骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)慢性胰腺炎大鼠模型胰腺纖維化的影響

景文莉，張向群

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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)慢性胰腺炎大鼠模型胰腺纖維化的影響

景文莉1，張向群2

目的觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植對(duì)慢性胰腺炎大鼠模型胰腺纖維化的影響，并探討其作用機(jī)制。方法將30只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和移植組，每組10只。模型組采用膽胰管逆行注射油酸法制備大鼠慢性胰腺炎模型，對(duì)照組以同樣方式僅注射相同體積生理鹽水，移植組在造模后1周和5周經(jīng)尾靜脈注射BMSCs。分別于造模后第1、4和8周稱量3組大鼠體質(zhì)量，于第8周后剖殺動(dòng)物，取胰腺組織行HE染色和飽和苦味酸-天狼猩紅染色觀察胰腺組織病理學(xué)改變并評(píng)分，采用ELISA法檢測(cè)胰腺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量。結(jié)果造模后第4周，模型組和移植組大鼠體質(zhì)量均低于對(duì)照組（P＜0.05），模型組與移植組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；至第8周，模型組和移植組大鼠體質(zhì)量仍低于對(duì)照組，而移植組高于模型組（P＜0.05）。模型組大鼠胰腺組織纖維化評(píng)分升高、TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量均高于對(duì)照組和移植組（P＜0.05）；移植組胰腺組織纖維化評(píng)分高于對(duì)照組，TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論BMSCs移植能減少慢性胰腺炎大鼠膠原分泌，降低胰腺纖維化程度，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1分泌有關(guān)。

胰腺炎，慢性；纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；膠原Ⅰ型；膠原Ⅲ型；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

慢性胰腺炎的最主要病理特征是胰腺實(shí)質(zhì)纖維化，這種纖維化是不可逆的，呈進(jìn)行性發(fā)展，最終導(dǎo)致胰腺功能受損。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β1在胰腺膠原生成、分泌和沉積在細(xì)胞外的過程中起關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是促進(jìn)胰腺纖維化發(fā)生和發(fā)展的主要細(xì)胞因子［1］。胰腺纖維化的治療一直是消化內(nèi)科、消化外科醫(yī)生努力攻克的難題，但目前仍無有效藥物投入臨床。董育瑋等［2］采用精氨酸腹腔注射法制備實(shí)驗(yàn)性慢性胰腺炎大鼠模型，對(duì)制模后不同時(shí)點(diǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的數(shù)目和增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BMSCs經(jīng)歷了先增加后減少的過程。BMSCs數(shù)目的減少和增殖能力的下降阻礙了胰腺損傷的修復(fù)，同時(shí)也提示具有多向分化潛能的BMSCs移植可能有助于損傷胰腺組織的修復(fù)。另有研究顯示，BMSCs移植能修復(fù)大鼠慢性胰腺損傷，其機(jī)制可能與減少細(xì)胞因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)［3］。本研究采用膽胰管逆行注射油酸法制備大鼠慢性胰腺炎模型，探討B(tài)MSCs移植對(duì)慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化的影響及其作用機(jī)制，以期為BMSCs治療慢性胰腺炎提供參考。

1材料與方法

1.1材料（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠10只，體質(zhì)量120～140 g，平均（129.3±5.4）g，用于制備BMSCs；SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～220 g，平均（204.6±9.1）g，用于制備慢性胰腺炎模型，均由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心（北京）提供。（2）主要試劑與儀器。油酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；飽和苦味酸-天狼猩紅染色液購(gòu)自羅基（北京）生物技術(shù)有限公司；TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Uscnlife公司。MultiSkan FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，超速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckmann公司，TG150型二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自法國(guó)Jouan公司，XL100流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)COULTER公司。

1.2方法

1.2.1大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定用斷頸法急性處死大鼠并消毒，無菌條件下取股骨及脛骨。用BMSCs標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，沖出細(xì)胞懸液離心，棄上清液，小心疊加到密度為1.077 g/mL的Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液上層，取單個(gè)核細(xì)胞層，以1×106個(gè)/cm2密度接種到75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。隔日全量換液。待原代細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底的80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶液和0.02%EDTA液消化細(xì)胞，離心后重新加入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，以1：1比例傳代細(xì)胞。用倒置相差顯微鏡觀察BMSCs的形態(tài)學(xué)變化，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)第2代細(xì)胞表面CD90、CD34、CD31的表達(dá)情況鑒定BMSCs［4-6］。取第2代BMSCs用于慢性胰腺炎大鼠靜脈注射。

