洋常春藤法呢基焦磷酸合酶基因的克隆與序列分析

阮琴妹，曹雄軍,2，孫化鵬，鐘曉紅*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧530007)

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洋常春藤法呢基焦磷酸合酶基因的克隆與序列分析

阮琴妹1，曹雄軍1,2，孫化鵬1，鐘曉紅1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧530007)

摘 要：以洋常春藤葉片為材料，采用同源RT–PCR方法，克隆獲得了洋常春藤法呢基焦磷酸合成酶基因，其cDNA序列大小為1 050 bp，開放閱讀框為1 026 bp，推測編碼342個氨基酸殘基，該序列的核苷酸、氨基酸與五加科植物有同源性；用在線數(shù)據(jù)軟件進行分析，推測該蛋白可能存在于細胞質(zhì)之中，定位在細胞膜外，F(xiàn)PS蛋白的相對分子質(zhì)量為39 735.7；該蛋白含有2個天冬氨酸保守結(jié)構(gòu)域，其二級結(jié)構(gòu)主要以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主；雙子葉植物系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，洋常春藤的FPS與刺五加、人參、三七、西洋參、遼東楤木的FPS親緣關(guān)系最近，這一結(jié)果符合傳統(tǒng)的分類法規(guī)則。

關(guān) 鍵 詞：洋常春藤；法呢基焦磷酸合成酶；同源性；五加科植物

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洋常春藤(Hedera helix)為傘形目五加科常春藤屬常綠藤本雙子葉植物，是兼藥用、觀賞等多功能使用的優(yōu)質(zhì)材料[1–2]。作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，洋常春藤主要的活性成分是三萜皂苷類化合物(常春藤皂苷C和α–常春藤皂苷)[1]。三萜類皂苷化合物在抗腫瘤、抑菌、抗氧化等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[3–5]。

法呢基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase, FPS)是催化法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)生物合成萜類物質(zhì)的一種重要前體，在三萜皂苷生物合成途徑中起著關(guān)鍵限速酶的作用，對皂苷類化合物的合成累積有重要的作用[6–8]。對普通小麥倍半萜合成途徑關(guān)鍵基因FPS進行功能分析的結(jié)果表明，F(xiàn)PS基因控制倍半萜化合物的合成量[9]。Wang等[10]克隆了茯苓FPS基因，并對不同生長階段的茯苓在茉莉酮酸甲酯處理下的總?cè)祁惢衔锖窟M行了測定，發(fā)現(xiàn)茯苓植株中FPS的含量與其合成總?cè)祁惢衔锏暮砍收嚓P(guān)關(guān)系。目前已有多種植物的FPS基因相繼被成功克隆[11–18]，如刺五加、人參、西洋參、三七、遼東楤木、絞股藍等，但洋常春藤FPS基因序列信息在GenBank和文獻中均少見報道。本研究中根據(jù)NCBI GenBank所登錄的五加科植物FPS基因的cDNA序列信息來設(shè)計引物，采用RT–PCR法克隆FPS基因，獲得其cDNA序列，并對其生物學(xué)信息進行分析，旨在探討FPS基因的表達調(diào)控在洋常春藤皂苷類化合物中的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

供試洋常春藤取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院實驗基地，經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)觀賞園藝教研室鑒定為洋常春藤。

總RNA的提取材料為完全展開的2片洋常春藤葉片。將試驗材料以清水沖洗雜質(zhì)，用濾紙吸干水分后剪成小塊狀，用錫箔紙迅速分裝后立即凍存在液氮中，再轉(zhuǎn)入－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2儀器與試劑

PrimeScriptTMⅡ 1ststrand cDNA synthesis Kit 和TaKaRa Ex Taq?購于寶生物工程有限公司(大連TaKaRa 公司)；多糖多酚植物RNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Trans 5k DNA marker、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、IPTG、X–gal、pEASY?–T1 Simple克隆試劑盒、Trans1–T1感受態(tài)細胞、2×Easy Taq PCR SuperMix(+dye)等均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)，分析純。

1.3洋常春藤FPS基因的克隆

1.3.1洋常春藤總RNA的提取和cDNA單鏈合成

將洋常春藤樣品從－80 ℃冰箱中取出，在液氮中研磨至粉狀，用多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取其總RNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品總RNA的完整性。用德國Implen P330超微量分光光度計檢測RNA的濃度與純度。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照PrimeScriptTMⅡ 1ststrand cDNA synthesis Kit使用說明，選擇Oligo dT為引物，合成第一鏈。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存在－20 ℃冰箱中備用。

