)高級醇的釀酒酵母與傳統(tǒng)小曲協(xié)同糖化發(fā)酵，補(bǔ)充傳統(tǒng)小曲中釀酒酶系和產(chǎn)酯功能微生物的不足，大幅度增加米香型白酒中酯類香味物質(zhì)含量，同時還能有效控制高級醇的含量，從而改善小曲酒的品質(zhì)［3］。傳統(tǒng)小曲中的釀酒微生物經(jīng)過長期的自然富集與傳代，已形成了一個穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境，菌種間的相互促進(jìn)和相互制約控制著白酒的風(fēng)味特點［4］。但白酒發(fā)酵過程中微生物互生關(guān)系比較復(fù)雜，目前它們的互生機(jī)理還不十分清楚。因此，研究傳統(tǒng)小曲中產(chǎn)酸菌與酵母菌的協(xié)同發(fā)酵機(jī)理，為傳統(tǒng)釀造的技術(shù)改造提供重要的理論依據(jù)和實際應(yīng)用價值［5］。

1材料與方法

1.1材料和儀器

小曲，南方傳統(tǒng)小曲；大米，淀粉含量76.5%，湖南常德金健公司；高產(chǎn)酯、適量低產(chǎn)高級醇釀酒酵母（EY8），天津市工業(yè)微生物重點實驗室；商品酶制劑，北京諾維信公司。

高效液相色譜儀、Agilent 7890B氣相色譜儀、Agilent HP-INNOWAX色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）：美國安捷倫科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1釀酒酵母種子培養(yǎng)

一級種子：從試管斜面接種1環(huán)高產(chǎn)酯、適量低產(chǎn)高級醇的釀酒酵母于裝有5 mL玉米糖化醪培養(yǎng)基的20 mL試管中，30℃靜止培養(yǎng)24 h，至產(chǎn)生渾濁狀態(tài)；二級種子：將一級試管種子液全部倒入裝有100 mL玉米糖化醪培養(yǎng)基的250 mL三角瓶培養(yǎng)中，30℃靜止培養(yǎng)至菌濃度為1×108～2×108個/mL。

1.2.2小曲純糧液態(tài)發(fā)酵工藝

粉碎后的大米經(jīng)糊化、液化后，加小曲搖瓶培菌糖化1 d，靜止發(fā)酵5 d，總發(fā)酵周期6 d。高產(chǎn)酯、低產(chǎn)高級醇釀酒酵母按不同工藝要求在培菌前后加入。米香型白酒分醪發(fā)酵工藝如下：

1.3分析方法

酒度測定：酒精計法［6］；總酸總酯測定：指示劑法，參照GB/T 10345—2007；風(fēng)味物質(zhì)測定：氣相色譜法［7］。

2結(jié)果與分析

2.1純種培養(yǎng)釀酒酵母對小曲純糧液態(tài)發(fā)酵的影響

純種培養(yǎng)釀酒酵母接種量與接種時間對小曲純糧液態(tài)發(fā)酵的影響見表1。

表1　純種培養(yǎng)釀酒酵母對小曲純糧液態(tài)發(fā)酵的影響

從發(fā)酵醪酒度看，培菌糖化前接種1%～2%的釀酒酵母，發(fā)酵醪酒精含樣量有所提高，比空白對照提高5%左右；其他條件與對照樣基本相當(dāng)。

從醇類風(fēng)味物質(zhì)看，接種純種培養(yǎng)釀酒酵母后，正丙醇、異丁醇和異戊醇的含量明顯減少，而苯乙醇的含量有所增加。其中，培菌糖化前接種1%的釀酒酵母時，正丙醇、異丁醇、異戊醇和總高級醇含量減少最多，分別比對照樣減少65.7%、80.8%、38.7%和57.7%；苯乙醇的含量隨酵母接種量增大而增加，在培菌糖化前接種5%的釀酒酵母時，苯乙醇含量最高達(dá)76.5 mg/L，分別為對照樣和培菌后接種的2.0倍和1.4倍。

從酯類風(fēng)味物質(zhì)看，接種純種培養(yǎng)釀酒酵母后，乙酸乙酯含量顯著增加，其含量隨酵母接種量增加而增加，且培菌糖化前接種比培菌糖化后接種提高更顯著。培菌糖化前接種5%的釀酒酵母時，乙酯乙酯含量最高達(dá)1114.2 mg/L，分別為對照樣和培菌后接種的16.6倍和2.6倍。但釀酒酵母對乳酸乙酯的生成有明顯影響，其中培菌糖化前接種釀酒酵母，乳酸乙酯的生成被完全抑制；培菌糖化后接種5%的釀酒酵母時，乳酸乙酯含量下降22.8%。

