桐鄉(xiāng)市2014
—2015年感染性腹瀉副溶血弧菌分離株檢測分析

吳龍飛，嚴卓琳，張軼浙江省桐鄉(xiāng)市疾病預(yù)防控制中心，浙江桐鄉(xiāng)　314500

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桐鄉(xiāng)市2014
—2015年感染性腹瀉副溶血弧菌分離株檢測分析

吳龍飛，嚴卓琳，張軼
浙江省桐鄉(xiāng)市疾病預(yù)防控制中心，浙江桐鄉(xiāng)314500

［摘要］目的了解該市感染性腹瀉副溶血弧菌主要血清型、攜帶毒力因子情況和耐藥性情況.方法對2014—2015年期間的40株副溶血弧菌分離株進行血清凝集、毒力基因檢測和耐藥性分析.結(jié)果分離到3種血清型：O3﹕K6 22株（55%），O4﹕K8 12株（30%），O2﹕KUT 2株（5%），另外10%未分型；TDH陽性24株，陽性率60%，TRH陽性0株；對除碳青霉烯類和喹諾酮類外的6大類抗生素均有耐藥性，其中對β-內(nèi)酰胺類、葉酸代謝途徑抑制劑及氯霉素的耐藥性相對較高，對兩種以上抗生素耐的有4株，占10%.結(jié)論該市副溶血弧菌感染性腹瀉以O(shè)3﹕K6為主，毒力基因tdh陽性率較高，對六大類抗生素有耐藥性，但耐藥性不嚴重.

［關(guān)鍵詞］副溶血弧菌；毒力基因；耐藥性；感染性腹瀉

副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus，VP）是一種革蘭氏陰性嗜鹽細菌，廣泛存在于近岸海水和海產(chǎn)品中，可引起人類急性腸胃炎、創(chuàng)傷感染和敗血癥［1］.食用未經(jīng)加工成熟的海產(chǎn)品是副溶血性弧菌感染的主要方式.副溶血弧菌致病菌株能產(chǎn)生兩種主要致病因子，包括耐熱直接溶血素（TDH）和耐熱相關(guān)溶血素（TRH）.1996年印度加爾各答分離出一種TDH+、TRH-的03：K6型克隆群后，該群副溶血弧菌引起的食物中毒呈明顯上升趨勢，已經(jīng)高居病原性食物中毒的首位［2］.由于抗生素的大量使用，副溶血弧菌的耐藥性不斷增加，因此對其耐藥性的研究顯得十分重要.該研究對該市2014—2015年分離的40株感染性腹瀉副溶血弧菌菌株進行血清學(xué)分型、毒力基因檢測和耐藥性分析，為該病的防控提供技術(shù)支撐，報道如下.

1　材料與方法

1.1實驗菌株

2014—2015年期間該單位分離的40株感染性腹瀉副溶血弧菌菌株，以MicrobankTM磁珠式菌種保藏管凍存于-70℃.

1.2試劑

MicrobankTM磁珠式菌種保藏管購自Pro-Lab Diagnostics；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購自貝瑞特生物技術(shù)（鄭州）有限責(zé)任公司；副溶血弧菌K抗原全套診斷血清和副溶血弧菌O抗原全套診斷血清購自日本生研；副溶血弧菌耐熱直接溶血素（TDH）檢測試劑盒和副溶血弧菌耐熱相關(guān)溶血素（TRH）檢測試劑盒購自上海輝睿生物科技有限公司；Mueller-Hinton瓊脂購自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏試劑盒購自杭州天和微生物試劑有限公司.

1.3菌種復(fù)蘇

將MicrobankTM磁珠式菌種保藏管從-70℃取出，無菌操作打開保藏管，用無菌鑷子取出一粒磁珠，劃線接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基.

1.4血清學(xué)分型

1.4.1 K抗原凝集用3%氯化鈉溶液將可疑菌落制備成108 cfu/mL的菌懸液；在潔凈玻片上滴加兩滴約15 uL彼此分離的菌懸液；在一滴菌懸液上滴加同體積的血清，在另一滴菌懸液上滴加生理鹽水作為對照；分別混勻玻片上的兩種混合液；輕輕搖動玻片40 s，觀察；于40 s內(nèi)呈明顯凝集者為陽性，呈均勻渾濁者為陰性.

