聚苯乙烯薄膜三維培養(yǎng)肝細胞的實驗研究

楊　波,　任　杰,　龔　翠

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院,上海　200093)

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聚苯乙烯薄膜三維培養(yǎng)肝細胞的實驗研究

楊波,任杰,龔翠

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院,上海200093)

摘要：采用三維聚苯乙烯薄膜作為細胞培養(yǎng)支架,在體外進行大鼠肝細胞的三維培養(yǎng),并與常規(guī)二維肝細胞培養(yǎng)進行比較.分析了細胞的生長狀態(tài)及肝細胞功能,包括細胞存活率、白蛋白分泌功能、尿素合成功能及葡萄糖消耗功能.結果顯示:三維細胞增殖活力均始終明顯高于二維;在顯微鏡下觀察,可看到三維支架表面黏附生長的肝細胞逐漸增多,有肝細胞黏附成團,且肝細胞保持著良好的形態(tài)學結構.研究表明,三維培養(yǎng)的肝細胞其增殖生長和代謝功能都優(yōu)于同樣條件下的二維培養(yǎng),三維聚苯乙烯薄膜可以作為體外肝細胞培養(yǎng)支架,在生物人工肝培養(yǎng)體系中具有應用前景.

關鍵詞：聚苯乙烯薄膜; 三維培養(yǎng); 二維培養(yǎng); 肝細胞

細胞在體外的生長增殖、分化和代謝功能的表達,對細胞培養(yǎng)而言特別重要,高密度細胞培養(yǎng)是體外形成組織或器官的基礎.細胞在二維(2D)平面的培養(yǎng)模式下生長,目前大部分實驗研究都基于此,盡管這種培養(yǎng)方式操作方便,但是與細胞在體內的生長模式相差甚遠.在二維環(huán)境下培養(yǎng)的細胞并不總是按照實際情況生長運作,有時細胞不得不改變形態(tài)以適應二維的培養(yǎng)條件,最終導致細胞形成扁平的細胞形態(tài),而這些改變影響細胞的生長分化并削弱細胞功能,因此影響最終的實驗研究效果[1-4].三維支架(Alvetex-3D)細胞培養(yǎng)模型作為一種新型的細胞培養(yǎng)模式,在體外構建與體內相近的細胞微環(huán)境,更好地模擬了細胞生長的微環(huán)境,維持細胞發(fā)育結構系統,有助于我們了解細胞體內復雜的生物現象.因此,三維細胞培養(yǎng)既能保留體內細胞微環(huán)境的物質基礎,又能體現細胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性,把這種技術通過體外培養(yǎng)與動物模型結合起來,能形成一種方便高效的研究體系,為研究組織的形成及藥物的篩選等方面提供重要的平臺,并為研究提供更準確的數據.

本研究采用聚苯乙烯薄膜作為細胞培養(yǎng)三維支架,通過模擬細胞在天然組織中的復雜環(huán)境和狀態(tài),可以獲得更準確的細胞行為功能.相比于二維培養(yǎng)結果,在三維支架中細胞能保持天然的三維結構,自由地與相鄰細胞聯系,細胞在體外生長更接近體內環(huán)境.實驗評估并比較了在傳統二維培養(yǎng)與三維系統培養(yǎng)下肝細胞的生長增殖和功能代謝的情況.本實驗研究肝細胞的三維培養(yǎng)可以為生物人工肝體外構建人工肝組織,進而為肝移植提供供體.

1材料與方法

1.1材料

大鼠肝細胞購于上海細胞生物研究所.Me2SO(無菌,二甲基亞砜)、胎牛血清、1640培養(yǎng)液、葡萄糖、試劑盒等購于上海索萊寶生物科技有限公司.三維支架購于上海普飛生物科技有限公司.

1.2實驗儀器

實驗所采用的儀器:電子天秤(SartoriusBP211D,德國)、二氧化碳培養(yǎng)箱(HH.CP-01W,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、立式壓力蒸汽滅菌器(Tommy有限公司,日本)、顯微鏡(ECLIPSE55i,日本Nikon)、酶標儀(LRM340M,北京博邁杰科技有限公司)、場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(QuantaFEG,FEI公司,美國).

1.3實驗方法

1.3.1大鼠肝細胞的Alvetex-3D培養(yǎng)

首先,進行Alvetex-3D的前處理:

a. 取出載體,打開獨立包裝,用鑷子小心地取出細胞小室;

b. 將小室裝入6孔培養(yǎng)板中,每孔大約需要70%的乙醇溶液5ml,浸泡潤洗數分鐘;

c. 吸出乙醇,用1 640培養(yǎng)液潤洗兩遍,徹底洗去乙醇,泡在培養(yǎng)液內,置于培養(yǎng)箱中備用.

