GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53聯(lián)合測(cè)定在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及應(yīng)用研究*

鐘緯經(jīng)詹雪乳陳廣峰

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GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53聯(lián)合測(cè)定在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及應(yīng)用研究*

鐘緯經(jīng)①詹雪乳①陳廣峰①

【摘要】目的：探討結(jié)直腸癌組織中正谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-π（GST-π）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（TopoⅡ）、P-糖蛋白（P-gp）、Ki-67抗原（Ki-67）及P53基因（P53）的表達(dá)及臨床意義。方法：選取2014年1月-2015年6月本院收治的術(shù)前未做化療的24例結(jié)直腸癌患者作為研究對(duì)象，根據(jù)預(yù)后情況將其分為預(yù)后生存＜1年組8例和預(yù)后生存＞1年組16例，分析GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，比較兩組患者GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達(dá)陽(yáng)性率。結(jié)果：24例結(jié)直腸癌患者，GST-π表達(dá)陽(yáng)性9例（低度表達(dá)7例，中度表達(dá)2例），TopoⅡ表達(dá)陽(yáng)性23例（低度表達(dá)15例，中度表達(dá)8例），P-gp表達(dá)陽(yáng)性23例（低度表達(dá)8例，中度表達(dá)15例），Ki-67表達(dá)陽(yáng)性24例（低度表達(dá)3例，中度表達(dá)11例，高度表達(dá)10例），P53表達(dá)陽(yáng)性10例（低度表達(dá)3例，中度表達(dá)3例，高度表達(dá)4例）。預(yù)后生存＞1年組GST-π、P53的表達(dá)陽(yáng)性率均為12.5%，顯著低于預(yù)后生存＜1年組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在TopoⅡ、P-gp、Ki-67方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：聯(lián)合檢測(cè)GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達(dá)有助于結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)及評(píng)估患者預(yù)后，值得臨床推廣。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸癌； 生物標(biāo)志物； 表達(dá)； 聯(lián)合檢測(cè)； 預(yù)后

①?gòu)V東省肇慶市中醫(yī)院 廣東 肇慶 526020

First-author’s address：Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhaoqing City，Zhaoqing 526020，China

結(jié)直腸癌是消化道系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著腫瘤生物標(biāo)記物研究的深入，大量研究證實(shí)，正谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-π（GST-π）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（TopoⅡ）、P-糖蛋白（P-gp）、Ki-67抗原（Ki-67）、P53基因（P53）在結(jié)直腸癌患者的表達(dá)與健康體檢者存有差異，為結(jié)直腸癌的早期診斷、早期治療提供了依據(jù)［1-3］。但是，流行病學(xué)調(diào)查顯示，雖然其早期診斷準(zhǔn)確率提高，但是結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年生存率較低，而隨著對(duì)腫瘤標(biāo)記物認(rèn)識(shí)的加深，發(fā)現(xiàn)GST-π、TopoⅡ等可能與結(jié)腸癌的形成、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［4］。本研究選取2014年1月-2015年6月本院收治的24例結(jié)直腸癌患者作為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)其結(jié)直腸癌組織的GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，旨在為結(jié)直腸癌臨床診斷、治療及預(yù)后判斷提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月-2015年6月本院收治的術(shù)前未做化療的結(jié)直腸癌患者24例作為研究對(duì)象，所有患者均有完整的隨訪資料，經(jīng)病理證實(shí)均為腺癌，排除結(jié)直腸癌家族史、其他組織或器官的惡性腫瘤、嚴(yán)重精神疾病或依從性較差者。其中男13例，女11例；年齡42～84歲，平均（63.41±7.69）歲；腫瘤直徑1.2～8.5 cm，平均（4.76±1.08） cm；其中結(jié)腸癌12例，直腸癌12例；病理類型：黏液腺癌1例，息肉狀管狀、乳頭狀腺癌1例，管狀、絨毛狀腺瘤伴黏膜內(nèi)癌1例，管狀、絨毛狀腺瘤局部黏膜重度不典型增生（黏膜內(nèi)癌變）1例，乳頭狀腺癌1例，小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例，中低分化2例，中分化15例，高分化1例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，未轉(zhuǎn)移9例。根據(jù)預(yù)后將其分為兩組，預(yù)后生存＞1年組16例中，男9例，女7例；年齡42～80歲，平均（62.5±8.07）歲；預(yù)后生存＜1年組8例中，男4例，女4例，年齡47～84歲，平均（64.3±7.48）歲。兩組患者性別、年齡等方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與材料 鼠抗人單克隆抗體GST-π（克隆號(hào)LW29）、TopoⅡ（克隆號(hào)3F6）、P-gp（克隆號(hào)C494）、Ki-67（克隆號(hào)MIB-1）、P53（克隆號(hào)DO-7）及即用型免疫組化MaxVisionTM檢測(cè)試劑盒、3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均購(gòu)自于福州邁新公司。石蠟組織切片機(jī)（LICA2245型）。

