中國人頭發(fā)纖維在UVA紫外光老化中的光譜學研究

唐 穎, Gerald J.Smith

1. 北京工商大學北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048 2. School of Chemical and Physical Sciences, Victoria University of Wellington, PO Box 600, Wellington, New Zealand

中國人頭發(fā)纖維在UVA紫外光老化中的光譜學研究

唐 穎1*, Gerald J.Smith2

1. 北京工商大學北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048 2. School of Chemical and Physical Sciences, Victoria University of Wellington, PO Box 600, Wellington, New Zealand

生活中，日光中的紫外輻射是導致頭發(fā)光老化/光損傷的重要環(huán)境因素。長時間光照可使染發(fā)和天然發(fā)出現(xiàn)包括顏色褪變在內的退行性變化。以中老年人的自然灰發(fā)為樣本來源，通過分離和人工漂染處理，獲得了包括自然發(fā)色、漂白和染黑的六種頭發(fā)類型，經過UVA(320～400 nm)紫外光老化，采用漫反射光譜、三維熒光光譜和衰減全反射傅里葉變換紅外光譜對頭發(fā)纖維的老化特征進行無損分析，結合頭發(fā)中光產生過氧化氫的定量分析，探討了不同發(fā)色和漂染處理對頭發(fā)耐光性的影響。結果表明，UVA輻照可通過Ⅱ型電子轉移機制誘導頭發(fā)中的光敏基團產生過氧化氫，導致纖維表面蛋白和色素分子的光氧化降解。自然發(fā)色與漂染發(fā)在光老化中的顏色變化不同： 灰發(fā)和白發(fā)主要發(fā)生光黃化，人工染發(fā)和漂白發(fā)分別發(fā)生光褪色和光漂白。高濕度環(huán)境能加速頭發(fā)的光降解。化學漂染處理會使頭發(fā)中的光致過氧化氫水平升高，使纖維處于較高的氧化壓力從而影響頭發(fā)的光穩(wěn)定性； 而頭發(fā)中的黑色素分子，包括天然黑色素和染發(fā)劑的人工黑色素，可能具有自由基產生與清除雙重性。研究結果為建立中國人頭發(fā)光損傷的光譜學評價方法和進一步研發(fā)針對國人發(fā)質的染護發(fā)產品提供了重要的實驗基準數(shù)據(jù)。

頭發(fā)纖維； UVA輻射； 漫反射光譜； 三維熒光光譜； ATR-FTIR； 過氧化氫

引 言

頭發(fā)雖然是一種無生命的皮膚附屬器，卻與人們的形象息息相關，甚至影響心理健康。進入21世紀，我國人口的老齡化發(fā)展使染發(fā)人群不斷擴大。然而，染發(fā)劑在美化形象的同時也帶來了頭發(fā)光敏感、褪色等問題。國外研究發(fā)現(xiàn)，染發(fā)的顏色和亮度在模擬日光照射后顯著降低，其改變程度還與頭發(fā)中原先黑色素的種類、含量和梳洗頻率有關[1]。除了染發(fā)，天然頭發(fā)也會受到光照的影響。Hoting等發(fā)現(xiàn)，頭發(fā)顏色深淺不同，對光照的反應性也不同： 淺色發(fā)比深色發(fā)更容易受到紫外輻射的影響，漂白等化學處理能加快頭發(fā)的光老化[2-4]。從光反應性上，頭發(fā)可被看作是一個由角蛋白和色素組成的二元光化學體系，而日光中的紫外輻射對這兩大成分的破壞是導致頭發(fā)光損傷的主要原因[5]。其中，中波紫外線(UVB, 280～320 nm)能直接破壞毛小皮中的二硫鍵，主要損害頭發(fā)的表面形態(tài)； 長波紫外線(UVA, 320～400 nm)主要通過光氧化反應造成包括顏色變化的更深層次損傷[6-8]。在特定波長的激發(fā)下，頭發(fā)中的色氨酸等光敏性基團能通過Ⅰ型(電子轉移)或Ⅱ型(能量轉移)機制與空氣中的氧發(fā)生光敏反應，產生包括單線態(tài)氧和過氧化氫等活性氧簇(ROS)[9]。ROS及其引發(fā)的自由基反應可氧化頭發(fā)中的蛋白、脂質和色素成分，導致強度降低、表面粗糙、顏色減退、缺乏光澤等一系列光損傷表型的出現(xiàn)[7]。

