慢病毒轉(zhuǎn)染熒光蛋白EYFP-H148Q/I152L細(xì)胞模型的構(gòu)建

肖　遠(yuǎn)，許　榮，李秀敏，劉　艷，黎　星，霍　聰，王曉明

(第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科，陜西西安　710032)

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◇基礎(chǔ)研究◇

慢病毒轉(zhuǎn)染熒光蛋白EYFP-H148Q/I152L細(xì)胞模型的構(gòu)建

肖遠(yuǎn)，許榮，李秀敏，劉艷，黎星，霍聰，王曉明

(第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科，陜西西安710032)

摘要：目的構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EYFP熒光蛋白的HeLa細(xì)胞作為陰離子(鹵素)通道阻斷劑篩選的細(xì)胞模型，為高通量篩選陰離子(鹵素)通道阻斷劑提供條件。方法通過基因重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)YFP突變蛋白(EYFP-H148Q/I152L)和puromycin抗性的慢病毒載體。將慢病毒載體和包裝質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒顆粒，感染HeLa細(xì)胞，進(jìn)一步利用抗性基因?qū)?xì)胞進(jìn)行puromycin篩選，純化細(xì)胞并擴(kuò)增至所需細(xì)胞量。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法檢測(cè)目的基因EYFP-H148Q/I152L的表達(dá)效率。并驗(yàn)證EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作為鹵族離子通道阻斷劑篩選模型的活性。結(jié)果基因測(cè)序驗(yàn)證了目的基因成功插入慢病毒載體。RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，目的基因在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察到EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株能夠表達(dá)特有的EYFP黃色熒光，效率接近100%。碘離子(I-)(低滲)溶液刺激細(xì)胞陰離子(鹵素)通道的開放，內(nèi)流的I-能夠使黃色熒光淬滅。結(jié)論構(gòu)建的EYFP-HeLa細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)EYFP黃色熒光蛋白，對(duì)內(nèi)流入細(xì)胞的I-敏感，可以作為理想的陰離子(鹵素)通道阻斷劑的篩選模型。

關(guān)鍵詞：陰離子；鹵素；熒光蛋白；陰離子通道阻斷劑；篩選模型；基因重組

氯、碘、溴等陰離子(鹵素)是維持人體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及發(fā)揮正常功能的重要成分，細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)水及各種離子的動(dòng)態(tài)平衡，依賴于細(xì)胞膜上各種通道蛋白及轉(zhuǎn)換器的作用。特別是在各種病理性損傷過程中，如發(fā)生細(xì)胞腫脹等內(nèi)外液滲透壓的改變時(shí)，需通過水及各種離子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)[1]，例如，在腸道分泌、神經(jīng)元電位、維持細(xì)胞容積等內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起至關(guān)重要的作用[2]。很多疾病的發(fā)生都與其調(diào)節(jié)過程出現(xiàn)問題密切相關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)，離子通道阻斷劑具有重要的干預(yù)作用，特別是陰離子通道阻斷劑DIDS等可以有效抑制缺血再灌注心肌細(xì)胞的損傷[3-4]。而尋找一種具有高效的天然化合物篩查技術(shù)尤為迫切而重要。黃色熒光蛋白YFP的突變體因其具有能被碘離子(I-)淬滅的特性，被廣泛用作監(jiān)測(cè)信號(hào)，反映細(xì)胞的生理活動(dòng)[5]，使得動(dòng)態(tài)、精確地監(jiān)測(cè)陰離子(鹵素)生理活動(dòng)成為可能，對(duì)于監(jiān)測(cè)細(xì)胞生理反應(yīng)有重要意義。本研究旨在應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建搭載YFP突變蛋白(EYFP-H148Q/I152L)基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，擬建立穩(wěn)定的細(xì)胞模型作為陰離子(鹵素)通道阻斷劑的篩查模型，為高通量篩選候選化合物提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1材料與方法

1.1材料EYFP-H148Q/I152L-GFP質(zhì)粒為吉林大學(xué)所贈(zèng)，慢病毒載體為GV341、pHelper 1.0和pHelper2.0質(zhì)粒組成，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，大腸桿菌DH5α、293T細(xì)胞系及HeLa細(xì)胞系均為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、NheⅠ購(gòu)自NEB公司，DNA Marker、Taq酶購(gòu)自Fermatas公司，膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司，引物合成及DNA測(cè)序均由捷瑞生物完成，熒光定量PCR試劑購(gòu)自TaKaRa公司，F(xiàn)LAG抗體購(gòu)自Sigma公司。胎牛血清(FBS)、DMEM、胰酶均購(gòu)自GIBCO公司，DMSO購(gòu)自Sigma公司。Opti-MEM、Lipofectamine 2000、Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2目的片段的擴(kuò)增以吉林大學(xué)所贈(zèng)EYFP-H148Q/I152L-GFP質(zhì)粒為模板擴(kuò)增。上游引物：CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGGC-

