表皮生長因子對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響及與凋亡的關(guān)聯(lián)性分析

張譯夫，潘陽陽，溫澤星，余四九

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

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表皮生長因子對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響及與凋亡的關(guān)聯(lián)性分析

張譯夫，潘陽陽，溫澤星，余四九*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

旨在研究EGF是否通過調(diào)控HIF-1α抑制牦牛卵丘細(xì)胞凋亡。本研究在牦牛卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)加入不同濃度的EGF，運(yùn)用qRT-PCR和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HIF-1α、Bcl-2和Bax的表達(dá)，用一步法TUNEL檢測(cè)不同處理組卵丘細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明：(1)牦牛卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)液中添加不同濃度的EGF后，卵丘細(xì)胞HIF-1α和BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量增加，且具有濃度依賴性；當(dāng)EGF濃度為50 ng·mL-1時(shí)，HIF-1α和BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)量最低，Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高。(2)向其體外培養(yǎng)液中添加不同濃度的EGF后，卵丘細(xì)胞HIF-1α和Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量增加，且具有濃度依賴性；當(dāng)EGF濃度為50 ng·mL-1時(shí)，HIF-1α和Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量最低，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量最高。(3)TUNEL凋亡檢測(cè)表明，對(duì)照組中卵丘細(xì)胞凋亡率最高，當(dāng)EGF濃度為25 ng·mL-1時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；當(dāng)EGF濃度為50 ng·mL-1時(shí)，細(xì)胞凋亡率最低(P<0.05)，但隨著EGF濃度的增加，卵丘細(xì)胞的凋亡率又升高。本研究結(jié)果表明，EGF可通過調(diào)控HIF-1α抑制卵丘細(xì)胞凋亡，其作用可能與線粒體介導(dǎo)的Bax和Bcl-2凋亡途徑相關(guān)。

表皮生長因子(EGF)；低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)；凋亡；卵丘細(xì)胞；牦牛

哺乳動(dòng)物卵巢上存在數(shù)百萬的各級(jí)卵泡，但在卵泡生長過程中，除少量卵泡可以發(fā)育成熟排卵外，其余大部分卵泡都將閉鎖退化[1-2]。多數(shù)動(dòng)物胎兒的原始卵泡、初級(jí)卵泡閉鎖主要是由卵母細(xì)胞凋亡引起，而成體卵泡閉鎖主要是卵丘細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的結(jié)果，卵丘細(xì)胞的凋亡程度與卵母細(xì)胞的成熟狀態(tài)和發(fā)育潛能呈正相關(guān)[3-4]。成熟的卵母細(xì)胞是體外受精、體細(xì)胞核移植胚胎生產(chǎn)的先決條件[5-6]，而卵丘細(xì)胞(Cumulus cells，CCs)在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，CCs可通過與卵母細(xì)胞的縫隙連接，以旁分泌的方式將其他蛋白或生物學(xué)分子傳遞于卵母細(xì)胞進(jìn)而影響其發(fā)育和成熟[6，8]。CCs的擴(kuò)散程度、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞質(zhì)量及形態(tài)均會(huì)影響到卵母細(xì)胞發(fā)育能力[7，9]。卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的關(guān)系是相互的，卵母細(xì)胞分泌的一些重要的因子，通過旁分泌作用促進(jìn)卵丘細(xì)胞增生、分化及調(diào)節(jié)其功能，二者之間相互作用共同調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育[10]。由于卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間的密切關(guān)系，有研究表明，卵丘細(xì)胞凋亡引起的卵泡閉鎖會(huì)影響到卵母細(xì)胞的后期發(fā)育潛能[11]，卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟情況影響后續(xù)胚胎的卵裂率及囊胚率[12]。