從總酸看，接種釀酒酵母后影響產(chǎn)酸菌的生長與代謝，發(fā)酵醪總酸含量顯著降低，且隨養(yǎng)酵母接種量的增加，總酸含量相應(yīng)減少。

2.2米香型白酒分醪發(fā)酵工藝研究

由上述的結(jié)果可知，在小曲純糧液態(tài)發(fā)酵工藝中接種純種培養(yǎng)釀酒酵母，雖然能大幅度提高米香型白酒中的乙酸乙酯含量，但釀酒酵母對小曲中的產(chǎn)酸菌有明顯抑制作用，致使總酸含量下降，并影響乳酸乙酯的生成和酒體風(fēng)味物質(zhì)之間的平衡。為此，采用分醪發(fā)酵工藝，部分發(fā)酵醪保留純小曲發(fā)酵，而另一部分發(fā)酵醪采用高產(chǎn)酯、低產(chǎn)高級醇釀酒酵母與小曲共同發(fā)酵。不同發(fā)酵工藝的試驗結(jié)果見表2。從表2可知，培菌糖化后按1∶1比例合醪發(fā)酵工藝A并沒有消除釀酒酵母對產(chǎn)酸菌的抑制作用，總酸和乳酸乙酸含量與培菌前接種1%釀酒酵母的對照2相同。發(fā)酵1 d后，再按1∶1的比例合醪發(fā)酵工藝B，可明顯提高總酸和乳酸乙酯含量，總酸提高為對照2的33.3%；而酒度比對照1提高10.4%，乙酸乙酯提高18.7倍左右，高級醇下降33.8%。

表2　不同發(fā)酵工藝試驗結(jié)果

上述結(jié)果可以看出，純種培養(yǎng)釀酒酵母與傳統(tǒng)小曲協(xié)同發(fā)酵和分醪工藝相結(jié)合的方式能達(dá)到增酯降醇的效果，但發(fā)酵生成的乙酸乙酯含量仍遠(yuǎn)高于乳酯乙酯，致使乙酸乙酯、乳酸乙酯比有所失調(diào)。將通過改變發(fā)酵時間、合醪比例和合醪時間來協(xié)同釀酒酵母與傳統(tǒng)小曲的糖化發(fā)酵，達(dá)到白酒風(fēng)味物質(zhì)平衡的目的。

2.2.1延長發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響

表3為純小曲培菌（小曲0.8%）與共同培菌（小曲0.8%和酵母1%）結(jié)束并發(fā)酵1 d后按1∶1的比例合醪發(fā)酵，延長發(fā)酵時間后的試驗結(jié)果。從結(jié)果看，隨發(fā)酵時間的延長，酒度、乳酸和乙酸含量變化不大；乙酸乙酯在發(fā)酵11 d時達(dá)最大值，比發(fā)酵7 d時提高10.3%，隨后緩慢下降；乳酸乙酯含量隨發(fā)酵時間的延長緩慢增加，發(fā)酵17 d的乳酸乙酯含量與發(fā)酵7 d的相比，提高了19.0%。

表3　延長發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響

從實驗結(jié)果可以看出，乙酸乙酯主要在前期生成，發(fā)酵后期會有部分降解；而乳酸乙酯主要在后期生成。由于發(fā)酵一定時間，乳酸菌和酵母協(xié)同發(fā)酵達(dá)到微生態(tài)環(huán)境的飽和狀態(tài)，當(dāng)繼續(xù)延長發(fā)酵時間，發(fā)酵液中各代謝產(chǎn)物的含量基本穩(wěn)定。從結(jié)果看，延長發(fā)酵時間，可適當(dāng)調(diào)整乙酸乙酯與乳酸乙酯的比例，但要達(dá)到合適的比例；若發(fā)酵時間過長，則效率會下降。

2.2.2合醪比例對發(fā)酵的影響

在保持總發(fā)酵時間6 d不變的情況下，不同合醪比例對發(fā)酵的影響見表4。從結(jié)果看，隨著不加酵母醪液比例的增大，酒度、乙酸乙酯含量及乙酸乙酯、乳酸乙酯比相應(yīng)的減小，而總酸和乳酸乙酯含量相應(yīng)的增加。在合醪比例為7∶3時，與對照1相比，酒度、乙酸乙酯和總酯的含量分別提高5.6%、8.4倍和2.8倍，高級醇下降了24.9%；而與對照2相比，乳酸乙酯、乳酸和總酸分別提高13.2倍、3.0倍、2.3倍。