TGAGCAAGGGCGAGGAG，下游引物：AATGCA-

ACTCTGAGCTAGCTCTTGTACAGCTCGTCCA-

TG(斜體部分為酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增目的片段為762 bp。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并按照膠回收試劑盒說明書回收目的片段。

1.3重組慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定將慢病毒載體GV341和回收的目的基因片段分別用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和NheⅠ進(jìn)行雙酶切后，電泳回收酶切產(chǎn)物，之后使兩種酶切產(chǎn)物在連接酶的作用下，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆的一半菌落進(jìn)行PCR鑒定后送檢測(cè)序。檢測(cè)時(shí)的上游引物：GGGTCAATAATTTTCAGTG，下游引物：CCTTATAGTCCTTATCATCGTC，陽性目的片段為930 bp。測(cè)序正確后擴(kuò)增選定菌落并大量提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4病毒包裝與滴度測(cè)定轉(zhuǎn)染前24 h將293T細(xì)胞用胰酶消化后重新接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為9×107細(xì)胞/皿。于37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)約24 h至細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h更換為無血清培養(yǎng)基，用Opti-MEM稀釋待轉(zhuǎn)混合質(zhì)粒(20 μg pGV341-YFP、15 μg pHelper 1.0和10 μg pHelper 2.0)，使總體積為2.5 mL，室溫下溫育5 min。同時(shí)在另一管中將100 μL Lipofectamine 2000用2.4 mL Opti-MEM稀釋并置室溫溫育5 min。將上述2管溶液混合后，室溫溫育20 min后加入293T細(xì)胞中，混勻，置于37 ℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染8 h后換為新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，熒光顯微鏡下可見熒光蛋白表達(dá)，用0.45 μm濾器過濾收集上清液，即為病毒液。

將該病毒液進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋后，感染293T細(xì)胞，感染后48 h加入5 μg/mL puromycin，繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后，熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)EYFP陽性細(xì)胞，確定病毒滴度(即帶有熒光的細(xì)胞數(shù)與病毒原液量之比)。

1.5病毒載體感染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建

1.5.1病毒感染生長(zhǎng)狀態(tài)良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的目的細(xì)胞，感染前1 d將目的細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)約為5×104)分入6孔板，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%，根據(jù)細(xì)胞感染復(fù)數(shù)值(multiplicity of infection, MOI)，加入適宜量的病毒感染。12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)：如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基，當(dāng)天按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的組別加入慢病毒顆粒進(jìn)行目的細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)。感染3 d后，熒光顯微鏡下觀察EYFP表達(dá)情況，熒光率達(dá)80%以上用于篩選構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。感染效率低于80%的實(shí)驗(yàn)組，重新進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。

1.5.2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建將待篩選細(xì)胞接種于6孔板中至融合度約80%，加入puromycin進(jìn)行空細(xì)胞致死最低濃度篩選，置0、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL進(jìn)行篩選，獲取藥物處理48 h細(xì)胞全部死亡的最低藥物濃度。

將細(xì)胞接種在6孔板中，貼壁后進(jìn)行慢病毒感染，感染第4天，加入puromycin藥物篩選。對(duì)篩選后的細(xì)胞即時(shí)觀察熒光效率，判斷是否獲得感染效率接近100%的細(xì)胞。將細(xì)胞消化后，接種于96孔板中，保證1個(gè)/孔，接種后第2天觀察孔板，標(biāo)記出具有單個(gè)細(xì)胞的孔，同時(shí)加入puromycin藥物。繼續(xù)培養(yǎng)標(biāo)記孔的細(xì)胞4～5 d，待孔板中細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞克隆時(shí)，挑取多組單個(gè)細(xì)胞克隆孔板中的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至48孔板，再逐級(jí)放大，中間取12孔板80%融合度的細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，6孔板的細(xì)胞提取蛋白，分別進(jìn)行RT-PCR和Western blot檢測(cè)，選擇檢測(cè)合格的單克隆細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)至需要的細(xì)胞量后凍存。

