應(yīng)用多重GeXP-PCR同時檢測6種雞免疫抑制病病毒的研究

曾婷婷，謝芝勛，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，羅思思，黃　莉，黃嬌玲

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，南寧 530001)

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應(yīng)用多重GeXP-PCR同時檢測6種雞免疫抑制病病毒的研究

曾婷婷，謝芝勛*，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，羅思思，黃莉，黃嬌玲

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，南寧 530001)

擬建立一種基于GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)的多重PCR方法，同時檢測6種雞免疫抑制病病毒——雞馬立克病毒、禽白血病病毒(包括A、B和J亞群)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒、禽呼腸孤病毒、雞傳染性貧血病毒和傳染性法氏囊炎病毒。多重PCR反應(yīng)使用嵌合引物和通用引物組合的反應(yīng)體系，經(jīng)過GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，鑒別PCR產(chǎn)物片段；通過調(diào)整嵌合引物濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度優(yōu)化反應(yīng)體系及調(diào)整退火溫度和時間優(yōu)化反應(yīng)條件。應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR，分別單獨(dú)和同時檢測6種雞免疫抑制病病毒的8個目的基因，同時以其他常見禽類病毒和雞組織器官核酸為對照，驗(yàn)證其特異性；檢測8個目的基因不同濃度的克隆質(zhì)粒，驗(yàn)證其敏感性；應(yīng)用建立的多重PCR檢測300份臨床樣品，并同時用熒光定量PCR和測序驗(yàn)證其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明建立的多重GeXP-PCR方法能夠分別擴(kuò)增出6種病毒，8個特異性目的片段，不能擴(kuò)增其他常見禽類病毒和雞組織器官的基因；在低至100 copies·20 μL-1的水平能同時特異性地檢測出6種雞免疫抑制病病毒核酸；檢測300份臨床病死雞樣品，190份樣品顯示為陽性，PCR和測序結(jié)果與多重GeXP-PCR結(jié)果相符。本研究建立的多重GeXP-PCR方法可特異、敏感、高通量地檢測6種雞免疫抑制性病毒，可用于臨床鑒別診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查，具有很高的臨床應(yīng)用價值。

GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)；多重PCR；高通量；雞免疫抑制病病毒

GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001，China)

雞免疫抑制病病毒主要包括雞馬立克病毒(Marek’s disease virus，MDV)[1]、禽白血病病毒(avian leucosis virus，ALV，以A、B和J亞群ALV為主)[2]、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)[3]、禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)[4]、雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anaemia virus，CIAV)[5]和傳染性法氏囊炎病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)[6-7]，這些病毒都能破壞雞的免疫功能造成免疫抑制。雞群感染免疫抑制病病毒后，對致病菌和其他病毒更加易感，發(fā)生繼發(fā)感染，接種疫苗后達(dá)不到預(yù)期免疫效果[8-9]，飼料報酬降低和生長緩慢。雞感染這些病毒后的臨床癥狀各有不同，但有些不是馬上表現(xiàn)出來。雞感染MDV、ALV和REV后，免疫抑制比腫瘤出現(xiàn)早得多[1，3]。小于3周齡的雛雞感染IBDV有時不會出現(xiàn)典型癥狀，但仍出現(xiàn)免疫抑制[9]。超過3周齡的雛雞感染CIAV后，能產(chǎn)生一定的免疫力，不會引起貧血，但仍然會發(fā)生免疫抑制[10]。臨床上常見幾種免疫抑制病毒混合感染，使診斷更加困難[11-12]。

故對以上所述病毒感染進(jìn)行鑒別診斷和檢測尤為重要。常規(guī)的檢測方法是病毒分離，需要花費(fèi)較長的周期。普通PCR、熒光PCR和LAMP等分子生物學(xué)方法檢測病毒比較快速，但一個反應(yīng)體系只能檢測2～4種病毒。

GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)是一種新的、高通量的基因檢測平臺[13]。通過毛細(xì)管電泳鑒定經(jīng)過熒光基團(tuán)標(biāo)記的多重PCR產(chǎn)物。PCR體系使用嵌合引物和通用引物組合，嵌合引物由特異性引物的5′端添加通用引物組成。上游嵌合引物由特異性引物和連接在其5′端的通用引物組成，通用引物的5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)，下游嵌合引物亦由特異性引物和連接在其5′端的通用引物組成，但不標(biāo)記熒光基團(tuán)。設(shè)計引物時，使每對引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物之間至少相差7～10 bp，然后通過毛細(xì)管電泳辨認(rèn)擴(kuò)增片段大小。這項(xiàng)技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于診斷多種疾病，如同時檢測11種人乳頭瘤病毒[14]，9種血清型的手足口病[15]，癌癥基因[16]，7種腸炎病毒[17]和人的H1N1病毒[18]。這項(xiàng)技術(shù)第一次應(yīng)用于獸醫(yī)領(lǐng)域是2014年本實(shí)驗(yàn)室用于檢測9種雞呼吸道病原[19]。