1.3.2引物合成與RT–PCR擴增

利用同源克隆技術(shù)，通過比較人參(DQ087959.1)、刺五加(JQ178346.1)、西洋參(GQ401664.1)、三七(DQ059550.1和KJ804175.1)等五加科植物的FPS核苷酸序列的同源性，設(shè)計1對FPS基因特異性引物，上游引物FPSF為5'–ACATAAACAGCCAGAATG A–3'；下游引物FPSR 為5'–AATTACTTACTTTTGC CGC–3'。引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

以洋常春藤樣品的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行FPS基因擴增。PCR反應(yīng)體系50 μL：TaKaRa Ex Taq(5 U/μL)0.25 μL，10×Ex Taq Buffer(Mg2+free)5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，MgCl2(25 mmol/L)5 μL，引物FPSF(10 mmol/L)和FPSR(10 mmol/L)各1.25 μL，cDNA模板1.5 μL，定量補足ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃變性10 s，53 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3PCR產(chǎn)物回收、克隆及序列測定

按照PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書進行回收，用德國Implen P330超微量分光光度計檢測回收產(chǎn)物RNA的濃度與純度。取20 ng回收產(chǎn)物與pEASY?–T1 Simple載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1–T1感受態(tài)細胞，待其復(fù)蘇后分別涂布在含有卡那霉素、X–gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上。將該平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，12 h后觀察培養(yǎng)皿內(nèi)菌落的長勢與分布情況，并在超凈工作臺上進行藍白斑重組子篩選。用PCR方法鑒定陽性克隆。PCR擴增反應(yīng)體系50 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix(+dye)25 μL，引物M13F(10 μmol/L) 和M13R(10 μmol/L)各1 μL，模板1 μL，定量補足ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。4 ℃保存。取10 μL的PCR擴增產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為陽性后，用含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。

1.3.4序列分析方法

用序列處理在線工具包(SMS)對洋常春藤FPS 的cDNA序列進行序列氨基酸翻譯；利用BLAST搜索NCBI上的FPS核苷酸和氨基酸數(shù)據(jù)庫，比對數(shù)據(jù)庫中洋常春藤近緣物種的FPS序列信息；用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；用在線工具ProtParam、TMHMM與PSORT、SOPMA、ScanProsite和SWISS–MODEL分別預(yù)測或分析洋常春藤FPS蛋白的基本理化性質(zhì)、蛋白的跨膜區(qū)與定位、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、蛋白功能結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

2　結(jié)果與分析

2.1洋常春藤總RNA提取與FPS基因擴增結(jié)果

由圖1可見，所提取洋常春藤樣品總RNA的28 S和18 S的條帶完整清晰，且28 S的亮度是18 S 的2倍左右，表明所提取總RNA的完整性較好。用紫外分光光度法測得洋常春藤樣品總RNA的OD260 nm與OD280 nm的比值為1.91，OD260 nm與OD230 nm的比值為2.10，表明總RNA的純度較高，可用于后續(xù)試驗。

圖1　洋常春藤總RNA的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretogram of total RNA from RT–PCR products of Hedera helix

參照PrimeScriptTMⅡ 1ststrand cDNA synthesis Kit使用說明，成功獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，并將其作為洋常春藤FPS基因的擴增模板。用所設(shè)計的特異引物進行洋常春藤FPS基因PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)表明，擴增產(chǎn)物條帶單一且清晰，大小為1 050 bp，符合預(yù)期。將此擴增產(chǎn)物進行切膠、純化和回收。

圖2　洋常春藤FPS基因產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of RT–PCR products from gene FPS in Hedera helix

2.2洋常春藤FPS基因的cDNA克隆

培養(yǎng)皿內(nèi)菌落長勢一致，分布平均，陽性率高達90%。菌落PCR擴增后經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)，得到陽性克隆片段的長度與上述以cDNA為模板得到的擴增產(chǎn)物的長度相符，表明上述擴增片段已經(jīng)連接到pEASY?–T1 Simple載體上，洋常春藤FPS基因的cDNA已被克隆。

圖3　菌落的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Result of PCR identification from colonies