1.5.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的RT-PCR檢測(cè)將提取到的總RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參。根據(jù)Promega公司的M-MLV試劑盒說明書進(jìn)行操作，首先將1 μL OligodT和2.0 μg總RNA加入無RNA酶H2O中，補(bǔ)H2O至總體積為10 μL，70 ℃處理后置冰浴中使模板和OligodT退火，隨后在該管中繼續(xù)加入5×RT buffer 4 μL、10 mol/L dNTPs 2 μL、RNA酶抑制劑16 Units、RNA酶200 Units，補(bǔ)水至20 μL，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，SYBRpremixexTaq10 μL，引物、cDNA各1 μL，補(bǔ)水至20 μL，按照兩步法進(jìn)行定量PCR，程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計(jì)算穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株與陰性對(duì)照細(xì)胞中YFP的相對(duì)表達(dá)量，定量PCR所需引物見表1。

表1實(shí)時(shí)定量PCR所需引物

Tab.1Primers needed for RT-PCR

基因引物序列GAPDHF:TGACTTCAACAGCGACACCCAR:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAAYFPF:CCGACAAGCAGAAGAACGGR:GAACTCCAGCAGGACCATG

1.5.4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的Western blot檢測(cè)將6孔板中收集到的穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞經(jīng)裂解收取蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，重組慢病毒載體中的FLAG為待檢標(biāo)簽蛋白，分子質(zhì)量為29 ku，以48 ku的SURVIVIN-3FLAG-GFP為陽性對(duì)照，進(jìn)行120 g/L聚丙烯酰氨凝膠電泳，蛋白上樣量20 μL，半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，每次5 min后再加入鼠源FLAG抗體(1∶2 000)4 ℃過夜，TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，洗膜后用ECL發(fā)光液顯色，X-膠片曝光顯影定影。以預(yù)染的蛋白Marker確定蛋白相對(duì)分子質(zhì)量。

1.6EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作為鹵族離子通道阻斷劑篩選模型的活性驗(yàn)證EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系分2組，以等滲NaCl為對(duì)照，低滲NaI刺激陰離子(鹵素)，并對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定利用PCR方法從吉林大學(xué)所贈(zèng)質(zhì)粒模板中擴(kuò)增得到約750 bp的特異性條帶(目的基因)，與762 bp的目的基因相符(圖1A)。挑取8個(gè)重組慢病毒表達(dá)載體單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，各菌落均檢測(cè)到930 bp的特異性條帶(圖1B)，與預(yù)期相符。并將3號(hào)菌液送檢測(cè)序。

圖1目的基因YFP的獲取及慢病毒載體的PCR鑒定

Fig.1 Cloning of YFP CDS sequence and identification oflentiviral vector GV341

A：質(zhì)粒PCR結(jié)果。M：Marker；S：PCR擴(kuò)增得到Y(jié)FP基因條帶。B：PCR結(jié)果示重組慢病毒菌液YFP突變基因的表達(dá)。N：陰性對(duì)照ddH2O；N1：空載連續(xù)對(duì)照；P：陽性對(duì)照GAPDH；M：Marker；1～8：含YFP基因菌液1～8組。

2.2病毒滴度測(cè)定倍比稀釋后的病毒加puromycin繼續(xù)感染細(xì)胞2 d后，在熒光倒置顯微鏡下觀察EYFP陽性細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算所得病毒載體的病毒滴度為2E+8 TU/mL。

2.3穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞株的建立及RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.3.1穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞系中EYFP熒光效率穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞系中EYFP熒光陽性率接近100%(圖2)。

2.3.2穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞系的RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果2-ΔΔCt法計(jì)算得出穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞組較未轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組中YFP mRNA表達(dá)水平提高了4 363.599倍；Western blot結(jié)果顯示，6孔板中的穩(wěn)轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞蛋白樣品可檢測(cè)到標(biāo)志重組慢病毒載體的大小為29 ku的目的條帶(圖3)。

圖2穩(wěn)轉(zhuǎn)EYFP-HeLa細(xì)胞的熒光鑒定

Fig.2 The fluorescence detection of transfected EYFP-HeLa cell line (×200)

A：明場(chǎng)；B：熒光激發(fā)；C：A、B重合。

圖3EYFP基因的表達(dá)(A)及EYFP熒光蛋白(B)的鑒定結(jié)果

Fig.3 YFP expression of YFP-HeLa cell line detected by RT-PCR (A) and Western blot (B)