1.4.2 O抗原凝集用3%氯化鈉溶液將可疑菌落制備成108 cfu/mL的菌懸液；121℃1 h滅活；離心去上清，用同體積的含有5%甘油的3%氯化鈉溶液重懸菌體；在潔凈玻片上滴加2滴約15 uL彼此分離的菌懸液；在一滴菌懸液上滴加同體積的血清，在另一滴菌懸液上滴加生理鹽水作為對照；分別混勻玻片上的兩種混合液；輕輕搖動玻片40 s，觀察；于40 s內(nèi)呈明顯凝集者為陽性，呈均勻渾濁者為陰性.

1.5毒力基因檢測

1.5.1模板DNA準備將菌株接種到3%氯化鈉堿胨中36℃培養(yǎng)過夜，取1 mL培養(yǎng)液于EP管中，10 000 g離心2 min，棄上清；用去1 mL無酶水洗滌1次；加入200 mL無酶水，100℃水浴10 min后冰浴5 min；8 000 g離心2 min，收集上清液為DNA模板.

1.5.2 TDH/TRH的PCR檢測按照副溶血弧菌耐熱直接溶血素（TDH）檢測試劑盒和副溶血弧菌耐熱相關(guān)溶血素（TRH）檢測試劑盒說明書操作，TDH/TRH反應(yīng)液各20 μL、待測樣品各5 μL.反應(yīng)條件為95℃，5 min預(yù)變性；95℃，10s變性、58℃，45 s退火延伸和檢測熒光、40個循環(huán). Ct值＜35，判定為陽性結(jié)果；Ct值≥38，判定為陰性結(jié)果；35≤Ct值＜38，重復(fù)測定2次，Ct值≥38，陰性結(jié)果，其中一次Ct值＜38，陽性結(jié)果.

1.6耐藥性分析

采用紙片擴散法操作，結(jié)果參照美國臨床實驗室標準委員會CLSI標準進行選藥及判斷，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922.

2　結(jié)果

2.1血清學(xué)分型

40株副溶血弧菌分離株有4株不能分型，分型率為90%，其中K抗原6株不能分型，分型率為85%；O抗原4株不能分型，分型率為90%.共分離到3種血清型：O3﹕K6 22株（55%），O4﹕K8 12株（30%），O2﹕KUT 2株（5%）.

2.2 tdh/trh毒力基因檢測

40株副溶血弧菌分離株檢測到tdh陽性株為24株，陽性率60%；未檢測到trh陽性株.

2.3藥敏試驗

副溶血弧菌的藥敏結(jié)果見表1，結(jié)果顯示副溶血弧菌分離株對除碳青霉烯類和喹諾酮類外的六大類抗生素均有耐藥性，而其中對β-內(nèi)酰胺類抗生素和葉酸代謝途徑抑制劑及氯霉素的耐藥性相對較高.氨芐西林的耐藥率最高32.5%，其次哌拉西林和復(fù)方新諾明12.5%.多重耐藥方面，對兩種以上抗生素耐藥的有4株，占10%.

表1　40株副溶血弧菌分離株對22種抗生素耐藥性

3　討論

自1950年日本大阪首次發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌感染性腹瀉以來，該菌已經(jīng)引起全世界范圍的副溶血弧菌疾病流行［3］.目前已經(jīng)有至少11種造成流行的血清型被確認［4］，包括O3﹕K6，O4﹕K68，O1﹕K25，O1﹕K41，O1﹕KUT，O1﹕K56，O3﹕K75，O4﹕K8，O4﹕K12，O4﹕KUT和O5﹕KUT（UT代表不能分型）.該市分離到的副溶血弧菌O3﹕K6 22株（55%），O4﹕K8 12株（30%），O2﹕KUT 2株（5%），可見該地患者分離的流行株以O(shè)3﹕K6群和O4﹕K8群為主，這與周邊其他相關(guān)研究結(jié)論一致［5-6］.

大部分臨床分離株帶有tdh基因，或trh基因，或同時帶有兩種基因，編碼TDH耐熱直接溶血素和TRH耐熱相關(guān)溶血素.流行病學(xué)調(diào)查表明，TDH是副溶血弧菌最主要致病因子是副溶血性弧菌的主要毒力因子.我們通過對40株副溶血弧菌感染性腹瀉菌株的PCR檢測，檢測到tdh基因陽性24株，陽性率60%，而trh基因陽性率為0%.其中O3﹕K6型tdh陽性16株（72.73%），O4﹕K8型tdh陽性5株（62.5%），經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可見副溶血弧菌臨床分離株血清型與感染力之間不存在相關(guān)性.