目前，化妝品市場陸續(xù)推出許多針對染后發(fā)質的洗護產品，其中宣稱具有防曬、抗褪色的產品特別受消費者青睞，具有極大的市場潛力[10]。然而，由于我國在頭發(fā)的光老化方面的研究極少，相對于建立了比較完善的評價體系(如SPF指數(shù))的皮膚防曬, 目前對頭發(fā)的光損傷/光防護尚缺乏有效的評價方法。除了對顏色和表面形貌的物理表征，國外文獻中還常使用紫外、熒光和紅外等光譜技術分析頭發(fā)中的色素和氨基酸成分變化。但由于頭發(fā)樣品的復雜性，研究中常采用破壞性的樣品制備方法，實驗結果的差異較大。另外，國外主要關注白種人的金發(fā)、棕發(fā)與紅色系染發(fā)，其研究結果也不一定適合以黑發(fā)為主的中國。以我國中老年人的自然發(fā)和人工漂染發(fā)為對象，采用無損的制備方法，運用漫反射光譜、三維熒光光譜和衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)對頭發(fā)纖維的UVA紫外光老化進行了原位的快速表征，并結合對頭發(fā)中光產生過氧化氫的定量分析，探討了不同發(fā)色和漂染處理對頭發(fā)耐光性的影響。這些數(shù)據(jù)為建立頭發(fā)纖維光損傷的光譜學評價方法，進一步比較不同染護發(fā)產品的影響、研發(fā)針對中國人發(fā)質的發(fā)用化妝品提供了重要的理論與實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 樣品處理

實驗樣本來源為采集自北京地區(qū)的20例漢族(年齡45～85歲，男女各半)的自然灰發(fā)(GH，白發(fā)比例30%～80%)，用蒸餾水超聲清洗后，通過分離灰發(fā)中的黑發(fā)與白發(fā)、均勻混合不同供體的頭發(fā)獲得黑發(fā)(BH)、白發(fā)(WH)和白發(fā)比例50%的灰發(fā)(GH)樣品； 然后對黑發(fā)樣品進行漂白處理獲得漂白發(fā)(BHB)樣品，采用市售氧化型染發(fā)劑對灰發(fā)和漂白發(fā)進行人工染黑獲得灰發(fā)染黑發(fā)(GHD)和漂白后染黑發(fā)(BHBD)，總共六種類型的頭發(fā)樣品。

(1)漂白過程： 稱取同重量的歐萊雅雙氧乳(含12%過氧化氫)和無塵香薰漂粉按1∶1比例調和后將混合液均勻覆蓋在頭發(fā)上，室溫處理50 min后用蒸餾水將漂白發(fā)沖洗至中性pH值。

(2)染黑過程： 量取48 mL歐萊雅#1自然黑色染發(fā)霜(含對苯二胺)，與72 mL顯色敷用劑配成搖勻染發(fā)劑，用刷子蘸取適量搖勻染發(fā)劑，刷在自然灰發(fā)或漂白發(fā)上，使其均勻覆蓋，室溫處理30 min后用蒸餾水將染黑發(fā)沖洗至中性pH值。

頭發(fā)纖維由于表觀粗細不均勻，纖維之間存在孔隙，影響光譜測量的準確性。為了克服這一困難，本文設計了針對頭發(fā)樣品的石英樣品池(圖1)，池中頭發(fā)按同方向排列固定，填充用量少(約90～100 mg)，實現(xiàn)了對頭發(fā)纖維光譜特征的無損、快速檢測。

圖1 頭發(fā)樣品石英樣品池

1.2 UVA光老化

樣品的人工光老化采用兩根美國Spectronics公司XX-15A型長波UVA/15 W自濾色燈管，中心波長為365 nm。進行干老化時使用石英池裝填樣品，樣品距離燈管10 cm，輻照強度2.85 mW·cm-2，輻照48 h。濕老化時稱取100 mg頭發(fā)樣品用1 mL蒸餾水潤濕后封于得力PE透明自封袋(100×70 mm，UVA區(qū)透光率80%～85%)中，與干老化一同結束后取出頭發(fā)裝填入石英池進行光譜分析。監(jiān)控光老化過程中的環(huán)境溫度為(30±5)℃，濕度為RH20%(干老化)～RH90%(濕老化)。

1.3 儀器及參數(shù)