2.3洋常春藤FPS基因cDNA序列的同源性分析

試驗獲得的洋常春藤FPS基因的cDNA片段長度為1 050 bp。該片段的翻譯起始位點在第16位堿基處，終止密碼子TAA位于1 042 bp處。FPS基因的開放閱讀框共1 026個堿基，編碼342個氨基酸(圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。洋常春藤FPS基因的核苷酸序列與刺五加(JQ178346.1)、人參(DQ087959.1)、西洋參(GQ401664.1)、三七(DQ059550.1、KJ804175.1)和遼東楤木(HM219226.1、JX067865.1)的FPS核苷酸序列的相似性最高，分別為98%、97%、97%、97% 和97%；與傘形科植物積雪草(AY787627.1)、北柴胡(HQ123429.1)和菊科三脈紫菀(JX424564.1)的核苷酸序列的相似性較低，分別為91%、88%和82%，上述8種植物的FPS氨基酸序列與洋常春藤FPS氨基酸序列的一致性分別為97%、97%、97%、97%、96%、94%、93%和86%。在GenBank中未查詢到五加科洋常春藤植物的FPS基因序列信息。

圖4　洋常春藤FPS基因的cDNA序列及推測的氨基酸序列Fig.4 Deduced sequence of amino acid and cDNA of gene FPS in Hedera helix

2.4洋常春藤FPS蛋白的系統(tǒng)進化分析結(jié)果

用MEGA 6.06軟件，將洋常春藤FPS蛋白與GenBank中登錄的20種雙子葉植物的FPS蛋白進行聚類分析，構(gòu)建FPS蛋白系統(tǒng)進化樹(圖5)。洋常春藤FPS蛋白首先與刺五加聚為一支，可信度達84%；后與三七、人參、西洋參和遼東楤木等五加科植物的FPS蛋白聚為一支，可信度達97%；再與同一傘形目植物積雪草聚為一支，可信度達100%，說明洋常春藤FPS蛋白與五加科、傘形目植物的FPS蛋白親緣關(guān)系最近。洋常春藤FPS蛋白與雙子葉植物如葫蘆目、豆目等的FPS蛋白聚為一大支，這與傳統(tǒng)的分類結(jié)果一致，表明洋常春藤FPS蛋白與其他雙子葉植物FPS蛋白是從同一祖先進化而來，它們具有相似的酶催化功能。

圖5　洋常春藤FPS蛋白的系統(tǒng)進化分析結(jié)果Fig.5 Phylogenetic tree of protein FPS in Hedera helix

2.5 洋常春藤FPS蛋白的預(yù)測分析

用Expasy在線工具的ProtParam預(yù)測蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，測得洋常春藤FPS蛋白的相對分子質(zhì)量為39 735.7，理論等電點(pI)為5.55。由PSORT分析結(jié)果得知，洋常春藤FPS蛋白存在于細胞質(zhì)之中。由TMHMM分析結(jié)果得知，洋常春藤FPS蛋白全部定位于細胞膜外，無跨膜區(qū)域。洋常春藤FPS蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖6)中含有220個α螺旋(alpha helix)，占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的59.06%；含有34個延伸鏈(extended strand)，占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的9.94%；含有15個β折疊(beta turn)，占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的4.39%；含有91個無規(guī)則卷曲(random coil)，占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的26.61%。由ScanProsite分析洋常春藤FPS蛋白功能結(jié)構(gòu)域的結(jié)果得知，F(xiàn)PS的氨基酸序列含有2個天冬氨酸保守結(jié)構(gòu)區(qū)域(一般為特異性識別異戊烯基轉(zhuǎn)移酶所具有)。這2個天冬氨酸保守結(jié)構(gòu)區(qū)域在洋常春藤FPS氨基酸序列的90～104和224～236位置處，分別為LVLDDIMDSSHTRRG和MGTYFQVQDDYLD。用SWISS–MODEL預(yù)測，得到了洋常春藤FPS蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型(圖7)。模型覆蓋范圍為4～342；模型序列與同源模型序列的一致性為83.53%；模型樣本是[4kk](2.1.?)。

圖6　洋常春藤FPS蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.6 Predicted secondary structure of protein FPS in Hedera helix

圖7　洋常春藤FPS蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.7 Predicted 3D structure of protein FPS in Hedera helix

3　結(jié)論與討論

高質(zhì)量的RNA是RT–PCR及基因克隆成功的重要保證，但洋常春藤是一種多糖多酚藤本植物，用一般的提取方法來得到其核酸有一定的難度[19]，因此，試驗中采用了多糖多酚植物總RNA的提取試劑和提取方法并稍加改進。