隨著抗生素的廣泛使用，副溶血性弧菌耐藥性越來越嚴重.該次使用八大類22種抗生素對40株副溶血弧菌感染性腹瀉分離菌株進行藥敏試驗，結(jié)果顯示副溶血弧菌分離株對碳青霉烯類和喹諾酮類敏感率為100%，對其他六類抗生素都有一定的耐藥性.除對氨芐西林（22.5%）外，對其他抗生素敏感率均在80%以上，提示該市副溶血弧菌分離株耐藥性情況相對不是很嚴重.多重耐藥方面，對兩種以上抗生素耐藥的有4株，占10%，需要注意防止多重耐藥性菌株的出現(xiàn).

通過對桐鄉(xiāng)市2年來感染性腹瀉副溶血弧菌分離株進行血清分型、毒力因子情況和耐藥性情況的檢測，更好地了解了該市感染性腹瀉副溶血弧菌的特性及耐藥問題，從而為副溶血弧菌引起的感染性腹瀉提供有效的治療和控制依據(jù).

［參考文獻］

［1］張沖，高翔，甄博珺，等.副溶血弧菌PFGE分型、毒力基因及其耐藥性分析［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，23（4）：1015-1018.

［2］石曉路，王藝，扈慶華，等.深圳地區(qū)2002-2008年副溶血弧菌分子特征研究［J］.中華流行病學(xué)雜志，2013，34（6）﹕609-613.

［3］Sumio S.Sixty years from thediscovery of Vibrio parahaemoluticus and some recollections［J］.Biocontrol science，2011，16 （4）﹕129-137.

［4］Gonzalez-Escalona N，Strain EA，De Jesus AJ，et al.Genome sequence of the clinical O4﹕K12 serotype vibrio parahaemolyticus strain 10329［J］.Journal of bacteriology，2011，193 （13）﹕3405-3406.

［5］謝紅意，周方滿，韓東升，等.寧波地區(qū)急性腹瀉患者副溶血弧菌表型及分子特征研究［J］.臨床檢驗雜志，2013（10）﹕792-794.

［6］陳海麗周海健宰淑蓓，等.2010--2012年上海市兩家哨點醫(yī)院門診腹瀉病例副溶血弧菌感染狀況及菌株分子特征分析［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2015，49（3）﹕233-236.

［中圖分類號］R155

［文獻標識碼］A

［文章編號］1672-5654（2016）02（c）-0112-03

DOI：10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.06.112

［作者簡介］吳龍飛（1985.11-），男，浙江桐鄉(xiāng)人，碩士，技師，研究方向：微生物檢驗.

收稿日期：（2015-11-16）

The Analysis of Vibrio Parahaemolyticus Isolated from In fectious Diarrhea Patients in Tongxiang City During 2014 to 2015

WU Long-fei，YAN Zhuo-lin，ZHANG Yi
Centers for Disease Control and Prevention，Tongxiang，Zhejiang Province，314500 China

［Abtract］Ob jective To investigate the serotypes，toxic genes and antibiotics resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated from infectiousdiarrhea patients in Tongxiang city. Methods 40 Vibrio parahaemolyticus isolatesduring 2014 to 2015 in Tongxiang city were serotyped，thermostabledirect hemolysin gene（tdh）and thermostabledirect hemolysin-related gene（trh）of which weredetermined by PCR，anddrug sensitive was tested by the method ofdiskdiffusion. Results Vibrio parahaemolyticus isolates were serotyped to 3 serotype﹕O3﹕K6﹕55%，O4﹕K8﹕30%，and O2﹕KUT 5%，the rest 10%were unserotyped；24 of 40 weredetermined tdh positive，the positive rate was 60%；none were trh positive；Except carbopenems and quinolones，all the Vibrio parahaemolyticus isolates were resistant to other kinds of antibiotics，showing relatively higher resistance to β-lactams，folate pathway inhibitors and chloromycetins. And there were 4 isolates resistant to more than 2 kinds of antibiotics simultaneously，for 10%. Conclusion The most popular type of Vibrio parahaemolyticus isolated from infectiousdiarrhea patients in Tongxiang city was O3﹕K6；the positive rate of thermostabledirect hemolysin gene（tdh）was relatively high；all the Vibrio parahaemolyticus isolates were resistant to 6 of 8 kind of antibiotics，but not very serious.

［Key words］Vibrio parahaemolyticus；Toxic gene；Antibiotics resistance；Infectiousdiarrhea