1.3 方法 制作結(jié)直腸癌組織石蠟切片9張，其中1張用于常規(guī)HE染色，其余8張用于免疫組化及備用。應(yīng)用免疫組化檢測(cè)GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達(dá)，各項(xiàng)操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，批內(nèi)變異＜6.0%。一般流程：（1）切片室溫脫蠟2次，以不同濃度酒精梯度脫苯、水化各3 min，以自來(lái)水沖洗3 min，PBS浸泡2次；（2）切片置入3%過(guò)氧化氫溶液，孵育15 min，PBS浸泡2次；（3）加入一抗，置入4 ℃冰箱過(guò)夜；（4）PBS浸泡2次；（5）加入二抗，室溫下孵育10～15 min；（5）PBS浸泡2次；（6）滴入DAB顯色液，顯色4～10 min后以自來(lái)水水洗；（7）經(jīng)復(fù)染、鹽酸酒精分化、返藍(lán)后封片并判斷結(jié)果。結(jié)果選擇10個(gè)高倍鏡視野計(jì)算陽(yáng)性比例，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：陰性指無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞染色；弱陽(yáng)性指陽(yáng)性細(xì)胞1%～25%；陽(yáng)性指陽(yáng)性細(xì)胞26%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性指陽(yáng)性細(xì)胞＞50%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 X2檢驗(yàn)，多組多分類資料采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 24例患者中，GST-π表達(dá)陰性15例，陽(yáng)性9例（低度表達(dá)7例，中度表達(dá)2例）；TopoⅡ表達(dá)陰性1例，陽(yáng)性23例（低度表達(dá)15例，中度表達(dá)8例）；P-gp表達(dá)陰性1例，陽(yáng)性23例（低度表達(dá)8例，中度表達(dá)15例）；Ki-67表達(dá)陰性0例，陽(yáng)性24例（低度表達(dá)3例，中度表達(dá)11例，高度表達(dá)10例）；P53表達(dá)陰性14例，陽(yáng)性10例（低度表達(dá)3例，中度表達(dá)3例，高度表達(dá)4例）。GST-π表達(dá)與分化程度有關(guān)（P＜0.05），TopoⅡ表達(dá)與發(fā)病部位有關(guān)（P＜0.05），P-gp表達(dá)與性別有關(guān)（P＜0.05），Ki-67表達(dá)與與腫瘤大小有關(guān)（P＜0.05），P53表達(dá)與發(fā)病部位有關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表1。GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖1。2.2 兩組不同指標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性率比較 預(yù)后生存＞1年組結(jié)直腸癌患者GST-π、P53的表達(dá)陽(yáng)性率均為12.5%，明顯低于預(yù)后生存＜1年組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而兩組TopoⅡ、P-gp、Ki-67方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67和P53的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 例

圖1 GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

表2 兩組不同指標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性率比較 例（%）

3 討論

結(jié)直腸癌是惡性程度高的消化道腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，其在我國(guó)人群中的發(fā)病率高達(dá)（20～30）/萬(wàn)人次，嚴(yán)重威脅著患者生命安全。隨著結(jié)直腸的基礎(chǔ)和臨床研究的進(jìn)步，提高了結(jié)直腸癌的早期診斷準(zhǔn)確度，但是由于腫瘤細(xì)胞耐藥性導(dǎo)致結(jié)直腸癌的化療療效并不理想［5-7］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，從癌基因、抑癌基因及腫瘤耐藥基因研究癌癥的發(fā)病原因、發(fā)病機(jī)制、治療措施選擇及影響預(yù)后的因素等成為臨床關(guān)注的熱點(diǎn)［8-11］。