三萜皂苷類化合物是經(jīng)異戊二烯途徑產(chǎn)生的，該途徑分為起始階段、骨架構(gòu)建階段和修飾階段共三個階段。起始階段是該途徑中生成前提物質(zhì)必不可少的環(huán)節(jié)。FPS在起始階段起著重要的作用，它能使香葉二磷酸(geranyl pyrophosphate, GPP)轉(zhuǎn)化成FPP，最終獲得不同類型的三萜皂苷類化合物[6]。本試驗中克隆獲得的洋常春藤FPS的核苷酸和氨基酸序列與其他植物的FPS相比均有同源性，其中與五加科植物刺五加、人參、三七、西洋參、遼東楤木的一致性最高，均高達97%；雙子葉植物系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，洋常春藤的FPS蛋白先與五加科植物的FPS蛋白聚為一支，說明它們的親緣關(guān)系最近。這也證實了洋常春藤植物與五科植物的FPS基因有同源性。洋常春藤FPS基因的同源性分析結(jié)果與預(yù)期結(jié)果[14]相符，這一結(jié)果也符合傳統(tǒng)的植物分類規(guī)則。

洋常春藤FPS的氨基酸序列含有2個特異性識別天冬氨酸保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，位于序列的90～104 (LVLDDIMDSSHTRRG)和224～236(MGTYFQVQD DYLD)位置上。此預(yù)測結(jié)果與邢朝斌等[17]對刺五加FPS基因的分析研究結(jié)果完全一致。這2個富含天冬氨酸的結(jié)構(gòu)域DDXXD被認(rèn)為是酶與底物的結(jié)合位點，是這一類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的活性中心[20]。這表明克隆得到的洋常春藤FPS基因?qū)儆谠摷易濉?/p>

洋常春藤FPS蛋白定位于細胞質(zhì)之中，它可以為合成萜類化合物的前體提供物質(zhì)保障。此外，該蛋白僅存在于細胞膜外，無跨膜區(qū)域，沒有任何隔離cDNA編碼FPS基因的結(jié)構(gòu)，表明洋常春藤可能只有1個FPS基因。該結(jié)果與Xiang等[21]對臘梅FPS基因的研究結(jié)果一致。洋常春藤FPS蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主，無規(guī)則卷曲次之，延伸鏈和β折疊較少；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測模式圖的模型序列與同源模型序列的一致性高達83.53%，說明洋常春藤FPS蛋白與其他物種FPS蛋白的核心結(jié)構(gòu)一致。這也進一步證明洋常春藤的FPS蛋白是一個在萜類化合物合成途徑中起重要作用的功能蛋白[17]。

本研究中成功克隆了洋常春藤的FPS基因，并對該基因的生物學(xué)信息進行了分析。研究結(jié)果表明，洋常春藤的FPS基因片段與其他物種的FPS基因片段具有一定的共同特征[7]，它可能與其他植物的FPS基因起著相同或相似的生物學(xué)功能，參與了三萜皂苷類化合物的生物合成過程[22]。

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責(zé)任編輯：王賽群英文編輯：王 庫

Cloning and sequence analyzing of farnesyl pyrophosphate synthase from Hedera helix

Ruan Qinmei1, Cao Xiongjun1,2, Sun Huapeng1, Zhong Xiaohong1*
(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Grape and Wine Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Science, Nanning 530007, China)

Abstract:In this study, cDNA encoded farnesyl diphosphate synthase (FPS) was cloned using homology RT–PCR method from Hedera helix leaves. The results revealed that sequence of the cDNA with 1 050 bp base had an open reading frame of 1 026 bp and 342 amino acid residues. The sequence of nucleotides and amino acids of FPS were homology with those of araliaceous plants; according to the online prediction, the FPS, with a 39 735.7 relative molecular mass of the protein, stored in cytoplasm and located in the outer membrane; the speculated FPS contained two conserved domains of aspartic acid, and its secondary structure was mainly dominated with alpha helix and random coil; phylogenetic analysis on amino acid sequence of the FPS in dicotyledons showed that the FPS was closely related to Eleutherococcus senticosus, Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolius and Aralia elata, which were consistent with the traditional classification rules.

Keywords:Hedera helix; farnesyl pyrophosphate synthase; homology; Araliaceous plants

中圖分類號：Q943.2

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1007?1032(2016)02?0136?06

收稿日期：2015–07–08 修回日期：2016–03–07

基金項目：湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2014B290)；湖南省教育廳科研項目(15A089)

作者簡介：阮琴妹(1989—)，女，福建周寧人，碩士研究生，主要從事園藝植物功能成分利用研究，1182134891@qq.com；*通信作者，鐘曉紅，教授，主要從事藥用植物資源高值化利用研究，xh–zhong@163.com