2.2.3合醪時間對發(fā)酵的影響

按7∶3的合醪比例，不同合醪時間對發(fā)酵的影響見表5。從結(jié)果看，隨合醪時間的延長，乙酸乙酯和總酯的含量及乙酸乙酯、乳酸乙酯比相應(yīng)的減小，但乳酸乙酯、高級醇、總酸和乳酸的含量相應(yīng)增加。當(dāng)各自發(fā)酵48 h后再合醪，乙酸乙酯與乳酸乙酯的比例相對平衡，此時的乙酸乙酯、乳酸乙酯比為1.69。以此發(fā)酵醪蒸餾所產(chǎn)的白酒，米香純正，酒體醇和協(xié)調(diào)。

3　結(jié)論

3.1在傳統(tǒng)小曲發(fā)酵過程中接種一定量的純種培養(yǎng)的高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母，能明顯提高乙酸乙酯的含量，并顯著降低高級醇含量；但釀酒酵母對產(chǎn)酸菌有明顯抑制作用，致使總酸含量下降，并影響乳酸乙酯的生成，其中，在培菌糖化前接種釀酒酵母后，乳酸乙酯的生成完全被抑制，其結(jié)果使酒體風(fēng)味物質(zhì)之間失去平衡。

3.2采用分醪發(fā)酵工藝可減少酵母菌與傳統(tǒng)小曲協(xié)同糖化發(fā)酵過程中對產(chǎn)酸菌生長代謝的影響，分別培菌并發(fā)酵一定時間再合醪發(fā)酵，其乳酸乙酯含量比純小曲發(fā)酵的還有所提高。純小曲培菌液（小曲用量0.8%）與共同培菌液（小曲用量0.8%，酵母培養(yǎng)液1%）按7∶3比例，各自發(fā)酵48 h后，再合醪發(fā)酵，與純小曲發(fā)酵（對照）比較，總酸含量相當(dāng)，酒度、乙酸乙酯、乳酸乙酯、總酯的含量分別提高7.0%、6.2倍、6.9%、2.3倍，高級醇含量下降16.5%，乙酸乙酯、乳酸乙酯比從0.28提高至1.69，在大

表4　合醪比例對發(fā)酵的影響

表5　合醪時間對發(fā)酵的影響

注：對照1為純小曲發(fā)酵；對照2為小曲與酵母共同發(fā)酵，培菌前接種1%的純種培養(yǎng)釀酒酵母；合醪時間指培菌糖化結(jié)束后的發(fā)酵時間。

幅度提高米香型白酒總酯含量的同時實現(xiàn)了風(fēng)味物質(zhì)之間的平衡，提升了米香型白酒的品質(zhì)。

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中圖分類號：TS262.3；TS261.1；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0035-03

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（3147172）；中國白酒3C計劃項目。

收稿日期：2016-01-12

作者簡介：唐取來（1991-），女，湖南岳陽人，碩士研究生，研究方向為現(xiàn)代釀造技術(shù)。

通訊作者：肖冬光（1956-），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：xdg@tust.edu.cn。

Production of Mixiang Baijiu by New-Type Liquid Fermentation（III）：Cooperative Sacchariferous Fermentation of Pure-Bred Cultured Yeast and Traditional Xiaoqu

TANG Qulai，LIU Caixia and XIAO Dongguang
（Key Lab of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education，Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：The cooperative sacchariferous fermentation of pure-bred cultured yeast and traditional Xiaoqu was studied in the conditions of newtype liquid fermentation. The experimental results demonstrated that，the inoculation of proper amount of pure-bred cultured yeast with high yield of esters and low yield of higher alcohols in traditional Xiaoqu fermentation process could significantly enhance liquor yield and ethyl acetate content and decrease the content of higher alcohols. However，the obvious inhibiting effects of yeast on acid bacteria would reduce total acids content and influence the synthesis of ethyl lactate. The use of mash-divided fermentation could reduce the inhibiting effects on the growth and metabolism of acid-producing bacteria in the cooperative sacchariferous fermentation and enhance total esters content，meanwhile，the balance among flavoring compounds could be achieved.

Key words：pure-bred cultured yeast；Xiaoqu；liquid fermentation；Baijiu