然后,進行細胞的接種培養(yǎng):

a. 吸去6孔板內的培養(yǎng)液,小心地將原代大鼠肝細胞以每孔約3×105個細胞的密度接種于細胞小室的圓片中央;

b. 蓋上蓋子,將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內孵育60～90min,讓細胞與支架充分結合;

c. 沿著細胞小室邊緣緩慢加入6ml培養(yǎng)液(胎牛血清和1 640培養(yǎng)液的配比為1∶9),蓋上蓋子,將培養(yǎng)板置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃,5%CO2,100%濕度)中;

d. 密切關注培養(yǎng)液的狀況,液體顏色變?yōu)榈t色甚至黃色則需換液,一般培養(yǎng)的前4d可隔天進行一次換液,繼續(xù)培養(yǎng)則需每天觀察并換液.

1.3.2大鼠肝細胞的二維培養(yǎng)

由于二維培養(yǎng)是平面培養(yǎng),細胞直接接種于6孔板中.在超凈臺上,將分離的肝細胞按每孔約3×105個細胞的密度接種于培養(yǎng)板孔中,加入6ml培養(yǎng)液,置培養(yǎng)板于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃,5%CO2,100%濕度)中.培養(yǎng)并隔天進行換液與觀察.

1.3.3電鏡的形態(tài)學觀察

為了清晰反映聚苯乙烯的三維結構,需要利用電鏡進行觀察,具體步驟如下.

a. 取材:小心用鑷子取0.5cm3左右的三維支架樣本,放入樣品管內.

b. 固定:樣本加入濃度為2.5%的戊二醛,在4 ℃冰箱內放置2h以上;用pH7.4的磷酸緩沖液洗3次,每次30min左右;再用4 ℃ 預冷的濃度為1%的鋨酸固定1.5h,然后用緩沖溶液(PBS)浸洗2次,每次10min.

c. 脫水:用配比為1∶1的丙酮、醋酸異戊酯混合液脫水處理10min;再分別用30%,50%,70%,80%,90%,95%,100% 的酒精溶液脫水,每種濃度脫水2 次,每次15min.

d. 干燥:將待測樣品置于臨界點干燥器內,浸泡在液態(tài)二氧化碳中,加熱至臨界點溫度(31.40 ℃,72.8個大氣壓)以上,使之干燥.

f. 噴金:噴鍍均勻后掃描電鏡下觀察.

1.3.4細胞增殖活力(MTT)值的測定

分別在培養(yǎng)0,2,4,6,8,10d時對細胞的MTT值進行測定,使用MTT試劑盒在酶標儀中進行測定.

1.3.5肝細胞的代謝功能

白蛋白、葡萄糖和尿素的代謝指標是肝細胞代謝活動的常規(guī)指標.以溴甲酚綠法、二乙酰一肟顯色法、葡萄糖氧化酶法用試劑盒在酶標儀中測定白蛋白、尿素和葡萄糖的含量.

1.3.6數據處理

2結果與分析

2.1三維支架

聚苯乙烯三維支架載體被截成200μm厚的薄片,做成了適合常規(guī)細胞培養(yǎng)板的形式[5-6],如圖1(a)所示.本實驗使用的是適配6孔板的三維支架,電鏡觀察下呈疏松多孔狀,成孔率在 90%以上[7-8],細胞可以黏附在空隙中進行生長分化,見圖1(b).這種特殊的結構設計為體外培養(yǎng)細胞創(chuàng)造了更類似體內的微環(huán)境,并且支架的化學成分和標準細胞培養(yǎng)板相同,可以建立二維與三維培養(yǎng)模式的直接比較.

2.2肝細胞的生長情況

掃描電鏡顯示肝細胞在二維和三維培養(yǎng)條件下有顯著不同的外觀.在二維培養(yǎng)條件下,細胞很快在表面拉伸生長,形成表面扁平的結構,如圖2(a)所示.在三維聚苯乙烯支架中,細胞快速增長,并在支架孔隙中擴展,7d后,由于三維環(huán)境可以使細胞與相鄰細胞交互孵化生長,因此細胞很快相互聚集成球體,如圖2(b)所示.結果表明,三維培養(yǎng)可以充分利用材料,使材料表面積最大化.相比二維表面細胞,在三維聚苯乙烯支架中培養(yǎng)的肝細胞,可以保持高水平的細胞生存能力,擁有立體的細胞形態(tài).

