基因A型鴨甲肝病毒弱毒株免疫雛鴨的8種細(xì)胞因子mRNA變化分析

張煥容，張　冰，王　棟，岳　華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

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基因A型鴨甲肝病毒弱毒株免疫雛鴨的8種細(xì)胞因子mRNA變化分析

張煥容*，張冰，王棟，岳華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

為研究基因A型鴨甲肝病毒(DHAV-A)MY弱毒株對雛鴨細(xì)胞因子表達(dá)的影響，闡明細(xì)胞因子在DHAV-A弱毒疫苗免疫中的作用，利用熒光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法，檢測DHAV-A MY弱毒株接種1日齡SPF雛鴨后0.25、0.5、1、2、3和5 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝、脾和腦組織中IFN-α、IFN-β、IFN-γ，以及IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α共8種細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，并結(jié)合各時(shí)間點(diǎn)DHAV-A的荷載量進(jìn)行分析。結(jié)果表明：肝和腦組織中2 d時(shí)間點(diǎn)以及脾組織中3 d時(shí)間點(diǎn)病毒荷載量達(dá)到最高；三種組織中，8種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平均隨著病毒荷載量的增加而升高，且在各組織病毒荷載量最高時(shí)間點(diǎn)，8種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著升高(P<0.01)，結(jié)果證明DHAV-A MY弱毒株可刺激雛鴨抗病毒細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α以及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄，本研究豐富了DHAV-A MY弱毒株的免疫機(jī)制。

基因A型鴨甲肝病毒；弱毒株；細(xì)胞因子；熒光定量RT-PCR

基因A型鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus genotype A，DHAV-A)，是一種能夠引起雛鴨急性高度致死性的傳染性病原，雛鴨表現(xiàn)為急性發(fā)病、肝病變和高死亡率，主要危害4周齡以內(nèi)的雛鴨。DHAV-A屬于小RNA 病毒，入侵機(jī)體后主要感染鴨肝、脾和腦組織細(xì)胞，該病毒能夠與細(xì)胞膜上特定受體結(jié)合并進(jìn)入宿主細(xì)胞，大量復(fù)制，破壞細(xì)胞平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加劇病程發(fā)展[1]。為了預(yù)防DHAV-A的感染，研究者們把分離的DHAV-A野毒經(jīng)過雞胚傳代弱化，培育出能夠激發(fā)雛鴨免疫又不致病的弱毒疫苗株。本研究中的DHAV-A MY株即為本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過雞胚傳代弱化培育的弱毒株。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(RRT-PCR)廣泛應(yīng)用于病毒定量和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄等方面的研究。細(xì)胞因子在機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫、抗感染免疫、抗腫瘤免疫、抗排斥反應(yīng)、自身免疫疾病治療以及機(jī)體造血等方面都具有重要作用，其研究是當(dāng)代免疫學(xué)研究中最為活躍的領(lǐng)域之一[2]。本研究選取與細(xì)胞免疫和體液免疫密切相關(guān)的8種細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α[3-5]，采用RRT-PCR檢測DHAV-A MY弱毒株接種雛鴨后病毒增殖以及8種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，以期通過檢測IFN和TNF以及IL 等細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)表達(dá)，深入了解DHAV-A弱毒株刺激雛鴨后機(jī)體細(xì)胞因子的活化水平，為闡明DHAV-A MY弱毒株免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1基因A 型鴨甲肝病毒弱毒株和SPF鴨胚基因A 型鴨甲肝病毒(DHAV-A)MY株弱毒株(TCID50=10-5.60·100 μL-1)，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；SPF鴨胚購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，自行孵化，隔離飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑Trizol?試劑購自Invitrogen 公司；PrimescriptTMRT、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自TaKaRa 公司。

1.2方法

1.2.1雛鴨分組接種DHAV-A MY弱毒株與樣品采集48 只1 日齡SPF 雛鴨隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對照組，每組24只，試驗(yàn)組每只雛鴨腿部肌肉注射0.5 mL 10 000 ×TCID50DHAV-A MY 弱毒株，對照組每只雛鴨相同途徑注射0.5 mL無菌生理鹽水，于注射后0.25、0.5、1、2、3和5 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)取4只雛鴨，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，采取雛鴨肝、脾和腦組織置于液氮中，用于提取組織的總RNA。

1.2.2總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照Trizol?試劑盒說明書提取肝、脾和腦組織中的總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3引物根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，合成鴨內(nèi)參基因β-actin及DHAV-A、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α 引物(表1)。

