HPLC法與CMIA法監(jiān)測(cè)癲癇患者血漿中苯巴比妥濃度的一致性評(píng)價(jià)

錢(qián) 釗，郭美華，陳 巖，魯 靜，曲 婷，段麗娟，海 鑫（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150001）

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HPLC法與CMIA法監(jiān)測(cè)癲癇患者血漿中苯巴比妥濃度的一致性評(píng)價(jià)

錢(qián) 釗，郭美華，陳 巖，魯 靜，曲 婷，段麗娟，海 鑫（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150001）

[摘要]目的：建立高效、實(shí)用的癲癇患者苯巴比妥藥物濃度監(jiān)測(cè)方法，評(píng)價(jià)高效液相色譜（HPLC）法與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫（CMIA）法的相關(guān)性和一致性。方法：分別采用HPLC法和CMIA法監(jiān)測(cè)55例癲癇患者血漿中苯巴比妥的藥物濃度，利用Passing-Bablok回歸法、配對(duì)t檢驗(yàn)法和Bland-Altman法分析，考察兩種方法的相關(guān)性及一致性。結(jié)果：以?xún)煞N方法的測(cè)定結(jié)果作回歸方程為Y = 1.024 1 X + 0.349 2（r = 0.988，n = 55），顯示兩種方法相關(guān)性良好；配對(duì)t檢驗(yàn)（P > 0.05）和Bland-Altman法分析結(jié)果表明二者的一致性良好。結(jié)論：HPLC法和CMIA法監(jiān)測(cè)癲癇患者血漿中苯巴比妥的藥物濃度具有較好的相關(guān)性與一致性，可以相互替代，均可用于臨床監(jiān)測(cè)治療藥物濃度。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法；化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法；苯巴比妥；治療藥物濃度監(jiān)測(cè)；一致性

癲癇是一種常見(jiàn)的、慢性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。苯巴比妥（phenobarbital，PB）是一種非選擇性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)靜劑[1]，是臨床上常的廣譜抗癲癇藥物，于癲癇大發(fā)作和部分性發(fā)作的治療，對(duì)兒童的抗癲癇治療有效[2]，是新生兒癲癇的一線(xiàn)藥[3]。但其治療窗較窄（15～40 μg·mL-1），毒副作大，其毒性與血藥濃度具有密切相關(guān)性，因此在臨床應(yīng)過(guò)程中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該藥治療藥物濃度監(jiān)測(cè)，以便達(dá)到最佳的治療效果[4]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道監(jiān)測(cè)苯巴比妥血藥濃度常的方法有以下幾種：高效液相色譜（HPLC）法[4-6]、熒光偏振免疫分析（FPIA）法[7]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）法[8-9]、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫（CMIA）法[10-11]等。CMIA法是基于免疫反應(yīng)原理和化學(xué)發(fā)光原理的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，具有自動(dòng)化程度高和靈敏度高等特點(diǎn)，在甲狀腺功能、腫瘤標(biāo)志物、藥物檢測(cè)等方面應(yīng)廣泛[12]，適合臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)，但試劑盒價(jià)格昂貴，不適于小樣本量的應(yīng)。HPLC法已廣泛應(yīng)于臨床藥物濃度的監(jiān)測(cè)[4-6,13-14]，是藥物分析中常規(guī)的方法。由于不同的藥物濃度監(jiān)測(cè)方法之間測(cè)定結(jié)果差異大，給臨床治療評(píng)價(jià)帶來(lái)諸多不便，本研究以CMIA法為對(duì)照，采HPLC法監(jiān)測(cè)癲癇患者血漿中苯巴比妥的藥物濃度，并評(píng)價(jià)二者的相關(guān)性及一致性。

1　儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Architect i2000SR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，D-37520高速離心機(jī)（美國(guó)Abbott公司）；Vortex Genius 3漩渦混合器（德國(guó)IKA公司）；XS205DU電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-600數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

苯巴比妥對(duì)照品（PB，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)171222-200605），苯妥英對(duì)照品（PT，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)101187-201001）。甲醇為色譜純，水為超純水，其他為分析純。

患者血漿收集自2014年7月–2015年7月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院應(yīng)苯巴比妥的55例癲癇患者（年齡2個(gè)月～61歲），空腹抽取穩(wěn)態(tài)谷濃度血樣3 mL，渦旋混勻1 min，6000 r· min-1離心5 min，分離血漿，分成2份，一份于當(dāng)日CMIA法測(cè)定，另一份于–40 ℃低溫冰箱保存?zhèn)?，每月統(tǒng)一HPLC法測(cè)定。空白血漿由志愿者提供。所有血漿樣品均經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審定批準(zhǔn)應(yīng)。