圖1　掃描電鏡下的Alvetex-3D結構

圖2　肝細胞在二維平面和三維支架上的生長情況

圖3是肝細胞在二維表面和三維聚苯乙烯支架上的生長狀態(tài),采用三維圖像重建.由文獻[9]可知,細胞在二維表面生長時,為適應平面的形態(tài),細胞需保持扁平狀態(tài),單個細胞的平均寬度是46.7μm(±9.2μm),高度是7.3μm(± 4.2μm);而當細胞在聚苯乙烯支架中生長,由于支架更接近體內生長環(huán)境,細胞的平均寬度是14.7μm(±4.1μm),高度是23.3μm(±8.1μm).細胞在二維表面生長時,受到空間的限制,只能在水平區(qū)域X,Y軸方向盡量伸展,因此二維生長寬度是三維的近3倍;同時,細胞盡可能壓縮豎直方向Z軸的生長,因此二維生長高度僅為三維的近1/3.在三維支架上,細胞生長更加立體,可以沿豎直方向Z軸生長.

2.3三維培養(yǎng)的大鼠肝細胞

使用倒置相差顯微鏡,觀察肝細胞接種入支架后的效果.顯微鏡可觀察到支架孔隙內充滿密集的細胞,因支架透光性差,在相差顯微鏡下不易觀察到細胞.如圖4所示,在細胞培養(yǎng)2d和8d后,對細胞進行拍照,圖中用箭頭指出了幾處黏附生長的細胞.可觀察到三維支架中的細胞多聚集生長,由于支架特殊的疏松結構,細胞生長空間大,幾乎無懸浮的死細胞.

圖3　肝細胞在二維平面和三維支架上生長狀態(tài)的三維構相

圖4　三維培養(yǎng)的大鼠肝細胞形態(tài)

2.4細胞增殖活力MTT值對比

分別在培養(yǎng)0,2,4,6,8,10d后,對三維與二維培養(yǎng)的原代大鼠肝細胞進行MTT值測定.

由圖5可知,二維培養(yǎng)條件下,細胞在前4d的MTT值每天不斷增加,4d后上升趨勢達到最高值,而后出現下降趨勢.三維培養(yǎng)條件下,細胞在前6d的MTT值每天均呈上升趨勢,且在培養(yǎng)4d后增加尤為顯著,從培養(yǎng)6d后MTT值開始平穩(wěn).肝細胞在二維表面和三維支架中生長,從MTT數據顯示的結果可知,三維支架中的細胞生存能力明顯強于二維平面.在二維平面上,由于細胞生長空間受到限制,一旦平面長滿,細胞就無法繼續(xù)生長;而在三維支架中,細胞生長不受限制,有較大的表面積供細胞增殖分化,并且可以和相鄰細胞共同黏附聚集生長,因此細胞增殖生長比較快.

2.5肝細胞的白蛋白分泌功能檢測

分泌白蛋白含量是肝細胞在肝臟中的重要功能代謝指標,由于蛋白質中的氨基酸在藥物聯合和輸送、維護膠體滲透壓和自由基的清除中都起到重要作用,因此,在體外培養(yǎng)中白蛋白分泌是常用的肝細胞功能指標[10-12].

圖5　三維與二維培養(yǎng)的大鼠肝細胞的MTT值比較

圖6給出了在二維平面和三維支架上白蛋白分泌隨時間變化的情況.由圖6可知,在前6d,二維培養(yǎng)的細胞分泌白蛋白含量不斷增加,在培養(yǎng)6d后達到最高值,而后出現明顯下降,說明肝細胞單層培養(yǎng)產生的細胞白蛋白分泌量較低.在三維支架培養(yǎng)的10d時間內,細胞分泌白蛋白含量均呈上升趨勢,與二維表面相比,細胞分泌白蛋白含量顯著提升,表明3D環(huán)境更有利于增強細胞的白蛋白功能.

圖6　三維與二維培養(yǎng)的大鼠肝細胞分泌白蛋白

2.6細胞尿素合成功能的檢測

圖7給出了在二維平面和三維支架上大鼠肝細胞的合成尿素含量.在前6d,Alvetex-3D與二維培養(yǎng)的細胞的合成尿素量每天均顯著增加,在培養(yǎng)6d后達到最高值,但每個階段三維培養(yǎng)均大大高于二維培養(yǎng)條件下的細胞合成尿素的含量.隨后,二維條件下的細胞合成尿素量呈下降趨勢,而Alvetex-3D培養(yǎng)的細胞的合成尿素量在培養(yǎng)8d后開始保持穩(wěn)定.