1.2.4熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件內(nèi)參基因、細(xì)胞因子及DHAV-A的熒光定量PCR反應(yīng)體系均為25 μL：SYBR Green Ⅰ master mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL (10 μmol·L-1)，cDNA模板2 μL，補(bǔ)充去離子水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s；優(yōu)化的DHAV-A和IL-8退火溫度為60 ℃，IFN-α退火溫度為64 ℃，IFN-β退火溫度為56 ℃，IFN-γ退火溫度為62 ℃，IL-1β退火溫度為54 ℃，IL-2退火溫度為59 ℃，IL-6和TNF-α退火溫度為58 ℃，β-actin退火溫度為61 ℃；退火31 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(表2)。1.2.5數(shù)據(jù)處理以β-actin作為內(nèi)參基因，利用公式2-△△Ct相對定量方法對各細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平和病毒拷貝數(shù)進(jìn)行相對定量分析。計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只雛鴨(n=4)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 17.0軟件的t檢驗(yàn)方法分析樣本之間的差異性，其中P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1DHAV-A MY弱毒在雛鴨肝、脾及腦組織中的增殖情況

結(jié)果顯示，肝和腦組織中病毒荷載量在接毒后2 d達(dá)到最高值，分別是對照組的280.14倍(P<0.01)和4.40倍(P<0.05)，脾中病毒荷載量在接毒后3 d達(dá)到最高值，為對照組的86.6倍(P<0.05)，雛鴨接種DHAV-A MY弱毒后0.25～1 d時(shí)間段各時(shí)間點(diǎn)，肝、脾和腦組織中病毒荷載量較低，在2 d時(shí)迅速上升(P<0.01)，肝中病毒荷載量最高，隨后肝中病毒荷載量大幅度下降(P<0.01)，2～5 d時(shí)間段各時(shí)間點(diǎn)，三種組織中病毒荷載量極顯著高于對照組(P<0.01)(圖1)。

**.P<0.01圖1　DHAV-A MY弱毒接種雛鴨肝、脾和腦組織中DHAV-A的增殖情況Fig.1　Proliferation of attenuated DHAV-A in the liver，spleen and brain tissues of attenuated DHAV-A MY strain injected ducklings

2.2雛鴨接種DHAV-A MY弱毒株后肝、脾和腦細(xì)胞`因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

雛鴨接種DHAV-A MY弱毒株后0.25、0.5、1、2、3和5 d各時(shí)間點(diǎn)，IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α 以及IFN-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA在肝、脾和腦中的轉(zhuǎn)錄水平分別如圖2～4所示。在 2 d 時(shí)間點(diǎn)，肝組織中除IL-2、IL-6、IL-8外，其余5種細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高 (P<0.01)；3 d時(shí)間點(diǎn)，脾組織中除TNF-α外，7種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P<0.01)；5 d 時(shí)間點(diǎn)，腦組織中8種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高 (P<0.01)。

**.P<0.01，*.0.01

**.P<0.01，*.0.01

**.P<0.01，*.0.01

3　討　論

利用RRT-PCR 方法檢測雛鴨接種DHAV-A MY弱毒株后肝、脾和腦組織中病毒復(fù)制情況，發(fā)現(xiàn)接種后6 h即可在以上組織中檢測到病毒，肝中病毒荷載量2 d 時(shí)達(dá)到峰值，這與C.Q.Gu等[1]研究結(jié)果類似。但DHAV-A MY弱毒株在組織中的增殖呈一過性，免疫后3 d肝中病毒含量迅速下降，而C.Q.Gu等[1]和楊苗[11]研究顯示雛鴨感染DHAV-A強(qiáng)毒JX株和XC株后3 d時(shí)病毒荷載量仍非常高，并持續(xù)1月。汪銘書等[12]利用Dot-ELISA方法檢測雛鴨接種DHAV-A弱毒株QL79株后各組織器官DHAV-A 弱毒分布，結(jié)果表明雛鴨接種DHAV-A 弱毒QL79株后很難在雛鴨腦組織中檢測到DHAV-A，這與本試驗(yàn)中腦組織病毒荷載量極低的結(jié)果相符。DHAV-A MY弱毒株在雛鴨體內(nèi)有限制增殖和難以通過血腦屏障是其作為安全的弱毒疫苗候選株的重要生物學(xué)特征。