表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)最早是從小鼠頜下腺中分離出來的一種多肽類物質(zhì)，在細(xì)胞增殖和分化中起重要作用。EGF可通過多種信號(hào)途徑調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制多種類型細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，從而發(fā)揮抑制凋亡的生物學(xué)效應(yīng)，細(xì)胞凋亡途徑很多，如線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中的B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B-cell lymphoma/Leukemia-2，Bcl-2)。Bcl-2作為抗凋亡蛋白重要成員，在細(xì)胞中主要結(jié)合B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因伴隨x蛋白(B-cell lymphoma/Leukemia associated x protein，Bax)而抑制凋亡發(fā)生[13]。目前發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的靶基因有100多個(gè)。P.Carmeliet等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與Bcl-2、p53因子的表達(dá)存在密切關(guān)系，由于低氧應(yīng)激可以導(dǎo)致許多生物障礙，HIF-1α在調(diào)控細(xì)胞生長和凋亡可能具有普遍的病理生理學(xué)意義。G.L.Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1是通過抑制Bcl-2表達(dá)的信號(hào)途徑來促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的。HIF-1α也可能在心肌Bcl-2、Bax的表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16]。

牦牛是生活在海拔最高處的哺乳動(dòng)物，主要產(chǎn)于中國青藏高原海拔3 000 m以上地區(qū)。牦牛生產(chǎn)能力低下，繁殖活動(dòng)具有明顯的季節(jié)性，妊娠期為250～260 d，本具有一年產(chǎn)一胎的能力，但是由于生存環(huán)境等相關(guān)因素的影響，牦牛的實(shí)際繁殖能力一般僅為兩年一胎或三年兩胎[17]。因此，本研究以牦牛卵丘細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)不同濃度EGF對(duì)其凋亡的影響，并分析了EGF對(duì)HIF-1α及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，以探討EGF抑制牦牛卵丘細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制，為進(jìn)一步闡明EGF在卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育機(jī)制中的作用提供理論依據(jù)。

1　材料及方法

1.1主要試劑

DMEM/F12、胎牛血清(FBS)、PBS及雙抗(PS)購自Gibco公司(美國)；表皮生長因子(EGF)、胰蛋白酶購自Sigma公司(美國)；HIF-1α抗體(bs-0737R)、Bax抗體(bs-0127R)、Bcl-2抗體(bs-0032R)及熒光二抗(bs-0295G-FITC)購自博奧森(北京)；微量RNA提取試劑盒、兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR Mix購自Promega(美國)；SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，大連)；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：C1088)、免疫熒光檢測(cè)所用試劑均購自南京碧云天生物公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2樣品采集

牦牛卵巢樣品采自青海省西寧市樂家灣屠宰場(chǎng)，采樣時(shí)間為9～11月份，將采集的卵巢置于30～35 ℃的含PS的無菌生理鹽水中，于6 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3卵丘細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

參照潘陽陽等[18]的方法，并適當(dāng)修改。將采集回來的卵巢用預(yù)先37 ℃平衡2 h的生理鹽水清洗3次，用12號(hào)針頭抽取卵巢表面直徑2～10 mm卵泡中的卵泡液，體視顯微鏡下挑選出胞質(zhì)均勻且含3層以上卵丘層的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)；震蕩器震蕩2 min后，收集分散的卵丘細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。然后用培養(yǎng)液(90%DMEM/F12 +1% PS+9% FBS)離心洗滌2次，置25 mm2的培養(yǎng)瓶懸浮培養(yǎng)。

1.4EGF作用卵丘細(xì)胞

取第2代卵丘細(xì)胞，培養(yǎng)至指數(shù)生長期，用0.05%的胰蛋白酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率達(dá)80% 以上時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)，接種到六孔板中于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，撤除血清，加入EGF。分別設(shè)陰性對(duì)照組(不加EGF，即0 ng·mL-1)和EGF處理組(EGF終濃度分別為25、50、100和200 ng·mL-1)，重復(fù)5次，EGF處理時(shí)間根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定為24 h，分別收集處理細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增

每個(gè)處理組隨機(jī)收集4孔，PBS清洗3次后，微量RNA提取試劑盒提取總RNA，兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。PCR反應(yīng)體系為20 μL：1 μL cDNA(200 ng·μL-1)，上下游引物各0.5 μL(0.2 μmol·mL-1)，PCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL。取10 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120 V，20 min)，紫外燈下觀察，并利用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，確定引物特異性。