GST-π是GST五個(gè)亞形中與腫瘤關(guān)系最密切的，其具有谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)親電子物質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，能夠催化谷胱甘肽與化學(xué)藥物、親電性化合物結(jié)合降低化療藥物細(xì)胞毒性，且能夠與親電性藥物結(jié)合促進(jìn)藥物外排，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物，如阿霉素、順鉑等產(chǎn)生耐藥性［12］。TopoⅡ作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，能夠調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，其高表達(dá)使腫瘤復(fù)制加快，增加腫瘤的惡性程度，同時(shí)其還是胺丫啶、蒽環(huán)類和鬼臼毒素等藥物的靶蛋白，活性降低會(huì)使抗癌藥的靶點(diǎn)減少或喪失，與多藥耐藥性密切相關(guān)［13］。P-gp由多藥耐藥基因1編碼產(chǎn)生，其作為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的一員，通過(guò)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵模式、疏水性真空清除泵模式將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，其表達(dá)程度與耐藥程度成正比［14-15］。此外，P53基因被認(rèn)為是與人類腫瘤相關(guān)性最高、突變最頻發(fā)的一種基因，其突變型作為致癌基因會(huì)促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、增殖，而Ki-67蛋白被認(rèn)為是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的最佳指標(biāo)，其表達(dá)可診斷和預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)治療的敏感度及其結(jié)局。

本研究24例結(jié)直腸癌患者中，GST-π表達(dá)陰性15例，陽(yáng)性9例，TopoⅡ表達(dá)陰性1例，陽(yáng)性23例，P-gp表達(dá)陰性1例，陽(yáng)性23例，Ki-67表達(dá)陰性0例，陽(yáng)性24例，P53表達(dá)陰性14例，陽(yáng)性10例，與文獻(xiàn)［6］報(bào)道相一致。對(duì)GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示GST-π表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)，TopoⅡ表達(dá)與年齡、發(fā)病部位有關(guān)，P-gp表達(dá)與年齡、性別有關(guān)，Ki-67與腫瘤大小有關(guān)，P53與發(fā)病部位有關(guān)。因此，聯(lián)合檢測(cè)GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53可以有效評(píng)估結(jié)直腸癌自然病程、惡性程度等。預(yù)后生存＞1年組結(jié)直腸癌患者GST-π、P53的表達(dá)陽(yáng)性率均為12.5%，明顯低于預(yù)后生存＜1年組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示各腫瘤標(biāo)志物介導(dǎo)的耐藥譜或者敏感譜不同，因此聯(lián)合檢測(cè)其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)有助于判斷耐藥情況與預(yù)后。但兩組TopoⅡ、P-gp、Ki-67比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？紤]是由于樣本量較少，患者個(gè)體差異較大，本研究?jī)H為初步探索，需要更大樣本量的研究來(lái)得出一個(gè)更為穩(wěn)定和確切的結(jié)論。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達(dá)有助于結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)和評(píng)估患者預(yù)后。

參考文獻(xiàn)

［1］ Li Y，Hu P，Cao Y，et al.Predicting the outcome of platinumbased chemothcrapies in epithelial ovarian cancer using the 8092C/A polymorphism of ERCC1：a meta-analysis［J］.Biomarkers，2014，19（2）：128-134.

［2］李正賢，任偉耀，陳德明.85例結(jié)腸癌臨床外科治療近期療效分［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22（18）：2000-2002.

［3］ Karachaliou N，Papadaki C，Lagoudaki E，et al.Predictive value of BRCA1，ERCC1，ATP7B，PKM2，TOPOI，TOPO ⅡA，TOPOⅡB and C-MYC genes in patients with small cell lung cancer（SCLC）who received first line therapy with cisplatin and etoposide［J］.PLoS One，2013，8（9）：e74611.

［4］陳瓊，劉志平，程蘭平，等.2003～2007年中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病與死亡分析［J］.中國(guó)腫瘤，2012，21（3）：179-182.

［5］姜慧員，梁小波，侯生槐，等.結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶首次切除和復(fù)發(fā)后第二次切除對(duì)比的Meta分析［J］.中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)（電子版），2011，5（2）：50-53.