CON：對(duì)照組；SAMP：感染慢病毒載體的HeLa細(xì)胞。與CON組比較，*P<0.01；GAPDH：內(nèi)參；P：陽性對(duì)照 SURVIVIN-3FLAG-GFP，48 ku；1～7：7組YFP-HeLa細(xì)胞，在1～3、5、6、7組檢測(cè)到標(biāo)志重組慢病毒載體，大小為29 ku。

2.4EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作為鹵族離子通道阻斷劑篩選模型的活性驗(yàn)證EYFP-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系低滲NaI刺激陰離子(鹵素)通道開放，熒光淬滅，低滲NaI較等滲NaCl熒光讀值隨時(shí)間明顯下降(P<0.05。圖4)。

3討論

陰離子通道廣泛存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上，其在維持組織細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)節(jié)細(xì)胞的容積、細(xì)胞膜電位、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡中起著重要作用[6-9]。

課題組前期在staurosporine、缺血再灌注及衣霉素分別通過線粒體、受體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑構(gòu)建的心肌細(xì)胞凋亡模型上，發(fā)現(xiàn)Cl-通道參與了細(xì)胞的凋亡過程，應(yīng)用特異性阻斷劑DCPIB和非特異性阻斷劑DIDS能有效抑制細(xì)胞凋亡性死亡，特別是在體心臟中能夠減少梗死面積、改善心臟功能、抑制心律失常的發(fā)生，達(dá)到保護(hù)受損心臟的作用[10-15]。MIZOGUCHI等[16]也在大鼠心臟進(jìn)行異體異位移植過程中證實(shí)了上述的心臟保護(hù)作用。上述證據(jù)證明，心肌細(xì)胞膜上陰離子通道對(duì)維護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定、減少細(xì)胞損傷具有重要的保護(hù)作用。

氯離子作為細(xì)胞內(nèi)最主要的陰離子，其相關(guān)的通道阻斷劑也僅僅是作為工具藥應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室，能否在眾多化合物中尋找出具有氯離子阻斷作用的成分？如何實(shí)現(xiàn)在大量化合物中篩查出具有目的功能的化合物呢？本研究的主要目的是構(gòu)建穩(wěn)定成熟的離子通道阻斷劑的方法。

我國(guó)具有豐富的中草藥資源，隨著現(xiàn)代中藥研究的進(jìn)展，許多重要天然中藥單體化合物從分子結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)及毒理學(xué)被清楚地闡明[17]。同時(shí)，已有多種單體化合物從傳統(tǒng)天然化合物中提取得到，并證實(shí)作為通道阻斷劑發(fā)揮著抗凋亡、抗缺血再灌注等心肌保護(hù)作用[18-20]。然而，目前常用于離子通道藥物篩選的方法如膜片鉗技術(shù)，由于操作較難，成本高、耗時(shí)、耗工，僅適用于少量化合物特異活性功能的證實(shí)，對(duì)于化合物的大批量初次篩選無法實(shí)現(xiàn)[21]。而高通量篩選技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題，且我國(guó)豐富的傳統(tǒng)天然化合物庫也滿足該技術(shù)對(duì)樣本量的要求。在此基礎(chǔ)上，如何構(gòu)建一種用于高通量篩選的低成本、操作便捷、信號(hào)檢測(cè)快速靈敏的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)于大批量化合物的篩選至關(guān)重要。

圖4 EYFP-HeLa細(xì)胞系對(duì)I-低滲的活性功能驗(yàn)證Fig.4VerificationofactivityofEYFP-HeLacelllineonI-(lowpermeability)solutionA:NaIHypo刺激離子通道開放,I-內(nèi)流熒光淬滅程度與NaCliso組比較的熒光強(qiáng)度結(jié)果;B:動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)分析,兩組之間比較,P<0.05。

2012年，STOTZ等[22]報(bào)道熒光蛋白EYFP-H148Q/I152L可用于陰離子通道的研究，發(fā)現(xiàn)該突變的黃色熒光蛋白能夠在鹵素離子的刺激下發(fā)生淬滅反應(yīng)，從而反映離子通道的開閉情況。該研究技術(shù)也在多個(gè)陰離子(鹵素離子)通道的研究中廣泛應(yīng)用[2,5,23-24]，為我們利用基因重組技術(shù)構(gòu)建EYFP-H148Q/I152L-HeLa細(xì)胞模型提供了重要的依據(jù)及方法。本研究通過基因測(cè)序驗(yàn)證了目的基因成功插入慢病毒載體，應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測(cè)目的基因在HeLa細(xì)胞中表達(dá)良好，熒光顯微鏡下穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株EYFP黃色熒光效率接近100%，而I-低滲溶液刺激細(xì)胞陰離子通道開放后，內(nèi)流的I-能夠使黃色熒光淬滅。結(jié)果顯示，構(gòu)建的熒光蛋白EYFP-H148Q/I152L-HeLa細(xì)胞模型，通過檢測(cè)該細(xì)胞在低滲I-溶液刺激下發(fā)生熒光淬滅的特性，可用于大規(guī)模篩選抑制熒光淬滅的陰離子通道阻斷劑。