本研究旨在建立一種同時檢測MDV、ALV-A/B/J、REV、CIAV、IBDV和ARV的多重GeXP-PCR方法。

1　材料與方法

1.1動物福利聲明

本研究經(jīng)過廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所的動物福利委員會批準(zhǔn)，所使用的雞胚和SPF雞均符合動物福利標(biāo)準(zhǔn)，動物宰殺和樣品采集過程按照章程將動物的痛苦降至最低。

1.2病毒毒株和臨床樣品采集

本研究中所使用病毒毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存，如表1所示。MDV、ALV-A/B/J和REV使用SPF雞胚制作的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)增殖，IBDV和ARV使用9日齡SPF雞胚增殖，CIAV使用1日齡SPF雛雞增殖，雛雞腹膜注射含病毒的組織上清液，2周后收集雛雞骨髓。臨床樣品采自送檢病死雞，共300羽病死雞，包括雞胸腺、法氏囊、脾、肝、骨髓和血液，將這些組織混合勻漿保存。病死雞的日齡介于50～135 d，包括種雞、蛋雞和肉雞。

表1毒株來源

Table 1Sources of pathogens

病原Pathogen來源Source參考毒株Referenceviruses 馬立克病毒Marek’sdiseasevirusKC453972,KC453973,GX130112,GX140301,050118,070123,090201,100428GVRI 禽白血病病毒A亞群AvianleucosisvirussubgroupAisolateRSV-1CVCC 禽白血病病毒A亞群AvianleucosisvirussubgroupAisolateGX110521,GX110522,ALVA01,ALVA02,ALVA03GVRI 禽白血病病毒B亞群AvianleucosisvirussubgroupBisolateRSV-2CVCC 禽白血病病毒B亞群AvianleucosisvirussubgroupBisolateGX111230,GX130401,ALVB15,ALVB23,ALVB28GVRI 禽白血病病毒J亞群AvianleucosisvirussubgroupJisolateKC453974,KC453975,GX090201,GX090521,GX110110,GX120081,GX130018,GX140010GVRI 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒ReticuloendotheliosisvirusAV235CVCC 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒ReticuloendotheliosisvirusKC453976,KC453977,GX120825,GX131118GVRI 禽呼腸孤病毒AvianreovirusS1133,1733,526,C78,GuangxiR1,GuangxiR2,GX110058GVRI 傳染性法氏囊炎病毒InfectiousbursaldiseasevirusCA,AV162,AV144CVCC 傳染性法氏囊炎病毒InfectiousbursaldiseasevirusAV6CIVDC 傳染性法氏囊炎病毒Infectiousbursaldiseasevirus070124,080113,090053,100008,110110,130223GVRI 雞傳染性貧血病毒ChickeninfectiousanaemiavirusCAU0728,CAU0729,CAU0730,CAU0731,CAU0732CVCC 雞傳染性貧血病毒ChickeninfectiousanaemiavirusGXC060821GVRI其他病毒Otherviruses 禽流感病毒InactivatedH5N1avianinfluenzavirusRe-1HVRI 禽流感病毒AvianinfluenzavirusH9N6/Duck/HK/147/77HKU 禽流感病毒AvianinfluenzavirusH7N2/chickenPA/3979/97PU 新城疫病毒NewcastlediseasevirusF48E9GVRI 新城疫病毒NewcastlediseasevirusGX6/02GVRI 雞傳染性支氣管炎病毒InfectiousbronchitisvirusMassachusetts41GVRI 雞傳染性喉氣管炎病毒InfectiouslaryngotracheitisvirusAV1231CIVDC 雞滑液囊支原體MycoplasmasynoviaeCAU0748CVCC

HVRI.哈爾濱獸醫(yī)研究所；HKU.香港大學(xué)；GVRI.廣西獸醫(yī)研究所；CIVDC.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；PU.賓夕法尼亞大學(xué)；CVCC.中國獸醫(yī)微生物保藏中心