1.6qRT-PCR 檢測(cè)HIF-1α、Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)

根據(jù)GenBank公布的牛HIF-1α、Bax和Bcl-2的mRNA序列設(shè)計(jì)引物，引物具體信息見表1，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系為1 μL cDNA(200 ng·μL-1)，上下游引物各0.4 μL(0.2 μmol·mL-1)，2×SYBR Green II PCR mix 10 μL，Passive Reference Dye II 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性10 s、退火10 s(退火溫度見表1 )、72 ℃延伸 10 s，共34個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)5次。根據(jù)熔解曲線判斷反應(yīng)的特異性，獲得每個(gè)樣品的CT值，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)5次。

表1引物信息

Table 1The information of primers

基因GeneNCBI登錄號(hào)AccessionNo.引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物大小/bpFragmentsizeHIF-1αAB018398F:TGAAGGCACAGATGAATTGCTTR:GTTCAAACTGAGTTAATCCCATGTATTT58129BaxNM_173894.1F:TTTGCTTCAGGGTTTCATCR:CAGCTGCGATCATCCTCT58174Bcl-2NM_001166486.1F:CTGCACCTGACGCCCTTCACR:GCGTCCCAGCCTCCGTTGT62236SDHANM_174178.2F:GCAGAACCTGATGCTTTGTGR:CGTAGGAGAGCGTGTGCTT58185

HIF-1α、Bax和Bcl-2.目的基因；SDHA.內(nèi)參基因

HIF-1α，BaxandBcl-2.The purpose genes；SDHA.Reference gene

1.7 免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)HIF-1α、Bax及Bcl-2蛋白的分布

將細(xì)胞用PBS 清洗3 遍后，加入固定液室溫固定30 min，然后用免疫染色洗滌液洗3遍，用含0.2% TritonX-100免疫染色封閉液封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜(對(duì)照組用PBS代替一抗)，洗3遍后，置于FITC 標(biāo)記的二抗中，室溫避光孵育1 h，清洗3 遍后，DAPI染色3～5 min。熒光顯微鏡觀察并拍照。使用Imagepro-Plus 6.0對(duì)熒光照片進(jìn)行平均光密度(Mean density)分析，選擇測(cè)量參數(shù)IOD和area，讀取IOD SUM及area SUM數(shù)據(jù)，根據(jù)mean density=(IOD SUM)/(area SUM)，即為圖片中細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值。

1.8一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將貼壁的細(xì)胞用PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定30～60 min后，PBS再洗滌1次，0.1%TritonX-100冰浴2 min，PBS洗滌2次。每個(gè)樣品加入50 μL的TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次后，置于熒光顯微鏡下拍照。

1.9數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，每組至少重復(fù)3次。P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1引物特異性的確定

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，HIF-1α、Bax、Bcl-2及內(nèi)參基因SDHA均出現(xiàn)與目的片段大小相同的片段(圖1)。擴(kuò)增效率曲線表明擴(kuò)增效果良好，經(jīng)熔解曲線分析HIF-1α、Bax、Bcl-2及內(nèi)參基因SDHA分別出現(xiàn)單一產(chǎn)物峰(圖2)。

圖1　EGF不同作用濃度組牦牛卵丘細(xì)胞HIF-1α、Bax、Bcl-2及SDHA 的PCR電泳產(chǎn)物檢測(cè)Fig.1　The PCR products of HIF-1α，Bax，Bcl-2 and SDHA in yak cumulus cells in different groups

圖2　HIF-1α、Bax、Bcl-2及SDHA基因的熔解曲線Fig.2　The melting curves of HIF-1α，Bax，Bcl-2 and SDHA genes

