促排卵藥雷洛昔芬對小鼠著床窗期子宮內(nèi)膜COX-2 和LPAR3表達的影響

冼英杰　陳彩蓉　周秀琴　顏秋霞　梁小青　趙曉英

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促排卵藥雷洛昔芬對小鼠著床窗期子宮內(nèi)膜COX-2 和LPAR3表達的影響

冼英杰★陳彩蓉周秀琴顏秋霞梁小青趙曉英

［摘要］目的通過分析新促排卵藥雷洛昔芬（raloxifene，RAL）對著床窗期小鼠子宮內(nèi)膜容受性標志物環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）和溶血磷脂酸受體 3（lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3）表達的影響，探討雷洛昔芬是否損害小鼠子宮內(nèi)膜容受性。方法雌性昆明系小鼠60只，隨機分為RAL用藥促排卵組和自然受孕對照組。在雌鼠妊娠第4.5 d，采用免疫組化法檢測COX-2和LPAR3在2組雌鼠子宮內(nèi)膜中的表達。結(jié)果COX-2、LPAR3 2個因子在RAL用藥組和自然受孕對照組小鼠中的表達均無顯著性差異，P＞0.05。結(jié)論通過RAL用藥來進行促排卵，對著床期小鼠子宮內(nèi)膜COX-2和LPAR3表達水平的影響不明顯，對子宮內(nèi)膜容受性未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生不良損傷。

［關(guān)鍵詞］雷洛昔芬；環(huán)氧合酶2；溶血磷脂酸受體3；表達

★通訊作者：冼英杰，Email：xian2379180@126.com

伴隨著社會、生活和環(huán)境的變化，不孕不育已成為困擾部分人群的煩惱問題。近年來，體外受精-胚胎移植技術(shù)（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）得到快速發(fā)展與臨床應(yīng)用［1］。它是指分別將卵子與精子從人體內(nèi)取出進行體外受精，形成胚胎后再移植回母體子宮，讓其繼續(xù)發(fā)育至出生的一種輔助生殖技術(shù)。而成功實施該項技術(shù)有2個關(guān)鍵，一是通過控制性促排卵得到高質(zhì)量的卵子，通過體外受精形成優(yōu)質(zhì)胚胎；另一關(guān)鍵是子宮內(nèi)膜擁有良好的容受性，使胚胎能夠成功植入，獲得臨床妊娠［2］。目前如克羅米芬（clomiphene citrate，CC）等常用的促排卵藥，在臨床上取得了很好的促排卵效果，但也均被發(fā)現(xiàn)會出現(xiàn)一些副作用，如影響子宮的容受性及精卵的種植效果等，導致低妊娠率［3-4］。

雷洛昔芬（raloxifene，RAL）為第2代選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（selective estrogen receptor modulator，SERM），已獲得了美國食品與藥品管理局的許可，成為治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥和浸潤性乳腺癌的新藥［5］。日前，RAL被發(fā)現(xiàn)具有與傳統(tǒng)藥物克羅米芬具有相似的促排卵功效，但該藥的促排卵應(yīng)用在在國內(nèi)外尚處于初步探索階段，它對子宮內(nèi)膜容受性的影響在國際上尚無定論［6］。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜分子標志物如環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）和溶血磷脂酸受體3（lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3）的表達水平能很好地反映子宮內(nèi)膜的容受性狀況［7-8］。本研究擬通過檢測RAL用藥對受孕小鼠著床窗期子宮內(nèi)膜因子COX-2和LPAR3表達的變化，來探討RAL對子宮內(nèi)膜容受性的影響，從而為RAL在臨床促排卵治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究對象

選取由廣東省實驗動物中心提供的6周齡、體重20～24 g、未曾受孕的昆明系白小鼠90只（其中雌鼠60只、雄鼠30只），隨機將雌鼠分成RAL給藥促排卵組和自然周期正常對照組，每組30只雌鼠。讓小鼠在環(huán)境溫度25±5℃、相對濕度60%～80%、控光（每天于8：00～20：00間光照12 h）條件下，自由攝食和飲水。

1.2材料與方法

1.2.1動物給藥方法

每天上午8：30～9：00在雌鼠的第3個動情周期前期，對其進行灌胃。對于給藥組的小鼠，用l mL含0.97 mg/mL RAL（購自禮來蘇州制藥有限公司，規(guī)格為60 mg×7片裝/盒）的生理鹽水溶液灌胃，每天給一次，連續(xù)2天。對于正常對照組的小鼠，用l mL不含藥物的生理鹽水灌胃。

1.2.2子宮內(nèi)膜標本獲取

2天（即2次用藥）后的下午17：00，分別往每只雌鼠腹腔注射5單位的人絨膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）來誘發(fā)排卵，按雌雄1∶1合籠。次晨7：00發(fā)現(xiàn)陰道栓者即定為妊娠第l d，計為Dl；在D4.5時，采用脫臼法處死各組雌鼠，分離子宮。子宮內(nèi)膜用10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，制成蠟塊切片。

1.2.3免疫組化檢測

用免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜組織中LPAR3和C0X-2蛋白表達水平。石蠟塊切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫處理10 min，蒸餾水洗滌3次；熱修復抗原，PBS洗滌2次。室溫封閉30 min后，分別加入兔抗COX-2抗體（ab52237，購于Abcam公司）、兔抗LPAR3抗體（ab75732，購于Abcam公司），4℃孵育過夜，PBS洗滌3次；加入相應(yīng)的二抗，37℃30 min，PBS液沖洗3次；然后用DAB顯色，充分水洗；蘇木素復染后，脫水，透明，封片。組織切片染色情況由2位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進行評判。每例切片均選擇10個高倍視野，腺上皮細胞中呈棕黃色顆粒為陽性表達；根據(jù)細胞的染色強度，把全部切片的染色結(jié)果評定為-（淺藍色）、+（淺黃色）、++（棕黃色）、+++（棕褐色），如圖1。

