CD133陽性/陰性肺癌細胞的分選、鑒定及差異基因的篩選

鄭少秋 李書華 王紅艷 謝曉斌 張雅潔

腫瘤轉移和復發(fā)是惡性腫瘤臨床治療失敗及患者死亡的主要原因，腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSCs）是導致腫瘤發(fā)生轉移、復發(fā)的關鍵所在[1]。

目前，人們已經分離出乳腺癌干細胞，并證實腦良性和惡性腫瘤、惡性黑色素瘤細胞系、結腸癌、肝癌、前列腺癌等實體瘤中存在CSCs[2-4]。肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤，研究[5,6]表明肺癌中存在CSCs，CD133可能是肺癌干細胞的標記物。本研究擬通過MACS的方法對肺癌細胞株A549中的CD133陽性細胞及CD133陰性細胞進行分選，并對其生物學特性進行鑒定。在此基礎上，利用基因芯片對CD133陽性/陰性細胞進行對比檢測，篩選轉移相關的差異基因，旨在為腫瘤轉移機制的研究提供新線索，為肺癌的基因治療提供新靶點。

1 材料和方法

1.1 組織標本 收集廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院自2005年1月-2008年12月手術切除的81例肺癌石蠟包埋組織（患者術前均未接受化療和放療），患者年齡最大81歲，最小29歲，中位年齡50歲。根據2004年世界衛(wèi)生組織肺癌組織分類標準進行分類，81例肺癌組織中鱗癌29例，腺癌34例，大細胞癌、腺鱗癌、肉瘤樣癌各4例，小細胞癌6例；臨床分期I期28例，II期21例，III期27例，IV期5例；伴淋巴結轉移者43例，無轉移者38例。同時收集10例正常肺組織。

1.2 細胞培養(yǎng) 肺腺癌A549細胞系來源于ATCC，引自廣州醫(yī)學院中心實驗室。采用含10%新生牛血清（Gibco）RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco）于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)液。細胞密度為80%-100%時，0.25%胰酶-EDTA消化液消化后，1:3傳代。

1.3 細胞分選 分別采用陽性分選柱（MS柱）和陰性分選柱（LD柱）分選CD133陽性細胞及CD133陰性細胞：A549細胞在75 cm3培養(yǎng)瓶中生長達80%融合時，0.25%胰酶EDTA消化液消化后，收獲單細胞懸液，計數細胞，取≤108個細胞過柱進行分選，步驟按試劑盒（Miltenyi）說明書進行。

1.4 免疫熒光技術檢測細胞純度 取經分選細胞（CD133陽性細胞、CD133陰性細胞）制備細胞涂片，利用PE標記CD133-2（Miltenyi）抗體進行免疫熒光檢測，步驟按試劑盒說明進行。熒光顯微鏡觀察，細胞呈現明亮紅色熒光為陽性。

1.5 “sphere”形成實驗及誘導分化實驗 取等量的CD133陽性細胞及CD133陰性細胞按1,000個/mL的比例置于添加了10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，20 mg/mL表皮生長因子，50 mg/mL胰島素，100 mg/mL脫鐵轉鐵蛋白，10 mg/mL腐胺，0.03 mmol/L亞硒酸鈉，2 mmol/L黃體酮，0.6%葡萄糖，5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1%碳酸氫鈉，0.4%牛血清白蛋白及谷氨酰胺的無血清DMEM-F12培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待培養(yǎng)基變黃進行換液；取培養(yǎng)形成的“sphere”加入含10%胎牛血清（Gibco）的DMEM-F12（Gibco）培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞貼壁或培基變黃進行換液。

1.6 免疫組織化學（immunohistochemistry, IHC） 采用二步法進行CD133、CK7染色，步驟按試劑盒說明進行。對照設置：用PBS代替一抗作為陰性對照，選已知陽性病例作陽性對照。腫瘤細胞胞漿與胞膜呈現棕褐色為陽性。