2.2EGF對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞HIF-1α、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，加入不同濃度的EGF后，HIF-1αmRNA的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生顯著變化。其中50 ng·mL-1EGF處理組，HIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量最低，且與25 ng·mL-1EGF組差異不顯著；100 ng·mL-1EGF處理組與0 ng·mL-1EGF處理組的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，200 ng·mL-1EGF處理組的相對(duì)表達(dá)量最高。不同EGF濃度處理組Bax、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)顯示(圖3)，對(duì)照組中，Bax的相對(duì)表達(dá)量最高，而Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量最低；EGF作用濃度為25 ng·mL-1時(shí)，Bax的相對(duì)表達(dá)量較低，而Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量較高；在EGF作用濃度為50 ng·mL-1時(shí)，Bax的相對(duì)表達(dá)量最低，而Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量最高；EGF作用濃度為100 ng·mL-1時(shí)，Bax和Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量與50 ng·mL-1濃度的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著；200 ng·mL-1EGF作用濃度組，Bax的相對(duì)表達(dá)量顯著高于100 ng·mL-1組(P<0.05)，Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量顯著低于100 ng·mL-1組，都與對(duì)照組差異不顯著。

組間比較，不同上標(biāo)表示差異顯著(P<0.05)Comparison among groups，different superscripts mean significant difference (P<0.05)圖3　不同濃度EGF對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞HIF-1α、Bax和Bcl-2基因表達(dá)的影響Fig.3　Effect of different concentration of EGF on HIF-1α， Bax and Bcl-2 mRNA expression

2.3EGF對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞HIF-1α、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

對(duì)加入不同濃度EGF的牦牛卵丘細(xì)胞進(jìn)行HIF-1α、Bax和Bcl-2蛋白免疫熒光染色檢測(cè)如圖4所示：所有的牦牛卵丘細(xì)胞均表達(dá)HIF-1α、Bax和Bcl-2蛋白，且主要位于細(xì)胞核中，而細(xì)胞質(zhì)中熒光較弱。圖4的量化分析結(jié)果如圖5所示：HIF-1α蛋白在50 ng·mL-1EGF作用組相對(duì)表達(dá)量最低，且與100 ng·mL-1EGF組差異不顯著；25 ng·mL-1EGF處理組HIF-1α 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于50 ng·mL-1EGF組(P<0.05)；200 ng·mL-1EGF處理組HIF-1α 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組(P<0.05)，但與對(duì)照組差異不顯著；對(duì)照組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量最高，25 ng·mL-1EGF組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)，在EGF為50 ng·mL-1濃度表達(dá)量最低(P<0.05)，100 ng·mL-1EGF組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量與50 ng·mL-1EGF組差異不顯著，200 ng·mL-1EGF組與對(duì)照組差異不顯著；對(duì)照組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量最低，25 ng·mL-1EGF組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，Bcl-2在50 ng·mL-1EGF作用組蛋白相對(duì)表達(dá)量最高(P<0.05)，100 ng·mL-1EGF組Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量有所降低，但與50 ng·mL-1EGF組差異不顯著，200 ng·mL-1EGF處理組的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著。

2.4EGF對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞凋亡的抑制作用

對(duì)不同處理組細(xì)胞進(jìn)行TUNEL凋亡檢測(cè)，如圖6、表2所示，對(duì)照組中卵丘細(xì)胞凋亡率最高，為(73.14±4.72)%；25 ng·mL-1EGF組細(xì)胞凋亡率顯著降低，為(62.85±4.38)% (P<0.05)；50 ng·mL-1EGF組，細(xì)胞凋亡率最低，為(48.32±2.16)% (P<0.05)，與100 ng·mL-1EGF組細(xì)胞凋亡率(51.25±1.84)%差異不顯著；200 ng·mL-1EGF組細(xì)胞凋亡率顯著高于100 ng·mL-1EGF組細(xì)胞凋亡率，為(71.06±3.63)%，與對(duì)照組凋亡率差異不顯著。