1.3統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。兩組間計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以雙側(cè)α= 0.05為檢驗水準。

2　結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，COX-2與LPAR3均主要分布于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的胞漿中；而且，在著床窗期，RAL用藥組與正常對照組雌鼠子宮內(nèi)膜腺上皮的COX-2表達水平?jīng)]有顯著的差異（P＞0.05）；兩組雌鼠子宮內(nèi)膜腺上皮LPAR3的表達水平也差別不明顯（P＞0.05），見圖1與表1。

3　討論

在過去的50多年中，CC一直是促排卵治療的一線藥物。它是一種SERM，具有弱的雌激素作用，通過阻斷下丘腦和垂體上的雌激素受體部位的負反饋抑制而刺激垂體促性腺激素的分泌，從而誘導卵泡的發(fā)育和排卵；但另一方面，CC也會對子宮和宮頸產(chǎn)生抗雌激素的副作用，進而導致子宮內(nèi)膜過薄及宮頸粘液粘稠，對子宮內(nèi)膜容受性具有抑制作用，導致其高排卵率和低妊娠率［9-10］。

RAL屬于第2代SERM，已被用于治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥，并可降低浸潤性乳腺癌的發(fā)病風險［11］。已有研究表明，RAL也通過競爭性結(jié)合下丘腦雌激素受體，抑制雌激素對下丘腦的負反饋作用，促進內(nèi)源性卵泡刺激素和黃體生成素的釋放及卵泡生長［12］。而在體外細胞實驗中，RAL表現(xiàn)為雌激素拮抗作用或中立作用［13］。RAL的半衰期（32.5 h）較短，經(jīng)口服后絕大部分體內(nèi)的RAL及其代謝物在5 d內(nèi)排出，對子宮內(nèi)膜增殖的影響有限；至胚胎著床期，RAL已被清除干凈，在促排卵治療中對子宮內(nèi)膜的影響不大。

信使因子COX-2是花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵酶，而前列腺素在胚胎著床、生長發(fā)育過程中起重要作用。因此，COX-2可通過影響前列腺素的合成調(diào)節(jié)女性生殖功能。COX-2基因缺陷的雌性小鼠會出現(xiàn)多方面的生殖功能障礙，如排卵障礙、卵子受精率下降、胚胎著床及子宮蛻膜化障礙等［7］。LPAR3是一種G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR），通過結(jié)合溶血磷脂酸在哺乳動物生殖過程中發(fā)揮重要作用，與胚胎植入功能密切相關(guān)［14］。而且，LPAR3基因缺陷的小鼠與臨床表現(xiàn)與COX-2基因缺陷的小鼠類似。敲除LPAR3基因的小鼠，COX-2的表達也顯著降低。LPAR3還可能通過COX-2-前列腺素途徑來影響胚胎的著床。因此，COX-2與LPAR3是2個預測子宮內(nèi)膜容受性的良好參考指標［7，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，COX-2、LPAR3 2個因子標志物在RAL用藥組和自然受孕對照組小鼠中的表達均無顯著性差異。這提示使用RAL進行促排卵治療并未降低著床窗期小鼠子宮內(nèi)膜的COX-2和LPAR3表達，對子宮內(nèi)膜容受性未產(chǎn)生明顯損害。最近也有研究發(fā)現(xiàn)，RAL對子宮內(nèi)膜的厚度也沒有不良損傷［15］。因此，RAL是一種溫和、安全、有效的促排卵新藥。當然，使用RAL進行促排卵的應(yīng)用研究在國內(nèi)外生殖醫(yī)學領(lǐng)域剛剛起步，尚處于摸索階段，有待通過更廣泛的臨床研究及更深入的藥效機制來加以探討。

表1　不同組雌鼠著床窗期子宮內(nèi)膜的COX-2、LPAR3表達情況比較Table 1　Comparison of the expression of COX-2 and LPAR3 in endometrium of female mice during periimplantation in different groups

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Effects of ovulation induction by raloxifene treatment on the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse uterine endometrium during periimplantation period

XIAN Yingjie★，CHEN Cairong，ZHOU Xiuqin，YAN Qiuxia，LIANG Xiaoqing，ZHAO Xiaoying
（Reproductive Medicine Center，People’s Hospital of Qingyuan，Qianyuan，Guangdong，China，511500）

［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the effect of ovulation induction by raloxifene treatment on endometrial receptivity by detection of the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse endometrium during peri -implantation period.Methods60 female non-pregnant Kunming mice were randomly divided into the RAL treatment group and the normal control group（natural conception）.4.5 days following pregnancy，the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse endometrium was detected by immunohistochemical staining. ResultsThere were no significant differences in the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse endometrium between the RAL group and the normal controlled group.ConclusionRaloxifene treatment for ovulation induction does not change the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse endometrium significantly，and has no harmful effects on the endometrial receptivity.

［KEY WORDS］Raloxifene（RAL）； Cycloxygenase-2（COX-2）； Lysophosphatidic acid receptor 3 （LPAR3）； Expression

基金項目：清遠市科技計劃項目（2013B015）

作者單位：清遠市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東，清遠511500