漫反射光譜檢測采用配備積分球附件的島津UV-3150紫外-可見分光光度計(掃描步長1 nm，掃描范圍300～800 nm)。采用Horiba公司的Fluorolog-3熒光光譜儀(Jobin Yvon)測定樣品在“front-face”模式激發(fā)波長270～420 nm(間隔10 nm)的發(fā)射光譜(掃描步長2 nm，掃描范圍300～600 nm)，然后使用Origin軟件對原始光譜數(shù)據(jù)進行矩陣重構獲得三維熒光等高線光譜。紅外光譜檢測采用美國Thermo Nicolet Avatar 370傅里葉變換紅外光譜儀配備衰減全反射ATR附件。測試時將10根頭發(fā)纖維緊壓平鋪于鍺反射晶體上。光譜分辨率4 cm-1，光譜采集范圍4 000～550 cm-1, 掃描信號累加50次。

1.4 光致過氧化氫分析

參照Millington的方法[11]對光照過程中產生的過氧化氫進行定量分析。該方法原理基于二價鐵可被過氧化氫氧化生成三價鐵，后者與二甲酚橙(Xylenol Orange，Sigma公司)生成紫色的絡合物(λmax=560 nm)。測試時稱取100 mg頭發(fā)纖維用1 mL蒸餾水潤濕后進行濕老化，然后從PE袋中抽取500 μL液體，用蒸餾水10倍稀釋成5 mL加入10 mL工作溶液(由等比例的0.25 mol·L-1硫酸、0.1 mol·L-1山梨醇、1.0 mmol·L-1二甲酚橙和2.5 mmol·L-1硫酸亞鐵銨溶液混合而成)，用水補足至25 mL。在室溫下攪拌反應液45 min后，測其在560 nm的吸光值(A)。根據(jù)標準曲線：A=0.032 34c+0.001 2(R2=0.998)，計算樣品中的過氧化氫濃度(c)。每個樣品平行測試三次，同時以無光照條件下的吸光值作空白對照。

2 結果與討論

2.1 漫反射光譜測定頭發(fā)的顏色變化

采用紫外可見漫反射光譜對六種類型頭發(fā)樣本在UVA光老化48h前后的顏色變化進行了比較，實驗數(shù)據(jù)如圖2所示。研究結果發(fā)現(xiàn)，不同類型的頭發(fā)纖維對UVA輻照的敏感程度和光變色反應具有明顯差異，同一頭發(fā)樣品在不同濕度條件下的反應也不相同。光老化使三種自然發(fā)色(WH，GH和BH)在可見光區(qū)尤其是400～500 nm短波區(qū)的反射值減少，表明產生了吸收藍色可見光的生色基團，從而導致視覺上的光黃化。相反地，漂染過的頭發(fā)(BHB，GHD和BHBD)則表現(xiàn)出不同程度的反射值增加。其中，兩種人工染發(fā)(GHD和BHBD)的反射值增加主要發(fā)生在短波可見光和近紫外區(qū)(300～500 nm)，說明該區(qū)段的色素分子發(fā)生了光降解，即光褪色。漂白發(fā)的反射值在整個紫外可見光區(qū)都有增加，表現(xiàn)為均勻的亮度增加，即光漂白。六種類型頭發(fā)的共同特征是，在干燥條件下，反射值的變化并不明顯，但在高濕度條件下譜圖變化顯著，說明頭發(fā)在濕老化中比干老化更容易發(fā)生顏色改變。

圖2 UVA輻照前后頭發(fā)樣品的反射光譜

2.2 頭發(fā)的三維熒光指紋譜

首次應用三維熒光光譜技術，獲得了六種類型頭發(fā)樣品的三維熒光譜圖，如圖3所示。在含有黑色素的樣品(GH，BH，GHD和BHBD)中可觀察到顯著的兩個熒光峰： (1)熒光峰A，激發(fā)波長Ex290 nm, 發(fā)射波長Em340 nm，屬于色氨酸熒光峰； (2)熒光峰B，激發(fā)波長Ex330～400 nm, 發(fā)射波長Em400～480 nm，屬于色氨酸的氧化代謝產物(主要成分為犬尿氨酸及衍生物)[12]。由于頭發(fā)中黑色素對熒光的自吸收作用，隨著發(fā)色的加深，熒光峰A在黑發(fā)和染黑發(fā)中發(fā)生了一定的拉伸和變形，而在無黑色素的白發(fā)和漂白樣品中其信號被強熒光峰B所屏蔽。

比較不同頭發(fā)樣品譜圖中熒光峰的數(shù)目、位置和UVA輻照前后的強度，結果如表1。在有色頭發(fā)中，熒光峰A，色氨酸特征峰的出現(xiàn)位置一致，但在不同黑色素含量的頭發(fā)中熒光強度不同： 淺色發(fā)中明顯高于深色發(fā)。熒光峰B在不同著色的頭發(fā)中的位置有顯著差異： 發(fā)射波長400，450和480 nm處的熒光基團分別是： N-甲酰犬尿氨酸、犬尿氨酸和3-羥基犬尿素，均為色氨酸的氧化與代謝產物[12]。因此三維熒光光譜技術能提供頭發(fā)纖維成分的指紋特征，據(jù)此可鑒別不同色素沉著和不同漂染處理的頭發(fā)。