2　方法與結(jié)果

2.1HPLC法

2.1.1色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（47∶53）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm，240 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2樣品的處理 取苯巴比妥對(duì)照品，精密稱(chēng)取10 mg，適量甲醇配成濃度為1 000.0 μg ·mL-1的苯巴比妥對(duì)照品儲(chǔ)備液。依次甲醇稀釋得到濃度為1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 μg·mL-1的系列濃度甲醇標(biāo)準(zhǔn)液。取50 μL上述系列濃度甲醇標(biāo)準(zhǔn)液，各加入450 μL空白血漿后渦旋混勻，即得對(duì)照品血漿系列樣品。同法配制質(zhì)量控制（QC）儲(chǔ)備液（1 000 μg·mL-1），于4 ℃冷藏。取苯妥英對(duì)照品，精密稱(chēng)取9 mg，適量甲醇配成濃度為900 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。

取血漿200 μL，加入50 μL內(nèi)標(biāo)液（苯妥英），渦旋30 s，加入600 μL甲醇，渦旋120 s，離心5 min （15 000 r·min-1，4 ℃），取上清，0.22 μm濾膜過(guò)濾后待分析。

2.1.3專(zhuān)屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿含苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品、空白血漿含內(nèi)標(biāo)液、空白血漿含苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)液、患者服藥后血漿樣品+內(nèi)標(biāo)液，采“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣20 μL。獲得色譜圖，見(jiàn)圖1。樣品分離度及峰形良好，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾苯巴比妥的定量。

圖1　高效液相色譜圖A–空白血漿，B–空白血漿+苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品，C–空白血漿+內(nèi)標(biāo)液，D–空白血漿+苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)液，E–患者血漿+內(nèi)標(biāo)液；1–苯巴比妥，2–內(nèi)標(biāo)（苯妥英）Fig 1 HPLC chromatogramsA–blank plasma, B–blank plasma with phenobarbital, C–blank plasma with internal standard, D–blank plasma with phenobarbital and internal standard, E–the patient's plasma samples with internal standard; 1–phenobarbital, 2–internal standard (phenytoin)

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 取對(duì)照品血漿系列樣品，按“2.1.2”方法處理分析，以苯巴比妥峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）對(duì)苯巴比妥濃度（X）的回歸方程為：Y = 0.019 4 X + 0.009 2（r = 0.999，n = 7）。線(xiàn)性范圍為1.56～100.00 μg·mL-1，線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of the stability test

2.1.9患者血漿測(cè)定 取待測(cè)血漿，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理和上機(jī)分析，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算患者血漿樣品中苯巴比妥的含量。

2.2CMIA法

2.2.1CMIA法原理[12]（Architect 苯巴比妥測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)）吖啶酯標(biāo)記的苯巴比妥分子作為酶競(jìng)爭(zhēng)物，苯巴比妥抗體包被的順磁微粒子作為捕獲物。檢測(cè)樣品時(shí)，將樣本、苯巴比妥抗體包被的順磁微粒子和吖啶酯標(biāo)記的苯巴比妥結(jié)合物混合，制成反應(yīng)混合物。苯巴比妥抗體包被的微粒子與樣本中的吖啶酯標(biāo)記的苯巴比妥結(jié)合物結(jié)合。沖洗后，將預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液加入到反應(yīng)混合物中，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。測(cè)量產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，以相對(duì)發(fā)光單位（RLUs）表示。

2.2.3性能指標(biāo)的評(píng)估 CMIA法的精密度、回收率、線(xiàn)性、靈敏度、特異性等性能指標(biāo)均按照Architect系統(tǒng)操作手冊(cè)執(zhí)行，結(jié)果表明均符合測(cè)定要求。

2.2.4患者血樣測(cè)定 常規(guī)采血后，分離血漿，按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范測(cè)定，儀器自行取樣、分析測(cè)定,每批血漿樣本測(cè)定時(shí)需進(jìn)行質(zhì)控樣品的平行測(cè)定。

2.3兩種檢測(cè)方法的比較

2.3.1方法 CMIA法作為對(duì)照比較的檢測(cè)系統(tǒng)，HPLC法作為待評(píng)價(jià)系統(tǒng)，以?xún)煞N檢測(cè)方法系統(tǒng)可重復(fù)性良好為前提。應(yīng)MedCalc（醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件-英文版），采相關(guān)分析、配對(duì)t檢驗(yàn)和Bland-Altman法對(duì)兩種方法的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3一致性分析 配對(duì)t檢驗(yàn)：將測(cè)試樣品苯巴比妥的HPLC法和CMIA法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，該藥物血清濃度的HPLC法和CMIA法測(cè)定結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異（P > 0.05）。