表2EGF對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞凋亡的抑制作用

Table 2Effects of EGF on apoptosis of yak cumulus cells

EGF濃度/(ng·mL-1)ConcentrationofEGF細(xì)胞凋亡率/%Apoptosisrate073.14±4.72a2562.85±4.38b5048.32±2.16c10051.25±1.84c20071.06±3.63a

同一列中不同字母表示差異顯著(P<0.05)

The different letters in the same column mean significant difference (P<0.05)

3　討　論

卵母細(xì)胞成熟過程中，包圍其周圍的卵丘細(xì)胞可通過分泌一系列蛋白調(diào)控卵母細(xì)胞質(zhì)量，甚至影響后期胚胎的發(fā)育[19]。同時(shí)卵丘細(xì)胞在胚胎體外培養(yǎng)過程中，常作為共培養(yǎng)體系細(xì)胞，質(zhì)量完好的卵丘細(xì)胞可提高胚胎的發(fā)育能力[20]。綜上表明，卵丘細(xì)胞的質(zhì)量對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和早期胚胎發(fā)育具有至關(guān)重要的作用。

EGF作為重要的細(xì)胞因子可促進(jìn)細(xì)胞的分化和增殖[21]。研究發(fā)現(xiàn)，EGF對(duì)多數(shù)哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞成熟具有促進(jìn)作用[22]，包括牛[23]、水牛[24]和綿羊[25]。由于對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行裸卵培養(yǎng)時(shí)，添加EGF并未促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，表明這種作用通過卵丘層細(xì)胞介導(dǎo)完成[21]。

牦牛長期生活在低氧的環(huán)境，其細(xì)胞體外培養(yǎng)必然對(duì)氧刺激更加敏感。HIF是缺氧應(yīng)答中起核心作用的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答因子，目前發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的靶基因有100多個(gè)。EGF可以抑制低氧導(dǎo)致的人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，且主要的調(diào)控基因?yàn)锽ax和P53[23，26]。而Bax為Bcl-2家族促凋亡成員，其作用可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體外膜造成損傷，并釋放凋亡蛋白進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+[27]。Bax蛋白過表達(dá)加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程，Bcl-2 作為凋亡抑制基因，Bcl-2 蛋白表達(dá)能夠阻止多種刺激因素引起的細(xì)胞凋亡[28]。

A～E.0 、25、50、100和200 ng·mL-1；綠色熒光分別為HIF-1α、Bax和Bcl-2蛋白標(biāo)記，DAPI為細(xì)胞核標(biāo)記A-E.0，25，50，100 and 200 ng·mL-1；The HIF-1α，Bax and Bcl-2 protein were stained with green fluorescence，nuclei were stained with DAPI圖4　牦牛卵丘細(xì)胞HIF-1α、Bax和Bcl-2蛋白的免疫熒光染色結(jié)果(Bar=200 μm )Fig.4　The detection of HIF-1α，Bax and Bcl-2 protein on yak cumulus cells by method of immunofluorescence (Bar=200 μm )

組間比較，不同上標(biāo)表示差異顯著(P<0.05)Comparison among groups，different superscripts mean significant difference (P<0.05)圖5　不同濃度EGF對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞HIF-1α、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.5　Effect of different concentration of EGF on HIF-1α，Bax and Bcl-2 protein expression

本研究首次分析EGF對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞的凋亡調(diào)控及機(jī)制，在牦牛卵丘細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的EGF后，HIF-1α、Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)均發(fā)生了改變，且與細(xì)胞凋亡程度密切相關(guān)，而HIF-1α、Bax和Bcl-2蛋白主要分布于卵丘細(xì)胞的胞核中。隨著EGF濃度的增加，HIF-1α和BaxmRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量隨之降低，Bcl-2 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量隨之升高，細(xì)胞的凋亡率也隨之降低；當(dāng)EGF濃度為50 ng·mL-1時(shí)，HIF-1α和BaxmRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量最低，而Bcl-2 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量最高，細(xì)胞的凋亡率也最低；當(dāng)EGF濃度增大后，其作用效果反而有所減弱。一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，EGF可明顯降低細(xì)胞的凋亡率，且具有劑量依賴性，在50 ng·mL-1EGF組凋亡率最低，EGF濃度繼續(xù)增大后，凋亡率高于50 ng·mL-1EGF組，低于對(duì)照組的凋亡率?？梢奅GF可降低牦牛卵丘細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，提高Bcl-2的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，最佳作用濃度為50 ng·mL-1，其結(jié)果將為闡明EGF對(duì)卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎的發(fā)育機(jī)制提供理論依據(jù)。