HVRI.Harbin Veterinary Research Institute，China；HKU.University of Hong Kong，China；GVRI.Guangxi Veterinary Research Institute，China；CIVDC.China Institute of Veterinary Drugs Control，China；PU.University of Pennsylvania，USA；CVCC.China Veterinary Culture Collection Centre，China

1.3試劑與儀器

RNA/DNA共提試劑盒(E.Z.N.A.?Total DNA/RNA Isolation Kit)購自O(shè)MEGA(Norcross，GA，USA)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript II Reverse Transcriptase[M-MLV，RNase-](High Temperature RT)購自全式金生物(北京，中國)；多重PCR試劑盒Genome Lab GeXP Starter Kit購自貝克曼(Beckman Coulter，Brea，USA)；樣品緩沖液，DNA Marker，上樣板，液體石蠟均購自貝克曼(Beckman Coulter，Brea，USA)；pGEM-T載體購自Promega(Madison，USA)，普通PCR酶，膠回收試劑盒，感受態(tài)細(xì)胞購自全式金生物(北京，中國)；限制性內(nèi)切酶SpeⅠ購自寶生物(大連，中國)；DNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒RiboMAX Large Scale RNA Production Systems SP6/T7 Kit購自Promega(Madison，USA)；PCR儀購自Thermo (Milford，USA)；超微量分光光度計NanoDrop 2000購自Thermo Fisher Scientific(Milford，USA)；GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)GenomeLab GeXP Genetic Analysis System購自貝克曼(Beckman Coulter，Brea，USA)。

1.4 RNA/DNA抽提和RNA反轉(zhuǎn)錄

使用RNA/DNA共提試劑盒抽提MDV毒株細(xì)胞培養(yǎng)物；REV和 ALV-A/B/J毒株細(xì)胞培養(yǎng)物(含有REV和 ALV-A/B/J的前病毒DNA，proviral DNA)[20]，CIAV人工感染SPF雞的骨髓，IBDV和ARV的雞胚增殖的尿囊液的總RNA/DNA。用無核酸酶超純水溶解抽提好的DNA/RNA，于-80 ℃條件保存?zhèn)溆?。按照說明書將IBDV和ARV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用(反轉(zhuǎn)錄過程對抽提產(chǎn)物中的DNA無影響)。

1.5引物設(shè)計和引物合成

將本實(shí)驗(yàn)室保存毒株的序列與GenBank公布的毒株序列經(jīng)過MEGA5.0軟件比對后，在它們的保守區(qū)域用Primer premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物。通用引物為貝克曼公司專利產(chǎn)品，不與任何現(xiàn)有物種的基因互補(bǔ)配對，序列由貝克曼公司提供。特異性上游引物及其5′端加上通用引物序列，并在通用引物的5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)Cy5組成上游嵌合引物，下游嵌合引物由下游特異性引物及其5′端加上通用引物序列組成，但不標(biāo)記熒光基團(tuán)。所有的嵌合引物由上海英駿生物公司合成和純化。引物序列見表2。

1.6建立多重PCR體系和反應(yīng)程序

應(yīng)用貝克曼Genome Lab GeXP Starter Kit建立多重PCR體系：總反應(yīng)體積為20 μL，其中5× buffer 4 μL，buffer內(nèi)含通用引物，工作濃度為0.25 μmol·L-1；MgCl2(25 μmol·L-1) 2 μL；嵌合引物混合物1 μL；Thermo-Start DNA polymerase 0.35 μL；cDNA/DNA模板 1 μL；無核酸酶超純水補(bǔ)足體積。

多重PCR反應(yīng)程序包括3步：95 ℃ 5 min預(yù)變性后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，結(jié)束反應(yīng)。

1.7毛細(xì)管電泳和結(jié)果分析

取1 μL PCR產(chǎn)物和38.75 μL樣品緩沖液，0.25 μL DNA Marker混合均勻，加入上樣板中，滴加石蠟封閉液體表面。將上樣板置于GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)儀器卡槽中，進(jìn)行高分辨率的毛細(xì)管電泳。不同大小片段的PCR產(chǎn)物在電泳過程中分離，通過PCR產(chǎn)物攜帶的熒光基團(tuán)辨認(rèn)其片段大小和信號強(qiáng)度。電泳完成后，使用儀器自帶軟件eXpress Profiler software分析結(jié)果，橫坐標(biāo)表示片段大小，縱坐標(biāo)表示信號強(qiáng)度，即PCR產(chǎn)物的含量。