程安春等[13]認(rèn)為DHAV-A弱毒苗免疫雛鴨后到達(dá)免疫器官脾刺激了雛鴨的免疫應(yīng)答反應(yīng)，隨后抑制了肝和脾組織中疫苗毒的復(fù)制，本研究得到了與之相同的結(jié)果。雛鴨接種DHAV-A MY弱毒后，隨著弱毒在肝、脾和腦組織中病毒荷載量的升高，誘導(dǎo)各組織細(xì)胞高水平表達(dá)多種細(xì)胞因子，2 d時(shí)肝組織和腦組織中病毒荷載量達(dá)到峰值，此時(shí)，各種細(xì)胞因子在肝和腦組織中的表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)；脾中病毒荷載量在3 d時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值時(shí)，各種細(xì)胞因子在脾組織中的表達(dá)水平也極顯著升高(P<0.01)；說明病毒的增殖可以活化雛鴨的細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)。C.Q.Gu等[1]研究顯示雛鴨感染DHAV-A強(qiáng)毒JX株2～5 d時(shí)IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，而本試驗(yàn)中雛鴨接種DHAV-A MY弱毒株2～5 d 時(shí)IFN-α mRNA 水平升高，這種反差說明DHAV-A弱毒株可以促進(jìn)干擾素的表達(dá)從而抑制病毒的增殖，而DHAV-A強(qiáng)毒株可以抑制干擾素生成從而導(dǎo)致強(qiáng)毒株的感染。3種干擾素中IFN-α 轉(zhuǎn)錄水平最高，說明了IFN-α在隨后的抗DHAV-A弱毒株增殖中起主要作用。DHAV-A MY弱毒株接種后3～5 d，肝和腦中荷載量快速下降，各種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄量也快速下降，說明由于弱毒株的下降，導(dǎo)致其對細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用減弱。脾組織中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平在DHAV-A MY弱毒株接種后3～5 d仍極顯著高于肝和腦組織中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平，這與脾中病毒荷載量晚于肝和腦達(dá)到高峰相一致，且脾是機(jī)體最重要的免疫器官，能在病毒的誘導(dǎo)下產(chǎn)生高水平細(xì)胞因子。雛鴨接種DHAV-A MY弱毒后，鴨IFN-α、IFN-β 和IFN-γ的大量表達(dá)能夠在肝、脾和腦組織中起到很好的抗病毒作用，可有效減少DHAV-A MY弱毒對雛鴨肝、脾和腦組織等的損傷。

IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8都是和炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子。雛鴨接種DHAV-A MY弱毒后0.25～1 d 時(shí)，DHAV-A MY弱毒增殖刺激了單核-巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致鴨IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8的快速轉(zhuǎn)錄，這與郭智莉的研究結(jié)果一致[14]，雛鴨免疫DHAV-A MY弱毒2 d時(shí)，肝組織中DHAV-A 弱毒荷載量達(dá)到最大值，鴨IL-1β和IL-2 mRNA 的轉(zhuǎn)錄量反而比1 d時(shí)下降，說明病毒的大量增殖對鴨IL-1β和IL-2 mRNA 的轉(zhuǎn)錄起到了一定的抑制作用[15]。

文獻(xiàn)報(bào)道[8，15]TNF-α可以參與機(jī)體防御反應(yīng)起到免疫調(diào)節(jié)作用，且不依賴宿主的其他免疫因素就能起到獨(dú)立的抗病毒作用，是一種重要的抗病毒細(xì)胞因子。本研究中，肝、脾和腦組織中鴨TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄量升降與相應(yīng)組織中DHAV-A弱毒荷載量的升降趨勢一致，說明在雛鴨接種DHAV-A弱毒后誘導(dǎo)了鴨TNF-α的表達(dá)從而通過免疫調(diào)節(jié)起到了抑制病毒增殖的作用。

4　結(jié)　論

通過對SPF 雛鴨接種DHAV-A MY 弱毒株后組織中8種細(xì)胞因子mRNA的定量檢測，證明DHAV-A MY弱毒可刺激雛鴨抗病毒細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α以及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄，對采用新的方法評估DHAV-A弱毒疫苗的安全性和免疫機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

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(編輯白永平)

mRNA Change Analysis of Eight Cytokines in Ducklings Stimulated by Attenuated Duck Hepatitis A Virus Genotype A MY Strain

ZHANG Huan-rong*，ZHANG Bing，WANG Dong，YUE Hua

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

In order to explore the roles of cytokines responding to attenuated duck hepatitis A virus genotype A (DHAV-A) vaccine immunization，the effects of attenuated DHAV-A MY strain on cytokine transcription in ducklings were analyzed.The mRNA transcription levels of 8 cytokines，such as IFN-α，IFN-β，IFN-γ and IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8，and TNF-α，were determined by RRT-PCR in liver，spleen and brain of ducklings at different time points of 0.25 0.5，1，2，3 and 5 days post attenuated DHAV-A MY strain injecting 1-day-old SPF ducklings，and the virus loads of DHAV-A MY strain in liver，spleen and brain were also detected by RRT-PCR.The results indicated that the virus load reached the highest level in liver and brain at 2 d time point，and at 3 d time point in spleen post attenuated DHAV-A MY strain injection.The mRNA transcription levels of 8 cytokines in liver，spleen and brain up-regulated very significantly at the corresponding time points when the virus load reached the highest level post DHAV-A MY strain injection (P<0.01).The results indicated that attenuated DHAV-A MY strain could stimulate the transcription of anti-viral cytokines IFN-α，IFN-β，IFN-γ and TNF-α，as well as proinflammatory cytokines IL-1β，IL-2，IL-6 and IL-8，our results enrich the immunization mechanism of DHAV-A MY strain.

duck hepatitis A virus genotype A；attenuated strain；cytokine；RRT-PCR

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.017

2015-11-25

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014NZYQN58); 國家民委科技項(xiàng)目(14XNZ025)

張煥容(1968-)，女，重慶江津人，博士，教授，主要從事動(dòng)物傳染病研究，Tel：028-85522727

張煥容, E-mail：zhrong05@163.com

S855.3

A

0366-6964(2016)06-1215-07