A～E.0、25、50、100和200 ng·mL-1；F.空白對(duì)照。綠色熒光為凋亡標(biāo)記A-E.0，25，50，100 and 200 ng·mL-1；F.Blank control.Apoptotic marker was stained with green fluorescence圖6　不同處理組牦牛卵丘細(xì)胞凋亡檢測(cè) (Bar=100 μm)Fig.6　Detection the apoptosis of yak cumulus cells in different groups (Bar=100 μm)

4　結(jié)　論

牦牛卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)中添加EGF可降低HIF-1α及Bax的表達(dá)，提高Bcl-2的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，且其作用濃度具有劑量依賴性，最佳濃度為50 ng·mL-1。證明EGF可通過調(diào)控HIF-1α抑制卵丘細(xì)胞凋亡，其作用可能是通過影響線粒體介導(dǎo)的Bax和Bcl-2凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。本研究為闡明EGF抑制卵丘細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了新的依據(jù)，為進(jìn)一步揭示EGF在卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育過程中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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(編輯程金華)

The Effect of Epidermal Growth Factor on the Expression of Hypoxia Inducible Factor-1α in Cumulus Cells of Yak (Bosgrunniens) and Its Correlation Analysis with Apoptosis

ZHANG Yi-fu，PAN Yang-yang，WEN Ze-xing，YU Si-jiu*

(TechnologyandResearchCenterofGansuProvinceforEmbryonicEngineeringofBovineandSheep&Goat，CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The present study was carried out to verify whether EGF inhibited the apoptosis of cumulus cells of yak by regulating the expression of HIF-1α.The cumulus cells of yak were culturedinvitrowith the supplement of different concentration of EGF.The expression levels of HIF-1α，Bax and Bcl-2 in different groups were detected by qRT-PCR and immunofluorescence.TUNEL was used to evaluate apoptosis rate.Results showed that：(1) After the addition of different concentration of EGF to the cumulus cells，there would be found a declined mRNA relative expression ofHIF-1αandBaxand an increased mRNA relative expression ofBcl-2，with a characteristic manner of concentration-dependent.When the concentration of EGF was as high as 50 ng·mL-1，the mRNA relative expressions ofHIF-1αandBaxwere the lowest，while that ofBcl-2 was the highest.(2) The protein relative expressions of HIF-1α and Bax were decreased and that of Bcl-2 was increased，with a characteristic manner of concentration-dependent.When the concentration of EGF was as high as 50 ng·mL-1，the protein relative expressions of HIF-1α and Bax were the lowest，while that of Bcl-2 was the highest.(3) Apoptosis detection shown that the apoptosis rate from control group was the highest.It was extremely declined when the concentration of EGF was 25 ng·mL-1(P<0.05)，and down to its lowest level when EGF was 50 ng·mL-1(P<0.05)，while rose again when EGF was continues to increase.It is concluded from this study that EGF can inhibit the apoptosis of cumulus cells by regulating HIF-1α and may be related to mitochondrial Bax and Bcl-2 apoptotic pathway.

epidermal growth factor (EGF)；hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)；apoptosis；cumulus cells；yak

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.010

2015-12-09

國家自然科學(xué)基金(31272616；31472244)

張譯夫(1991-)，女，山西運(yùn)城人，碩士，主要從事哺乳動(dòng)物生殖內(nèi)分泌相關(guān)研究，E-mail: 1240219609@qq.com

余四九，教授，E-mail:sjyu@163.com

S823.8+5.2

A

0366-6964(2016)06-1154-08