1.8基于GeXP的多重PCR方法的特異性和敏感性試驗(yàn)

根據(jù)電泳分析結(jié)果，調(diào)整嵌合引物濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度優(yōu)化反應(yīng)體系及調(diào)整退火溫度和時間優(yōu)化反應(yīng)條件。使用建立的多重GeXP-PCR方法，分別以各毒株核酸、其他常見雞病毒毒株(包括H5/H7/H9 三個血清型的禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒的核酸，以及健康SPF雞的胸腺、脾和法氏囊的核酸為模板)，檢測該方法的特異性。

構(gòu)建多重GeXP-PCR的各目的片段的重組質(zhì)粒，以此為模板測試建立的多重GeXP-PCR方法的敏感性。用特異性引物擴(kuò)增各毒株的目的片段，與pGEM-T載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞增殖，并抽提質(zhì)粒。構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)過純化和測序驗(yàn)證其序列的準(zhǔn)確性。IBDV和ARV的質(zhì)粒經(jīng)過SpeⅠ酶切線性化之后體外轉(zhuǎn)錄為ssRNA。所有DNA質(zhì)粒和ssRNA均用紫外分光光度計測定濃度。以構(gòu)建好的DNA質(zhì)粒和ssRNA為模板，按照建立的多重GeXP-PCR的流程，單一模板的終濃度分別調(diào)整為105copies·20 μL-1至1 copy·20 μL-1，測定多重GeXP-PCR對單一模板的敏感性；將單一模板等濃度混合為多重模板，將每種模板的終濃度均調(diào)整為105copies·20 μL-1至1 copy·20 μL-1，測定多重GeXP-PCR對多重模板的敏感性。

表2引物序列信息

Table 2Primer sequences

病毒Virus引物序列(5'-3')Primersequence擴(kuò)增片段/bpAmpliconsize目的基因Targetregion引物濃度/(μmol·L-1)PrimerconcentrationMDVF:AGGTGACACTATAGAATAAGGGAGCAGACGTACTATGTAGACAAR:GTACGACTCACTATAGGGATGGTAAGCAGTCCAAGGGTCA227meq0.16ALV-AF:AGGTGACACTATAGAATACAAGGGGTTCCTTGGTATCTR:GTACGACTCACTATAGGGATGTGCCTATCCGCTGTCA155gp850.2ALV-BF:AGGTGACACTATAGAATATCAATCACGATTCTCCCACCR:GTACGACTCACTATAGGGATGTGACGCTTCGTTTACGTCTT285gp850.2ALV-JF:AGGTGACACTATAGAATACTGATGCAACAACCAGGAAAR:GTACGACTCACTATAGGGAGCAGTGACATTAGTGACATACCC204gp850.2REVF:AGGTGACACTATAGAATAGACCAGGCGAGCAAAATCR:GTACGACTCACTATAGGGAGGTGTAATAGGTAGGTATGGAGGA182gp900.2IBDVF:AGGTGACACTATAGAATAGGGTCAGGGCTAATTGTCTTR:GTACGACTCACTATAGGGATCTGTCAGTTCACTCAGGCTTC294VP20.2CIAVF:AGGTGACACTATAGAATAAAAGGCGAACAACCGATGAR:GTACGACTCACTATAGGGATGCCCTGGAGGAAAAGACC269VP10.2ARVF:AGGTGACACTATAGAATAGGACCCCTACTTCTGTTCTCAR:GTACGACTCACTATAGGGAATTTCCCGTGGACGACAT215S10.16

F.上游引物；R.下游引物；帶下劃線的為通用引物，嵌合引物由通用引物和特異性引物一起合成組成

F.Forward primer；R.Reverse primer；Universal tag sequences are underlined.Chimeric primers were synthesised using universal tags and specific primers

1.9模擬混合感染和干擾試驗(yàn)

為了測試建立的多重GeXP-PCR方法應(yīng)用于臨床時的準(zhǔn)確性和敏感性，將經(jīng)過病毒分離和測序鑒定確診為免疫抑制病病毒感染的病雞組織器官樣品：胸腺、法氏囊、骨髓、肝和血液隨機(jī)組合并以任意比例混合，抽提總DNA/RNA，按照建立的多重GeXP-PCR方法流程進(jìn)行檢測。