該模型構(gòu)建方便，相關(guān)技術(shù)成熟；成本較低；檢測(cè)信號(hào)靈敏、動(dòng)態(tài)、可視。通過檢測(cè)熒光信號(hào)使得便捷快速篩選天然化合物成為可能，對(duì)初篩結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性具有重要意義，從模型上保證了初篩結(jié)果的可信。

參考文獻(xiàn)：

[1] QIU Z, DUBIN AE, MATHUR J, et al. SWELL1, a plasma membrane protein, is an essential component of volume-regulated anion channel[J]. Cell, 2014, 157(2):447-458.

[2] ZHONG S, NAVARATNAM D, SANTOS-SACCHI J. A genetically-encoded YFP sensor with enhanced chloride sensitivity, photostability and reduced ph interference demonstrates augmented transmembrane chloride movement by gerbil prestin (SLC26a5)[J]. PLoS One, 2014, 9(6):e99095.

[3] LIU Y, WANG B, ZHANG WW, et al. Modulation of staurosporine-activated volume-sensitive outwardly rectifying Cl(-) channel by PI3K/Akt in cardiomyocytes[J]. Curr Pharm Des, 2013, 19(27):4859-4864.

[4] LIU AH, CAO YN, LIU HT, et al. DIDS attenuates staurosporine-induced cardiomyocyte apoptosis by PI3K/Akt signaling pathway: activation of eNOS/NO and inhibition of Bax translocation[J]. Cell Physiol Biochem, 2008, 22(1-4):177-186.

[5] RHODEN KJ, CIANCHETTA S, STIVANI V,et al.Cell-based imaging of sodium iodide symporter activity with the yellow fluorescent protein variant YFP-H148Q/I152L[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2007, 292(2):C814-C823.

[6] AKITA T, OKADA Y. Characteristics and roles of the volume-sensitive outwardly rectifying (VSOR) anion channel in the central nervous system[J]. Neuroscience, 2014, 275:211-231.

[7] HOFFMANN EK, HOLM NB, LAMBERT IH. Functions of volume-sensitive and calcium-activated chloride channels[J]. IUBMB Life, 2014, 66(4): 257-267.

[8] CHATTERJEE T, SHEIKH IA, CHAKRAVARTY D, et al. Effects of small molecule calcium-activated chloride channel inhibitors on structure and function of accessory cholera enterotoxin (Ace) of vibrio cholerae[J]. PLoS One, 2015, 10(11):e0141283.

[9] ADKINS GB, CURTIS MJ. Potential role of cardiac chloride channels and transporters as novel therapeutic targets[J]. Pharmacol Ther, 2015, 145:67-75.

[10] SHEN M, WANG L, WANG B, et al. Activation of volume-sensitive outwardly rectifying chloride channel by ROS contributes to ER stress and cardiac contractile dysfunction: involvement of CHOP through Wnt[J]. Cell Death Dis, 2014, 5:e1528.

[11] WANG X, TAKAHASHI N, URAMOTO H, et al. Chloride channel inhibition prevents ROS-dependent apoptosis induced by ischemia-reperfusion in mouse cardiomyocytes[J]. Cell Physiol Biochem, 2005, 16(4-6):147-154.

[12] TAKAHASHI N, WANG X, TANABE S, et al. ClC-3-independent sensitivity of apoptosis to Cl-channel blockers in mouse cardiomyocytes[J]. Cell Physiol Biochem, 2005,15(6):263-270.

[13] 王曉明，臧益民，龔衛(wèi)琴，等. 鉀、氯離子通道阻斷劑對(duì)staurosporine誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 25(9):783-786.

[14] WANG X, CAO Y, SHEN M, et al. DIDS reduces ischemia/reperfusion-induced myocardial injury in rats[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 35(2):676-688.