［6］陳文海，田 逸，師彥敏，等.中西醫(yī)結(jié)合治療晚期結(jié)腸癌療效觀察［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，23（11）：1172-1174.

［7］張波平.142例結(jié)腸癌術(shù)后遠(yuǎn)期療效觀察［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（8）：187-188.

［8］ Healey E，Sfillfried G E，Eckermann S，et al.Comparative effectiveness of 5-fluorouracil with and without oxaliplatin in the treatment of colorectal cancer in clinical practice［J］.Anticancer Res，2013，33（3）：1053-1060.

［9］吳久鴻，史寧，李冠群，等.腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中TGF-β作用機(jī)制及其活化酶抑制劑研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46（9）：1461-1465.

［10］何濤.結(jié)腸癌患者根治術(shù)前后血清TSGF、CEA及AFP的變化與意義［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（7）：30-31.

［11］李金淼，周桂臺(tái).P53蛋白表達(dá)在直腸腫瘤中病理意義［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥雜志，2012，19（20）：118-119.

［12］夏國(guó)盛，王亞?wèn)|，張文靜，等.結(jié)腸癌細(xì)胞中TS、TP、GST-1T、PgP、MRPl表達(dá)對(duì)奧沙利鉑化療敏感性的預(yù)測(cè)價(jià)值［J］.現(xiàn)代消化及介入診療，2010，15（3）：147-150.

［13］王欣，傅仲學(xué).CD44V6、P-gp、Top-Ⅱ在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系及其臨床意義［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36（2）：163-167.

［14］黃炳臣，覃忠衛(wèi)，羅春英，等.大腸腺癌中拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα 和Ki67的表達(dá)及意義［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（10）：1637-1639.

［15］師衛(wèi)華，馬微春，金曉菲.p-糖蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及與患者預(yù)后的相關(guān)性分析［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（12）：1302-1304.

Expression and Application of GST-π，TopoⅡ，P-gp，Ki-67 and P53 Joint Determination in Colorectal Cancer

ZHONG Wei-jing，ZHAN Xue-ru，CHEN Guang-feng.//Medical Innovation of China，2016，13（12）：001-004

【Abstract】Objective：To investigate the expression and its clinical significance of GST-π，TopoⅡ，P-gp，Ki-67and P53 in colorectal cancer tissue.Method：A total of 24 cases of colorectal cancer who had not been treated before surgery in our hospital from January 2014 to June 2015 were selected as the research objects，they were divided into the prognosis survival less than 1 year group with 8 cases and the prognosis survival more than 1 year group with 16 cases according to the prognosis，the relationship between GST-π，TopoⅡ，P-gp，P53，Ki-67 expression and clinical pathological features were analyzed and the positive expression rate of GST-π，TopoⅡ，P-gp，P53，Ki-67 were compared.Result：For 24 cases of colorectal cancer，GST-πexpression was positive in 9 cases （low expression in 7 cases，moderate expression in 2 cases），TopoⅡ expression was positive in 23 cases （low expression in 15 cases，moderate in 8 cases），P-gp expression was positive in 23 cases （low expression in 8 cases， moderate in 15 cases），Ki-67 expression was positive in 24 cases （low expression in 3 cases，moderate in 11 cases，highly expressed in 10 cases），P53 expression was positive in 10 cases （low expression in 3 cases，moderate in 3 cases，highly expressed in 4 cases）.The prognosis survival more than 1 year group of GST-π and P53 expression positive rate was all 12.5%，significantly lower than that of the prognosis survival less than 1 years group，the differences were statistically significant（P＜0.05），and there were no significant differences in TopoⅡ，P-gp and Ki-67（P＞0.05）.Conclusion：Combined detection of GST-π，P-gp，TopoⅡ，Ki-67 and P53 contribute to colorectal cancer early diagnosis and evaluate the prognosis of patients，it is worthy of clinical promotion.

【Key words】Colorectal cancer； Biomarker； Expression； Combined detection； Prognosis

*基金項(xiàng)目：肇慶市科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2014E289）

通信作者：鐘緯經(jīng)

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.12.001

收稿日期：（2015-12-01） （本文編輯：李穎）