為了測試不同模板之間的濃度差異較大時，不同濃度的模板對建立的多重GeXP-PCR方法引物擴(kuò)增效率的影響和是否仍能敏感的檢測到低濃度的模板，使用不同濃度的陽性毒株核酸(最高模板濃度至少是最低模板濃度的104倍)隨機(jī)組合為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR，并以單一模板為對照進(jìn)行多重GeXP-PCR。如隨機(jī)挑選了ALV-J、MDV和CIAV作為組合。先以探針法熒光定量PCR測定模板濃度，調(diào)整模板終濃度依次為107、102和103copies·20 μL-1進(jìn)行多重GeXP-PCR，同時分別以相同濃度的ALV-J和MDV為單一模板進(jìn)行多重GeXP-PCR。

1.10應(yīng)用建立的多重PCR方法檢測臨床樣品

采集病死雞的胸腺、法氏囊、骨髓、脾、肝和血液，混合勻漿后抽提總DNA/RNA，按照建立的多重GeXP-PCR方法進(jìn)行檢測。同時以本研究設(shè)計的特異性引物進(jìn)行SYBR GreenⅠ定量PCR，并將PCR產(chǎn)物克隆測序，驗(yàn)證陽性結(jié)果。

2　結(jié)　果

2.1特異性試驗(yàn)

經(jīng)過體系優(yōu)化，最終嵌合引物的比例和濃度見表2。應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法，以表1中所列毒株為模板進(jìn)行單一模板特異性試驗(yàn)，經(jīng)過GeXP電泳，均得到特異性單峰，圖1A～H所示為單一模板電泳圖，片段大小與引物設(shè)計預(yù)期相符；進(jìn)行多模板特異性試驗(yàn)，經(jīng)過GeXP電泳，同時得到8個特異性單峰；以表1中其他禽病原體和SPF健康雞組織核酸為模板，無擴(kuò)增片段。單重模板、多重模板均無非特異擴(kuò)增峰，見圖1。

多重GeXP-PCR的單一模板特異性試驗(yàn)：A.ALV-A，155.38 bp；B.ALV-B，284.65 bp；C.ALV-J，204.55 bp；D.MDV，227.35 bp；E.REV，182.64 bp；F.CIAV，268.61 bp；G.ARV，215.83 bp；H.IBDV，294.27 bp；多重GeXP-PCR的多重模板特異性試驗(yàn)：I.6種病毒，8個特異性片段依次為ALV-A，155.80 bp；REV，182.67 bp；ALV-J，204.50 bp；ARV，215.75 bp；MDV，227.16 bp；CIAV，268.59 bp；ALV-B，285.09 bp；IBDV，294.02 bp；J.陰性對照以其他禽病原體和SPF雞組織核酸為模板，單峰為markerThe GeXP-multiplex PCR assay was performed using a single template and mixed primers for the following：A.ALV-A，155.38 bp；B.ALV-B，284.65 bp；C.ALV-J，204.55 bp；D.MDV，227.35 bp；E.REV，182.64 bp；F.CIAV，268.61 bp；G.ARV，215.83 bp；H.IBDV，294.27 bp；I.The GeXP-multiplex PCR assay was performed using mixed templates and mixed primers for the following：8 single products：ALV-A，155.80 bp；REV，182.67 bp；ALV-J，204.50 bp；ARV，215.75 bp；MDV，227.16 bp；CIAV，268.59 bp；ALV-B，285.09 bp；IBDV，294.02 bp；J.Negative control was performed using nucleic acid of others avian viruses and SPF chicken，signal was marker圖1　多重GeXP-PCR特異性試驗(yàn)經(jīng)GeXP電泳結(jié)果Fig.1　Specificity of GeXP-multiplex PCR assay

2.2敏感性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，使用構(gòu)建的DNA質(zhì)?；騭sRNA為單一模板時，ALV-A、ALV-J、REV、CIAV和ARV的最低檢測值為10 copies·20 μL-1；MDV、 ALV-B和IBDV為102copies·20 μL-1。6種病毒8個目的基因的質(zhì)粒和ssRNA等比例混合時，每個目的基因的最低檢測值均為102copies·20 μL-1。圖2所示為多重GeXP-PCR多重模板，每種模板分別為105copies·20 μL-1(A)，104copies·20 μL-1(B)，103copies·20 μL-1(C)和102copies·20 μL-1(D)的電泳結(jié)果。