圖7　三維與二維培養(yǎng)的大鼠肝細胞合成尿素含量比較

2.7細胞消耗葡萄糖的檢測

圖8給出了在二維平面和三維支架上大鼠肝細胞的消耗葡萄糖量的對比.在前6d,二維培養(yǎng)的細胞消耗葡萄糖量每天緩慢增加,6d后達到最高值,而后開始下降;而三維支架培養(yǎng)的細胞在10d內消耗葡萄糖量每天均呈上升趨勢,尤其是培養(yǎng)8d后,葡萄糖量顯著高于二維培養(yǎng)組.

圖8　三維與二維培養(yǎng)的大鼠肝細胞消耗葡萄糖量比較

3討論

本文采用三維聚苯乙烯支架進行體外肝細胞的培養(yǎng),并與二維平面培養(yǎng)相比較.環(huán)境對細胞的影響可能來自細胞的變形,也可能來自細胞所處的生化環(huán)境的改變.細胞在二維培養(yǎng)時,受生長條件限制,細胞的形態(tài)發(fā)生變化,而細胞的變形引起細胞膜內外離子濃度的改變,最終影響細胞營養(yǎng)成分和代謝產物的交換.因此,當采用三維系統培養(yǎng)細胞時,由于三維培養(yǎng)環(huán)境接近體內環(huán)境,對細胞的形態(tài)、結構、生長和代謝有什么影響,以及與二維培養(yǎng)有什么不同,本研究就此展開討論.

當細胞黏附于環(huán)境表面開始生長時,具有改變其形態(tài)以獲得環(huán)境最小應變的能力.細胞黏附于二維平面基底上時,細胞自動形成扁平狀以達到最小能量狀態(tài).因此細胞骨架結構在某種程度上決定細胞的形態(tài),而其形態(tài)是控制細胞生長的重要因素,力學刺激以特定的方式分布于胞外基質中,只有通過結構成分骨架才能與細胞相互連接[13].二維結構培養(yǎng)細胞盡管具有梭形形態(tài)進行擴展,但這種培養(yǎng)方法由于受到細胞接觸抑制的影響,對細胞的增殖和分化有很大的影響[14-15].三維結構在決定細胞內外環(huán)境變化的反應中起著重要的作用,當細胞生長在三維基質支架中時,細胞的生長環(huán)境接近于人體內環(huán)境,因此細胞形態(tài)更接近于體內細胞形態(tài),而細胞形態(tài)和骨架結構與細胞代謝密切相關,越接近體內環(huán)境,細胞的生長形態(tài)越好,細胞的各項代謝功能也越好.本實驗已經證明,三維培養(yǎng)的細胞代謝功能好于二維培養(yǎng)的細胞.

總之,本實驗證明聚苯乙烯支架可以用于肝細胞的體外三維培養(yǎng),且該環(huán)境下細胞的代謝功能指標顯著高于二維培養(yǎng),這是由于細胞的三維系統培養(yǎng)方式更近似于體內的培養(yǎng)條件.因此,細胞的三維培養(yǎng)可以為研究者提供更準確的數據,這將有助于提高科研效率,使細胞及組織工程的研究更具發(fā)展前景.

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(編輯:董偉)

Experimental Study on Three-dimensional Cell Culture in a Polystyrene Film

YANG Bo,REN Jie,GONG Cui

(SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

Abstract：A three-dimensional polystyrene film was used to culture cell in vitro scaffolds,and the results were compared with those of the conventional two-dimensional liver cell culture.The proliferation and metabolism functions were analyzed,including the cell survival rate,albumin secretion,urea synthesis function and glucose consumption function.The results show that the three-dimensional cell proliferation activity is significantly higher than that of the two-dimensional and the gradually increased growth of the three-dimensional scaffold surface adhesion of liver cells and the formation of liver cell adhesion can be observed by biological microscope.The studies also show that the three-dimensional liver cells proliferation and metabolism functions are superior to the two-dimensional functions in the same conditions.The three-dimensional polystyrene film can be used as scaffolds of liver cell culture in vitro,and has good application prospect in the vitro cultivation system of biological artificial liver.

Keywords：polystyrene film; three-dimensional culture; two-dimensional culture; hepatocytes

文章編號：1007-6735(2016)03-0301-06

DOI：10.13255/j.cnki.jusst.2016.03.015

收稿日期：2015-06-01

中圖分類號：Q 813

文獻標志碼：A

第一作者： 楊波(1968-),女,副教授.研究方向:低溫生物醫(yī)學.E-mail:yangbo6899@126.com