將兩組測(cè)定值輸入MedCalc軟件進(jìn)行Bland-Altman（B-A）分析[15]，結(jié)果如圖2所示。橫坐標(biāo)X軸表示兩種測(cè)定方法測(cè)定每個(gè)樣本的平均值，縱坐標(biāo)Y軸表示兩種測(cè)定方法測(cè)定每個(gè)樣本的差值與樣本平均值的百分比。圖中的上下兩條水平虛線(xiàn)代表95%一致性界限的上下限，中間實(shí)線(xiàn)代表差值的百分比均數(shù)。兩種分析方法的一致程度越高，實(shí)線(xiàn)越接近虛線(xiàn)。圖中還顯示了分析過(guò)程中出現(xiàn)的極端情況，是由偶然誤差所造成的。

圖2　HPLC與CMIA法偏差圖Fig 2 Deviation chart of HPLC and CMIA method

一般來(lái)說(shuō)，B-A圖形中，在置信區(qū)間上、下限內(nèi)的點(diǎn)要占所有點(diǎn)的95%，并且上下限要在專(zhuān)業(yè)、臨床可接受的臨界值范圍內(nèi)。由圖2可見(jiàn)，3.6%（2/55）的點(diǎn)在95%的一致性界限以外，達(dá)到要求；在一致性界限范圍內(nèi)，HPLC法苯巴比妥的檢測(cè)值與CMIA法檢測(cè)值相比，差值百分比的絕對(duì)值最大為20.1%，國(guó)家臨檢中心要求血漿樣本血藥濃度的檢測(cè)限為±25%。因此，從一致性方面分析，HPLC法與CMIA法對(duì)苯巴比妥測(cè)定的結(jié)果一致性較好，兩種方法可以互換。

3　討論

本研究所建立的HPLC法測(cè)定苯巴比妥血漿藥物濃度，方法簡(jiǎn)便，專(zhuān)屬性好、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，更適于小樣本量的濃度監(jiān)測(cè)，當(dāng)樣品量較大時(shí)建議仍采CMIA法。本研究對(duì)兩種分析方法進(jìn)行了科學(xué)系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，兩者的效能學(xué)指標(biāo)均符合分析要求；對(duì)兩種分析方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了Passing-Bablok相關(guān)性分析[16-17]和Bland-Altman法的一致性評(píng)價(jià)及差別比較。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩種方法的相關(guān)性較好，具有可比性，可以互換。但相關(guān)分析評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)結(jié)果具有明顯的片面性。當(dāng)系統(tǒng)誤差較大時(shí)，相關(guān)分析也呈現(xiàn)較好的一致性，容易產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)論，因?yàn)榛貧w分析只能顯示兩種分析方法測(cè)定值之間的相關(guān)性及密切程度。因此，還需要進(jìn)行一致性的評(píng)價(jià)和分析。

綜上所述，本研究所建立的檢測(cè)苯巴比妥藥物濃度的HPLC法與CMIA法相關(guān)性和一致性良好，兩種檢測(cè)方法可以互換，均可于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。另外，在評(píng)價(jià)兩種臨床檢測(cè)手段時(shí)可采Passing-Bablok相關(guān)性分析和Bland-Altman法進(jìn)行一致性分析。

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Consistent analysis of HPLC and CMIA method in TDM of phenobarbital in epileptic patients' plasma

QIAN Zhao, GUO Mei-hua, CHEN Yan, LU Jing, QU Ting, DUAN Li-juan, HAI Xin(Department of Pharmacy, the First Affliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a practical and reliable method to quantify phenobarbital in epileptic patients' plasma for therapeutic drug monitoring (TDM), and evaluate the correlation and consistency of high-performance liquid chromatography (HPLC) and chemiluminescence microparticle immunoassay (CMIA). Methods: HPLC and CMIA methods were used to monitor the plasma concentration of phenobarbital in 55 epileptic patients, respectively. Then the correlation and consistency of the two methods were analyzed by Passing-Bablok regression, Paired t-test and Bland-Altman analysis. Results: The regression equation of the determination results by HPLC (Y ) and CMIA (X ) was Y = 1.024 1 X + 0.349 2 (r = 0.988, n = 55), which suggested good correlation of the two methods. Paired t-test (P > 0.05) and Bland-Altman analysis suggested a good consistency of the two methods for determining the plasma concentration of phenobarbital. Conclusion: HPLC and CMIA methods had good correlation and consistency in TDM of phenobarbital. These two methods can be replaced by each other and used for clinical TDM.

[KEY WORDS]HPLC; CMIA; Phenobarbital; Therapeutic drug monitoring; Consistency

[中圖分類(lèi)號(hào)]R917

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672–8157(2016)02–0080–05

[基金項(xiàng)目]哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院科研基金（2016B010）

[通信作者]海鑫，女，副主任藥師，主要從事藥物分析工作。E-mail：491824878@qq.com

[作者簡(jiǎn)介]錢(qián)釗，女，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作。E-mail：qz0419@163.com

收稿日期：（2015-10-06 修回日期：2015-12-13）