使用構(gòu)建的DNA質(zhì)粒和ssRNA為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR方法，每個反應(yīng)每種模板分別為A.105 copies·20 μL-1；B.104 copies·20 μL-1；C.103 copies·20 μL-1；D.102 copies·20 μL-1The GeXP-multiplex PCR assay was performed using equal amounts of specific DNA-containing plasmid template and in vitro transcribed ssRNA corresponding to 6 immunosuppressive viruses，8 templates at concentrations：A.105 copies·20 μL-1，B.104 copies·20 μL-1，C.103 copies·20 μL-1，D.102 copies·20 μL-1圖2　多重PCR敏感性試驗(yàn)GeXP電泳結(jié)果Fig.2　Sensitivity of GeXP-multiplex PCR assay

2.3模擬混合感染和干擾試驗(yàn)

將確診為免疫抑制病病毒陽性的病料隨機(jī)混合，應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法進(jìn)行檢測，得到與預(yù)期相符合特異性單峰，圖3所示為隨機(jī)混合ARV 和IBDV，ALV-J和ALV-B以及6種病毒病料混合的電泳結(jié)果。將構(gòu)建的DNA質(zhì)粒和ssRNA按照ALV-J 107copies·20 μL-1，MDV 102copies·20 μL-1和CIAV 103copies·20 μL-1為反應(yīng)體系終濃度的比例混合，應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法進(jìn)行檢測，同時分別以同一濃度的單一模板為對照，結(jié)果顯示，當(dāng)不同模板的濃度懸殊時，仍能準(zhǔn)確敏感地檢測出低濃度的模板，并且多重模板和單一模板的產(chǎn)物濃度相差不大，如圖4所示。

2.4臨床樣品檢測

300份臨床樣品檢測結(jié)果見表3。同時使用本研究中設(shè)計的特異性引物進(jìn)行單重SYBR GreenⅠ定量PCR檢測臨床樣品，將PCR產(chǎn)物克隆測序，并與建立的多重GeXP-PCR對比檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR結(jié)果與定量PCR結(jié)果相符，并且測序結(jié)果顯示陽性結(jié)果均為對應(yīng)的病毒。300份臨床樣品中，190份樣品檢測結(jié)果為陽性，其中單重感染119份，ALV-A 6份，ALV-B 2份，ALV-J 21份，MDV 26份，REV 15份，IBDV 17份，CIAV 9份和ARV 23份；混合感染71份：MDV+ALV-A 4份，MDV+ALV-J 25份，ALV-B+ALV-J 1份，MDV+ALV-J+REV 6份，MDV+CIAV 5份，MDV+REV 6份，ALV-J+REV 3份，IBDV+ALV-J 5份，MDV+CIAV+ALV-J 4份，REV+ARV 3份，ALV-J+ARV 6份，ALV-J+IBDV 3份。

將ARV和 IBDV，ALV-J 和ALV-B，以及6種免疫抑制病病毒的病料為模板，模擬混合感染情況：A.ARV和 IBDV；B.ALV-J 和ALV-B；C.6種免疫抑制病病毒The GeXP-multiplex PCR assay was performed using artificially mixed templates and mixed primers for ARV and IBDV，ALV-J and ALV-B，or 6 immunosuppressive viruses：A.ARV and IBDV；B.ALV-J and ALV-B；C.6 immunosuppressive viruses圖3　多重PCR模擬混合感染的GeXP電泳結(jié)果Fig.3　Artificially mixed templates for the GeXP-multiplex PCR assay

A.ALV-J 107 copies·20 μL-1，MDV 102 copies·20 μL-1 和CIAV 103 copies·20 μL-1的反應(yīng)體系終濃度的比例混合為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR檢測；B.以MDV 102 copies·20 μL-1的濃度為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR檢測；C.以ALV-J 107 copies·20 μL-1的濃度為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR檢測A.The GeXP-multiplex PCR assay was performed using templates for ALV-J 107 copies·20 μL-1，MDV 102 copies·20 μL-1 and CIAV 103 copies·20 μL-1；B.MDV 102 copies·20 μL-1；C.ALV-J 107 copies·20 μL-1圖4　干擾試驗(yàn)多重PCR反應(yīng)經(jīng)GeXP電泳結(jié)果Fig.4　GeXP-multiplex PCR interference assays