1.2.2大鼠慢性胰腺炎模型制備和處理采用隨機(jī)數(shù)字表將30只體質(zhì)量為200～220 g的大鼠分為對(duì)照組、模型組和移植組，每組10只。模型組參照Kataoka等［7］方法，采用膽胰管逆行注射油酸法制備大鼠慢性胰腺炎模型。大鼠禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，備皮，鋪消毒巾，腹正中切口進(jìn)入腹腔。用無損傷小血管夾夾閉胰膽管近肝端暫時(shí)阻斷膽汁流出，沿幽門找到十二指腸，將其提至切口外，在十二指腸開口的胰膽管處，取5號(hào)針頭穿刺胰膽管開口對(duì)側(cè)緣十二指腸壁后，用靜脈留置針導(dǎo)管逆行插入膽胰管內(nèi)1.0 cm，通過勻速微量注射器注入油酸60 μL，在5 min內(nèi)注射完畢。以無損傷縫線縫合十二指腸壁穿刺點(diǎn)，關(guān)腹。對(duì)照組以同樣方式僅注射相同體積生理鹽水。移植組在造模后1周和5周經(jīng)尾靜脈注射含2×106個(gè)BMSCs的生理鹽水細(xì)胞懸液。分別于造模后第1、4和8周測(cè)量大鼠體質(zhì)量，于第8周后剖殺取胰腺，一半行HE染色和飽和苦味酸-天狼猩紅染色觀察胰腺組織病理學(xué)改變并評(píng)分，另一半置于-80℃保存用于檢測(cè)TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量。

1.2.3飽和苦味酸-天狼猩紅染色大鼠胰腺組織用4%甲醛固定，石蠟包埋，4～6μm連續(xù)切片，苦味酸天狼猩紅液浸染1 h，自來水洗，蘇木素復(fù)染核、封片，顯微鏡下觀察胰腺纖維化程度。每個(gè)切片隨機(jī)讀取10個(gè)視野，根據(jù)纖維化在整個(gè)視野所占的比例進(jìn)行胰腺纖維化評(píng)分：0=0%，1=1%～25%，2=26%～50%，3=51%～100%［8］。

1.2.4 TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量測(cè)定取凍存胰腺組織100 mg，加入裂解液1 mL，勻漿，按總蛋白提取試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）說明書提取組織總蛋白。采用ELISA法檢測(cè)TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況模型組大鼠造模后第2天出現(xiàn)豎毛、倦臥少動(dòng)、進(jìn)食減少，第3周開始出現(xiàn)消瘦、稀便，部分大鼠腹部可觸及腫塊。移植組大鼠一般情況、癥狀和體征較模型組減輕，對(duì)照組未見異常。造模后第1周3組大鼠體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）；造模后第4周，模型組和移植組大鼠體質(zhì)量均低于對(duì)照組（P＜0.05），模型組與移植組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；至第8周，模型組和移植組大鼠體質(zhì)量仍低于對(duì)照組，而移植組高于模型組（P＜0.05），見表1。

2.2胰腺病理學(xué)改變普通光學(xué)顯微鏡下Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維均呈紅色。對(duì)照組胰腺小葉輪廓清晰，腺泡細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊；模型組可見Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維交織成網(wǎng)絡(luò)，呈彌漫性增生，小葉結(jié)構(gòu)被破壞，腺泡萎縮變形；移植組胰腺小葉纖維組織增生和腺泡結(jié)構(gòu)破壞程度較模型組減輕，見圖1。對(duì)照組、移植組、模型組胰腺纖維化評(píng)分（分別為0.312±0.106、1.264±0.331、2.741±0.496）依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67.45，n=10，P＜0.05）。

Tab. 1 Comparison of body weights between three groups of rats表1　3組大鼠體質(zhì)量比較?。╣，x ±s）

Fig.1 Comparison of pancreatic fibrosis between three groups of rats （Saturated picric acid-Sirius red staining，×200）圖1　3組大鼠胰腺組織纖維化比較（飽和苦味酸-天狼猩紅染色，×200）

2.3 TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量模型組大鼠胰腺組織TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量均高于對(duì)照組和移植組（均P＜0.05）；移植組與對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab. 2 Comparison of the contents of TGF-β1，typeⅠcollagen and typeⅢcollagen between three groups of rats表2　3組大鼠胰腺組織TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原含量比較?。▁ ±s）

3　討論

慢性胰腺炎是指由于各種原因引起胰腺組織和功能的持續(xù)性損害，其病理特征為胰腺纖維化。油酸是一種酸性不飽和脂肪酸，具去污劑特性，能作用于細(xì)胞膜使細(xì)胞迅速溶解。本研究采用膽胰管逆行注射油酸復(fù)制大鼠慢性胰腺炎模型，使油酸直接損傷胰腺腺泡，引起胰腺組織壞死與炎癥，模擬胰腺損傷、修復(fù)與纖維化過程。既往研究證實(shí)這是一種適合研究慢性胰腺炎病理生理過程和藥物干預(yù)的動(dòng)物模型［3，7］。本研究中在膽胰管逆行注射油酸后8周可見腺泡細(xì)胞退化萎縮，小葉及導(dǎo)管周圍廣泛纖維化等典型胰腺慢性炎癥表現(xiàn)。