1.7 平板克隆實驗 選用12孔板，CD133陽性細胞、CD133陰性細胞、未分選細胞單細胞懸液（50個/孔）加入含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待出現肉眼可見的細胞克隆時終止培養(yǎng)，顯微鏡觀察并計數大于50個細胞的克隆數，然后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.8 基因芯片檢測轉移相關差異基因 采用SuperArray第二代功能分類基因芯片對CD133陽性細胞及CD133陰性細胞（原代）分別進行腫瘤轉移基因（84個轉移相關基因）的對比檢測，結合生物信息學技術分析兩組之間的差異基因。按常規(guī)方法提取CD133陽性細胞（實驗組）及CD133陰性細胞（對照組）的RNA，合成cDNA、熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, RTFQ PCR）操作分別按照RT2 PCR Array First Strand Kit-C03、PCR Array試劑盒說明書進行操作。數據分析采用ΔΔCt方法。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。兩樣本構成比（率）比較采用χ2檢驗，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較用單因素方差分析（Student Newman Keuls, SNK）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IHC結果 肺癌組織中CD133陽性腫瘤細胞呈分散或小灶狀/巢狀分布于癌巢邊緣，數量稀少。81例肺癌標本CD133表達陽性率為53.1%（43/81），CD133表達與各組織學類型的關系分析顯示：鱗癌、腺癌及其他類型陽性率分別為48.3%（14/29）、52.9%（18/34）和61.1%（11/18），CD133的表達與組織學類型無關（P＞0.05）（表1，圖1A-圖1B）；與腫瘤分級及臨床分期無關（P＞0.05）。10例正常肺組織中均未見CD133陽性細胞。人肺腺癌A549細胞株中有CD133陽性細胞存在，數量稀少（圖2）。

2.2 MACS分選結果 從人肺腺癌A549細胞株中分選出CD133陽性細胞比例約為0.2%。分選獲得的CD133陽性細胞中絕大部分細胞發(fā)明亮紅色熒光（圖3），CD133陰性細胞中僅見少量細胞發(fā)微弱紅色熒光，表明MACS分選所獲得細胞純度較高。

2.3 “sphere”形成及誘導分化實驗結果 CD133陽性細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成“sphere”，CD133陰性細胞培養(yǎng)8周未見“sphere”形成；“sphere”加入含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)呈現貼壁生長，誘導分化前表達CD133、不表達CK7；誘導分化后CD133陰性、CK7陽性（圖4）。

2.4 平板克隆形成實驗結果 CD133陽性細胞、CD133陰性細胞、未分選細胞組平均克隆形成率分別為57.1%、3.3%、8.7%，三組間克隆形成率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.5 RNA提取 核酸定量儀檢測各組細胞總RNA的OD260/OD280均在1.7-2.0之間，說明RNA純度高；變性瓊脂糖凝膠電泳顯示28s、18s條帶清晰，前者熒光強度約為后者的兩倍，5s條帶弱，說明RNA完整、無降解。

2.6 基因芯片檢測結果 顯示從擴增曲線可見所有樣品均已進入平臺期，說明反應條件設定準確（圖5）。CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的基因表達有顯著差異。84個轉移基因中，差異達兩倍或以上的有19個，其中差異＞2倍、≤3倍的基因有14個，差異＞3倍、≤4倍的基因有3個，差異＞4倍、≤5倍的基因有1個，差異＞5倍的基因有1個（表3）。

表1 CD133表達與臨床病理特征的關系Tab 1 Relationship between the expression of CD133 and clinicopathological features of lung cancer

表2 CD133陽性、CD133陰性細胞及未分選細胞的克隆形成率Tab 2 The cloning forming rates of CD133-positive cells, CD133-negative cells and unsorted cells

表3 CD133+與CD133-細胞的腫瘤轉移相關差異基因Tab 3 Differentially expressed metastasis-related genes between CD133+ and CD133- cells

圖1 人肺癌組織中CD133陽性表達。A：肺鱗癌二步法（EnVision，×200）；B：肺腺癌二步法（EnVision，×200）Fig 1 CD133 expression of Human lung cancer tissues.A:Lung squamous cell carcinoma (EnVision, ×200); B: Lung adenocarcinoma (EnVision, ×200).

圖2 人肺腺癌A549細胞株中CD133陽性表達（EnVision，×200）Fig 2 CD133 expression of human lung cancer cell line A549(EnVision, ×200)

圖3 CD133陽性細胞（20×10，熒光顯微鏡）Fig 3 CD133-positive cells (20×10, Fluorescence microscopy)

圖4 誘導分化前（A: CD133+, B: CK7-）及誘導分化后（C: CD133-, D: CK7+）Fig 4 Undifferentiated cells (A: CD133+, B: CK7-) & Differentiated cells (C: CD133-,D: CK7+)

圖5 轉移基因熒光定量PCR擴增曲線。A：CD133陰性細胞；B：CD133陽性細胞。Fig 5 Quantitative PCR amplification of metastasis-related genes.A: CD133-negative cells; B:CD133-positive cells.