表3臨床樣品檢測結(jié)果

Table 3Detection results for clinical specimens

單重感染SingleinfectionMDVALV-AALV-BALV-JREVIBDVCIAVARVMDV+ALV-AMDV+ALV-JALV-B+ALV-J數(shù)量Number2.6622115179234251比例/%Rate8.72.00.77.05.05.73.07.71.38.30.4定量PCR結(jié)果Real-timePCRresults26622115179234251測序結(jié)果Sequencingresults26622115179234251混合感染Co-infectionMDV+ALV-J+REVMDV+CIAVMDV+REVALV-J+REVIBDV+ALV-JMDV+CIAV+ALV-JREV+ARVALV-J+ARVALV-J+IBDV數(shù)量Number656354363比例/%Rate2.01.62.01.51.61.31.02.01.0定量PCR結(jié)果Real-timePCRresults656354363測序結(jié)果Sequencingresults656354363

3　討　論

MDV、ALV (以ALV-A/B/J為主)、REV、IBDV、CIAV 和ARV是引起雞免疫抑制的主要幾種病原，并且常常發(fā)生混合感染，給診斷帶來極大的難度[11-12，21]。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測方法存在比較耗時和每個反應(yīng)檢測項(xiàng)目少的限制，常規(guī)的PCR或定量PCR往往每個反應(yīng)只能檢測2～4種病原。

基于GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)的多重PCR方法，以其優(yōu)越的特異性，敏感性和高通量為同時鑒別診斷以上幾種病原提供了解決方案[22-23]。首先，利用嵌合引物和通用引物組合的3步法的PCR擴(kuò)增程序?yàn)槎嘀豍CR提高了特異性和大大降低引物間互相干擾擴(kuò)增效率的影響。第一步10個循環(huán)的PCR擴(kuò)增是由嵌合引物中的特異性引物部分引發(fā)，特異性引物結(jié)合在目的基因上引發(fā)原始擴(kuò)增，同時通用引物經(jīng)過特別設(shè)計不會與常見的生物序列結(jié)合，故不會出現(xiàn)通用引物引發(fā)的非特異性擴(kuò)增；第二步10個循環(huán)是由嵌合引物引發(fā)，嵌合引物結(jié)合在之前10個循環(huán)的PCR產(chǎn)物的兩端，繼續(xù)進(jìn)行指數(shù)型擴(kuò)增，由于這一步的退火溫度比第一步高13 ℃，特異性引物部分不會再結(jié)合到原始模板上，保證了嵌合引物整體結(jié)合在前10個循環(huán)的PCR產(chǎn)物上；第三步10個循環(huán)主要是通用引物介導(dǎo)的所有PCR產(chǎn)物的同步擴(kuò)增，通用引物結(jié)合在含有通用引物序列的PCR產(chǎn)物上，最大化降低由于不同特異性引物混合對擴(kuò)增效率的影響，使所有的PCR產(chǎn)物都得到幾乎相同的擴(kuò)增效率，避免在檢測臨床樣品時，某種病毒載量較低時導(dǎo)致假陰性。

其次，建立的多重GeXP-PCR方法具優(yōu)良的敏感性。多重PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)過毛細(xì)管電泳辨認(rèn)產(chǎn)物片段大小，結(jié)果與預(yù)期片段大小相差1 bp內(nèi)可判斷為陽性結(jié)果，如ALV-A的預(yù)期PCR產(chǎn)物片段大小為155 bp，若得到的PCR產(chǎn)物含有154～156 bp的片段，即可認(rèn)為ALV-A檢測結(jié)果為陽性。GeXP毛細(xì)管電泳后，經(jīng)過軟件分析，PCR產(chǎn)物以單峰形式呈現(xiàn)，單峰峰值2 000熒光單位(absorbance units，A.U.)以上為陽性擴(kuò)增。本研究的敏感性試驗(yàn)中，多重模板的最低檢測水平為每種模板100 copies·20 μL-1反應(yīng)體系，最小的峰值為9 000 A.U.，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陽性閾值，說明建立的多重GeXP -PCR方法具有優(yōu)良的敏感性。

再次，建立的多重GeXP-PCR方法具高通量的優(yōu)點(diǎn)[16]。GeXP能辨認(rèn)110～400 bp范圍內(nèi)的PCR片段，只要兩個目的片段之間相差7～10 bp即可分辨，故每個反應(yīng)可檢測20個以上目的基因；應(yīng)用嵌合引物和通用引物的多重PCR，一個反應(yīng)也可以同時檢測8個以上目的基因[14，23-25]，比傳統(tǒng)的多重PCR或多重定量PCR每個反應(yīng)檢測目的基因數(shù)目多一倍以上[26-27]。檢測一份樣品，只需抽提一次，PCR加樣一次，電泳一次，即可得到8種以上目的基因的檢測結(jié)果。一個電泳上樣板為96孔板，操作一次GeXP即可檢測96份樣品。這在進(jìn)行大規(guī)模檢測或流行病學(xué)調(diào)查時，尤其凸顯其高通量的優(yōu)勢。