目前慢性胰腺炎的治療以減輕腹痛、解除梗阻、幫助消化等對(duì)癥治療為主，對(duì)阻止胰腺纖維化進(jìn)展尚無有效方法。近年，有學(xué)者初步探討了BMSCs對(duì)胰腺損傷修復(fù)的治療作用。Jung等［9］在體外培養(yǎng)并用核染料標(biāo)記大鼠BMSCs，然后回輸?shù)秸４笫蠛图毙砸认傺椎墓撬枨恢校Y(jié)果顯示，在造模后2周，標(biāo)記的BMSCs出現(xiàn)在正常胰腺組織和損傷胰腺組織中，而且在損傷胰腺組織中BMSCs的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于正常胰腺組織，提示BMSCs可參與胰腺的生理更新和病理再生，尤其是在胰腺損傷時(shí)，BMSCs能定植于胰腺并定向轉(zhuǎn)化成胰腺細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，在造模后第8周，移植組大鼠胰腺組織纖維化評(píng)分較模型組降低，提示移植的BMSCs有助于修復(fù)胰腺損傷，減輕纖維化。另外，模型組和移植組大鼠在造模后第4、8周體質(zhì)量較對(duì)照組減輕，而移植組在造模后第8周體質(zhì)量較模型組增加，提示BMSCs移植在減輕胰腺纖維化的同時(shí)還能改善大鼠胰腺外分泌功能，增加體質(zhì)量。

細(xì)胞外基質(zhì)沉積是導(dǎo)致慢性胰腺實(shí)質(zhì)纖維化的重要原因。Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分，胰腺組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量增加有助于胰腺纖維化形成［10］。TGF-β1是目前已知的與胰腺纖維化形成關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子，其可作用于多個(gè)環(huán)節(jié)，刺激胰腺星狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞合成和分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積［11］。本研究結(jié)果顯示，在造模后第8周，BMSCs移植組大鼠胰腺組織TGF-β1、Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量較模型組降低，與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示BMSCs移植可減輕慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化程度，且這一作用可能與其減少TGF-β1分泌有關(guān)。

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（2015-07-07收稿2016-01-15修回）

（本文編輯陳麗潔）

The effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on pancreatic fibrosis in rats with chronic pancreatitis

JING Wenli1，ZHANG Xiangqun2
1 Tianjin Medical College，Tianjin 300222，China；2 General Hospital of Tianjin Medical University Corresponding Author E-mail：zhangxiangqun-1@163.com

Objective To investigate the effects and mechanisms of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）on pancreatic fibrosis in rats of chronic pancreatitis. Methods Thirty healthy male SD rats were randomly divided into three groups：control group，model group and transplanted group（n=10 for each group）. Chronic pancratitis rat model was induced by retrograde injection of oleic acid into the biliopancreatic duct. The sham operation group was treated only with solvent. Transplanted group was given BMSCs through caudal vein injection at 1 week and 5 weeks after the model induction. All rats were weighed at 1 week，4 weeks and 8 weeks in three groups. After 8-week feeding，pancreatic tissues were harvested for HE and picric-sirius staining. The contents of transforming growth factor β1（TGF-β1），typeⅠcollagen and typeⅢcollagen were detcted by using ELISA. Results Compared with the control group，the weights of rats were decreased at 4 weeks and 8 weeks in model group and transplantated group（P＜0.05）. There were no significant differences in body weights between model group and transplantated group（P＞0.05）. The pancreatic fibrosis score and pathological injury were ameliorated signicantly in transplanted group. The contents of TGF-β1，typeⅠcollagen and typeⅢcollagen in pancreas were increased in model group than those of control group and transplanted group（P＜0.05）. Conclusion BMSCs transplantation can reduce the collagen secretion and reduce the degree of pancreatic fibrosis in rats with chronic pancreatitis，which may be related to the inhibition of the release of TGF-β1.

pancreatitis，chronic；fibrosis；transforming growth factor beta1；collagen typeⅠ；collagen typeⅢ；bone marrow mesenchymal stem cells

R576

A

10.11958/20150006

1天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校（郵編300222）；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院

景文莉（1975），女，副教授，碩士學(xué)位，主要從事微循環(huán)、干細(xì)胞移植等方面的研究通訊作者E-mail：zhangxiangqun-1@163.com