3 討論

CD133，又稱prominin-1/AC133抗原，是prominin家族成員之一。最初，其作為成體干細胞的標志物被大多數學者認識和接受。隨后，在包括腦腫瘤、甲狀腺癌、乳腺癌、肝細胞癌、胰腺癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌等腫瘤中發(fā)現CD133陽性的腫瘤細胞具有干細胞特性，因而CD133被認為是通用的CSCs表面標記物。為了解CD133在肺癌組織中的表達情況，我們收集了81例人肺癌組織石蠟標本進行IHC染色。在81例肺癌組織中，43例腫瘤細胞CD133呈陽性表達，但陽性細胞數量稀少，余38例腫瘤組織未見CD133陽性細胞。這一結果與Eramo[6]的報道有所不同。Eramon采用19例新鮮肺癌組織進行流式細胞術（fluorescence-activated cell sorting,FACS）檢測，發(fā)現CD133陽性細胞的比例雖然很低，但在所有的標本中都存在CD133陽性細胞。我們認為造成這一差異的原因可能由于：①本研究所用的材料是石蠟包埋組織而非新鮮組織；②Eramon進行FACS所用的新鮮肺癌組織體積較大，而本研究用于IHC的石蠟組織只有3 μm-4 μm厚，僅僅是腫瘤組織中極小的一部分，而眾所周知CSCs數量稀少，在腫瘤組織中也只占極低的比例，因此，不能完全認為其余的38例組織中沒有CD133陽性細胞。在48例表達CD133的肺癌組織中，CD133陽性的腫瘤細胞呈小灶狀/巢狀分布。這與以前的發(fā)現[6,7]一致，有學者認為這一現象與干細胞“niche”有關。干細胞“niche”是干細胞居留的微環(huán)境，正常情況下干細胞聚居于組織器官特定的“niche”中，CSCs因保留了干細胞的特性而呈現“niche”分布現象。我們推測CD133陽性細胞在肺癌組織中呈灶狀或巢狀分布并非偶然，可能與其具有CSCs特性有關。統(tǒng)計分析CD133表達與肺癌組織學類型、腫瘤的分級及臨床分期的關系，證明均無相關性，這與報道的CSCs標記物在腫瘤組織中的表達與腫瘤病理學指標無關相一致[8]。

在本研究中，我們采用MACS技術對人肺腺癌A549細胞株中的CD133陽性細胞和CD133陰性細胞進行分選。在分選前，為明確A549細胞株中是否存在CD133陽性細胞，我們對A549細胞株進行IHC染色，結果顯示A549細胞株存在少量的CD133陽性細胞。隨后，我們對細胞進行分選，結果顯示5×106個分選前細胞經過分選獲得CD133陽性細胞數約為1×104個，CD133陽性細胞在人肺腺癌A549細胞株中所占比例極低，僅約為0.2%。我們采用熒光素（PE）標記的CD133-2抗體對分選所得細胞進行純度評估。熒光顯微鏡下觀察經分選所得的CD133陽性細胞可見細胞發(fā)明亮的紅色熒光；CD133陰性細胞中則僅見極個別發(fā)紅色熒光的細胞，考慮可能為分選過程中洗脫的陽性細胞或抗體非特異性結合顯色。由此可見，采用MACS技術能獲得高純度的CD133陽性細胞和CD133陰性細胞。

對分選所得的CD133陽性/陰性細胞進行生物學特性鑒定主要依據CSCs所具有的特性[9-11]，即：①高致瘤性：少于104個甚至是100個腫瘤干細胞就能在免疫缺陷動物體內致瘤；②自我更新特性：腫瘤干細胞能在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長并形成“sphere”；③分化潛能：在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長所得的“sphere”可被血清誘導分化，呈現貼壁生長[6]；④耐藥性（drug resistance）；⑤高增殖潛能。在本研究中，我們主要從腫瘤細胞的自我更新特性、分化潛能、增殖潛能三方面對分選所得的CD133陽性/陰性人肺腺癌A549細胞進行比較和鑒定。我們的研究顯示：①CD133陽性細胞組在培養(yǎng)的第9天可見“sphere”形成，隨培養(yǎng)時間遷移，數量逐漸增多，而CD133陰性細胞組培養(yǎng)至第8周未見“sphere”形成；②CD133陽性細胞組形成“sphere”置于含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)兩周全部貼壁。顯微鏡下觀察這些貼壁生長細胞的形態(tài)與未經分選的人肺腺癌A549細胞無明顯差異。誘導分化前細胞表達CD133、不表達CK7，誘導分化后CD133由陽性轉變?yōu)殛幮?，而分化標志物CK7則由陰性轉變?yōu)殛栃?。③CD133陽性、CD133陰性、未分選細胞的平均克隆形成率分別為57.3%、3.3%、8.7%，表明三組細胞增殖能力CD133陽性細胞＞未分選細胞＞CD133陰性細胞。未分選細胞的增殖能力居于二者之間可能與未分化細胞中含少量CD133陽性細胞有關。綜上所述，CD133陽性細胞與CD133陰性細胞在自我更新特性、分化潛能、增殖潛能方面具有明顯的差異。CD133陽性細胞具有自我更新能力，可被血清誘導分化，且具有更高的增殖潛能。因此，我們認為本實驗經MACS獲得的CD133陽性人肺腺癌A549細胞具有CSCs的特性。