應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法檢測300份臨床樣品，同時用本研究設(shè)計的特異性引物進(jìn)行單重定量PCR檢測，PCR產(chǎn)物測序驗(yàn)證陽性結(jié)果的準(zhǔn)確性為100%。同時經(jīng)過不斷的流行病學(xué)調(diào)查，我們也發(fā)現(xiàn)病毒不斷處于變異的狀態(tài)，故一套多重GeXP-PCR體系將不能長期滿足臨床檢測的需求，需要不斷更新病毒序列信息，設(shè)計更多的引物來達(dá)到應(yīng)對病毒不斷變異的要求。

在實(shí)際操作中，MDV和 CIAV 是DNA病毒，ALV (以ALV-A/B/J為主)、REV、IBDV和ARV是RNA病毒，故使用RNA/DNA共提試劑盒進(jìn)行核酸提取，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對核酸中的DNA成分無影響。同時ALV和REV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，抽提的DNA中也含有病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄嵌入宿主基因組的前病毒DNA，故進(jìn)行多重PCR檢測時，是同時以ALV和REV的基因組RNA和前病毒DNA為模板。

4　結(jié)　論

本研究建立的基于GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)的多重PCR方法，能夠特異、敏感和高通量的鑒別檢測6種雞免疫抑制病病毒，可以成為臨床鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查時的有力工具。

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(編輯白永平)

Simultaneous Detecting Six Immunosuppressive Chicken Viruses by a GeXP Analyser-based Multiplex PCR Assay

ZENG Ting-ting，XIE Zhi-xun*，XIE Li-ji，DENG Xian-wen，XIE Zhi-qin，LUO Si-si，HUANG Li，HUANG Jiao-ling

(GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandDiagnostics，

The objective of this research was to develop a novel，high-throughput Genome Lab Gene Expression Profiler Analyser-based multiplex PCR method (GeXP-multiplex PCR) for simultaneous detection of 6 immunosuppressive chicken viruses.Using chimeric primers，6 immunosuppressive chicken viruses，including Marek’s disease virus (MDV)，three subgroups of avian leucosis virus (ALV-A/B/J)，reticuloendotheliosis virus (REV)，infectious bursal disease virus (IBDV)，chicken infectious anaemia virus (CIAV) and avian reovirus (ARV) were amplified and identified by their respective amplicon sizes.The concentration of the chimeric primers，Mg2+andTaq，and annealing temperature，and time were optimised according to the amplification efficiency of the GeXP-multiplex PCR assay.The assay specificity for each immunosuppressive viral target was individually and simultaneously tested with a mixture of 8 sets of chimeric primers in a multiplex PCR assay.Plasmid DNA and transcribed ssRNA were diluted to a final concentration ranging from 105copies·20 μL-1to 1 copy·20 μL-1and then subjected to the GeXP-multiplex PCR assay with 8 sets of chimeric primers，both individually and in pre-mixed solutions.A total of 300 clinic specimens of disease chicken were detected by using GeXP-multiplex PCR.The results were confirmed using independent real-time PCR and sequencing to determine true positives.The specificity and sensitivity of the optimised GeXP-multiplex PCR assay were evaluated，and the data demonstrated that this technique could selectively amplify these 6 viruses at a sensitivity of 100 copies·20 μL-1when all 6 viruses were present.Of the 300 examined clinical specimens，190 were positive for immunosuppressive viruses according to the GeXP-multiplex PCR assay.The GeXP-multiplex PCR assay is a high-throughput，sensitive and specific method for the detection of 6 immunosuppressive viruses that can be used for differential diagnosis and molecular epidemiologic surveys.

GeXP analyser；multiplex PCR；high-throughput；chicken immunosuppressive viruses

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.015

2015-09-29

國家自然科學(xué)基金(31160512)；廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFCA118006)；廣西特聘專家專項(xiàng)基金 (2011B020)；廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技項(xiàng)目(桂漁牧科201452003；201528013)

曾婷婷(1986-)，廣西合浦人，碩士，助理研究員，主要從事禽病原分子生物學(xué)研究，E-mail：tingtingzeng1986@163.com

謝芝勛，研究員，廣西特聘專家，E-mail：xiezhixun@126.com

S858.315.3

A

0366-6964(2016)06-1198-11