[15] 王博，沈明志，翟雅麗，等. 衣霉素激活的心肌細(xì)胞氯通道及其電生理學(xué)特性[J]. 中華保健醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 15(2):160-162.

[16] MIZOGUCHI K, MAETA H, YAMAMOTO A, et al. Amelioration of myocardial global ischemia/reperfusion injury with volume-regulatory chloride channel inhibitorsinvivo[J].Transplantation, 2002, 73(8):1185-1193.

[17] 張婧波，李云飛，邢花，等. 從2010～2014年國(guó)內(nèi)獲批中藥新藥的治療領(lǐng)域看中藥研發(fā)方向[J]. 中草藥，2015, 46(15):2339-2342.

[18] 李媛, 劉善文, 李華榮，等. 丹參酮ⅡA對(duì)低分化鼻咽癌細(xì)胞氯通道的激活作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011, 27(9):1205-1209.

[19] 劉軍，那萬里，辛偉紅，等. 20(S)-原人參二醇促進(jìn)CFTR氯離子通道開放[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(4):731-735.

[20] MA T, THIAGARAJAH JR, YANG H, et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion[J]. J Clin Invest, 2002, 110(11):1651-1658.

[21] 孟紅旭，王寶，劉建勛. 穿孔膜片鉗方法記錄L型鈣通道及脫氫紫堇堿對(duì)其影響的研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011, 27(8):1051-1054.

[22] STOTZ SC, CLAPHAM DE. Anion-sensitive fluorophore identifies the Drosophila swell-activated chloride channel in a genome-wide RNA interference screen[J]. PLoS One, 2012, 7(10):e46865.

[23] RHODEN KJ, CIANCHETTA S, DUCHI S, et al. Fluorescence quantitation of thyrocyte iodide accumulation with the yellow fluorescent protein variant YFP-H148Q/I152L[J]. Anal Biochem, 2008, 373(2): 239-246.

[24] CIANCHETTA S, DI BJ, ROMEO G, et al. Perchlorate transport and inhibition of the sodium iodide symporter measured with the yellow fluorescent protein variant YFP-H148Q/I152L[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2010, 243(3):372-380.

(編輯國(guó)榮)

收稿日期：2015-11-27修回日期：2016-02-19

基金項(xiàng)目：軍隊(duì)保健計(jì)劃課題(No.13BJZ34)及衛(wèi)生部行業(yè)基金(No.201302008)資助

通訊作者：王曉明. E-mail: xmwang@fmmu.edu.cn

中圖分類號(hào)：R965.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604003

The cell model establishment through lentivirus transfecting fluorescent protein EYFP-H148Q/I152L

XIAO Yuan, XU Rong, LI Xiu-min, LIU Yan, LI Xing, HUO Cong, WANG Xiao-ming

(Department of Geriatrics, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish the HeLa cell line that can stably express EYFP fluorescent protein as the model for anion channel blocker (halide ion) screening, which lays the foundation for high throughput screening of anion channel blocker (halide ion). MethodsThrough gene recombination technology, a new lentivirus vector which can express mutant protein YFP (EYFP-H148Q/I152L) and puromycin resistance, was built. The mixture of lentivirus vector and packaging plasmid was transfected into 293T cells to produce lentivirus particles. After infection of HeLa cells by the lentivirus particles, puromycin was used to screen the cells as YFP-positive HeLa cell line. Then cell amplification was carried out after purification and efficiency of EYFP-H148Q/I152L was further detected by Real-time quantitative PCR (RT-PCR) and Western blot. We then verified the activity of EYFP-HeLa transfected cell line as a screening model of anion channel blocker. ResultsGene sequencing verified that EYFP-H148Q/I152L was successfully inserted into lentivirus vectors. RT-PCR and Western blot results showed that the target gene was overexpressed in HeLa cells. The specific yellow fluorescence of EYFP of HeLa cells could be observed under fluorescence microscope with the efficiency of nearly 100%. I- (low permeability) solution stimulated the opening of anion (halogen) channels, and the yellow fluorescence was quenched by I- flow into cells. ConclusionThe EYFP-HeLa cell line can stably express EYFP yellow fluorescent protein and is sensitive to the internal flow of I-. Therefore, it can be used as an ideal screening model of anion channel blocker (halide ion).

KEY WORDS:anion; halide ion; fluorescence protein; anion channel blocker; screening model; gene recombination

Supported by the Health Care Plan of the Army (No.13BJZ34) and the Industry Fund of Ministry of Health (No.201302008)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0911.006.html(2016-06-08)