CSCs被認為是腫瘤轉移發(fā)生的主要原因，理論上說其在轉移相關基因的表達上應該與非腫瘤干細胞有明顯的差異。因此，本研究采用基因芯片技術對分選后未經培養(yǎng)的CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的腫瘤轉移相關基因進行檢測，篩選差異基因。我們采用了美國SuperArray公司生產的第二代功能分類基因芯片。該芯片按照功能或信號通路對基因進行了篩選和分類，避免了高通量基因芯片因數據過多而難以分析的缺點。同時，它還將檢測精度提高到了與實時定量PCR相當的水平，芯片檢測后無需再進行PCR驗證。因此，使用該芯片能高效、準確地對CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的腫瘤轉移基因進行篩選。

在檢測的84個轉移基因中，差異基因涉及：①促進血管新生的基因（MYC、VEGFA、FGFR4、HGF、MET、CXCR4）和抑制血管生成的基因（HTATIP、TP53）；②促進細胞遷移的基因（ITGB3、CTBP1、APC、HGF、CXCR4）和抑制細胞運動的基因（NF2、NME）；③促進細胞外基質降解的調控因子相關基因（MYC、MMP2、ITGB3、IL1B）；④調控細胞間黏附作用的基因（CDH1、CDH11）；⑤機制未明的基因CD82、EWSR1。與CD133陰性細胞相比，CD133陽性細胞相關基因表達下調，由此可見，CD133陽性細胞在細胞外基質降解、形成新生血管及細胞運動方面可能并不具備比CD133陰性細胞更高的潛能。我們推測，CD133陽性細胞具有高增殖能力，可通過不斷增殖產生大量的子代細胞，這些子代細胞中大部分是CD133陰性細胞，它們高表達正向調控細胞外基質降解、血管新生、淋巴管生成相關的基因，通過合成相應的細胞因子降解細胞外基質、促使血管新生和淋巴管新生，為CD133陽性細胞發(fā)生轉移營造有利的環(huán)境。CD133陽性細胞由于低表達細胞間黏附分子，更易于從原發(fā)灶脫落形成“腫瘤芽”進而發(fā)生轉移。Zlobec等[12]的研究也發(fā)現在轉移性結直腸癌浸潤前緣發(fā)生上皮細胞間充質細胞化（epithelial-tomesenchymal transition, EMT）的腫瘤細胞以“腫瘤芽”形式侵潤性生長，而這些“腫瘤芽”高度表達CSCs標記物。

在檢測的84個腫瘤轉移基因中，CD133陽性細胞與CD133陰性細胞在CD82基因的表達差異最為明顯。CD82，又稱KAI1，是1995年由Dong[13]發(fā)現并分離的腫瘤轉移抑制基因。研究[14,15]表明CD82能有效抑制肺癌的轉移。CD82通過與Duffy抗原趨化因子受體（duffy antigen receptor for chemokines, DARC）的相互作用使進入血液循環(huán)的CD82+腫瘤細胞與表達DARC的血管內皮細胞發(fā)生黏附從而阻斷腫瘤細胞的轉移[16]；它還可能通過抑制轉移部位腫瘤細胞的生長從而發(fā)揮抑制腫瘤轉移的作用[17]。我們的研究結果顯示，與CD133陰性細胞相比，CD133陽性細胞中CD82的表達降低，兩者之間的差異達12倍。我們推測，CD133陽性細胞由于低表達CD82，與DARC+血管內皮細胞的相互作用較弱，易于發(fā)生轉移；到達轉移部位后受CD82抑制增殖的影響較小，更容易形成轉移瘤，因此在腫瘤轉移過程中發(fā)揮關鍵作用。

迄今為止，關于CSCs中轉移相關基因的研究及報道很少，CSCs在腫瘤轉移過程中的作用機制仍不清楚，有待進一步研究。