圖3 六類頭發(fā)纖維的三維熒光光譜

表1 48 h UVA輻照前后頭發(fā)中的熒光特征峰

*Fluorescence intensity values were the averages of triple measurements

48 h紫外光老化后，頭發(fā)中并沒有新的熒光峰產生，而是原有熒光峰的強度發(fā)生了變化，且在自然發(fā)色與漂染處理頭發(fā)中的改變不同： 在未經處理的黑白灰三個頭發(fā)樣品中，兩個熒光峰的強度均顯著降低，表明UVA輻照可使頭發(fā)中的色氨酸和代謝物發(fā)生光降解； 在漂染發(fā)中，由于短波區(qū)人工色素分子的光降解(參見2.1反射光譜)，濾光作用下降，使光照后熒光峰強度反而增加。由此可知，頭發(fā)中的熒光信號受到光吸收色素的影響，在利用熒光光譜分析頭發(fā)表面基團變化時應結合反射光譜的數(shù)據(jù)綜合考慮。

2.3 紅外指紋圖譜分析頭發(fā)表面成分的變化

圖4 UVA輻照前六類頭發(fā)纖維的FTIR光譜

以酰胺Ⅰ帶吸收峰為內標對FTIR譜圖進行歸一化處理，比較UVA輻照前后的頭發(fā)纖維在1 140～1 000 cm-1指紋區(qū)的變化，如圖5所示。指紋區(qū)有三個特征吸收峰1 041，1 075和1 120 cm-1，分別歸屬于磺基丙氨酸(R-SO3H)、胱氨酸單氧化物(R—S—SO—R)和胱氨酸二氧化物(R—S—SO2—R)[14]； 其中在BHB的單氧化物和二氧化物特征峰分別偏移到了1 082和1 114 cm-1。三個特征吸收峰在自然白發(fā)中的強度均高于灰發(fā)和黑發(fā)。1 041 cm-1吸收峰在經過漂白處理的頭發(fā)(BHB和BHBD)中的強度明顯高于其他樣品。UVA輻照后，該吸收峰在除了BHB以外的頭發(fā)樣品中均表現(xiàn)為增強，表明UVA和過氧化氫都能使頭發(fā)中胱氨酸的二硫鍵斷裂產生半胱氨酸，后者易被氧化產生大量磺基丙氨酸。由于頭發(fā)表面胱氨酸含量相對恒定(約11%～18%)，因此磺基丙氨酸可用來監(jiān)測高硫蛋白的氧化程度。濕老化對磺基丙氨酸和胱氨酸單氧化物的產生有促進作用； 胱氨酸二氧化物在光照后的自然發(fā)和染發(fā)中也有不同程度的增加，但在經漂白處理的樣品中呈下降趨勢。

圖5 48 h UVA輻照前后頭發(fā)樣品的FTIR指紋區(qū)譜圖(通過在1 647 cm-1酰胺Ⅰ帶的歸一化處理獲得)

Fig.5 FTIR fingerprint spectra of human hairs before and after 48 h of UVA irradiation. The spectra were normalized at 1 647 cm-1(the amide Ⅰ frequency)

2.4 頭發(fā)中UVA光致過氧化氫的定量分析

如圖6所示，UVA輻射能在所有頭發(fā)類型中誘導過氧化氫的產生，其濃度隨著輻照時間而增長。一方面，漂白發(fā)(BHB)的產量最高，漂白染黑發(fā)(BHBD)次之，說明強氧化劑損傷過的頭發(fā)會產生更大的氧化壓力進而影響光老化速率。另一方面，兩種黑色染發(fā)的過氧化氫水平明顯高于自然黑發(fā)，后者又高于不含黑色素的白發(fā)。結果表明，頭發(fā)中的黑色素，包括天然黑色素和染料中的人工黑色素，可能具有一定光敏性，能通過Ⅱ型電子轉移途徑產生過氧化氫。有意思的是，白發(fā)的過氧化氫產生量高于含有黑色素的灰發(fā)。已有研究報道皮膚中的黑色素一方面可作為光敏劑催化過氧化氫等ROS的產生，一方面又對ROS有清除作用[9, 15]。因此，推測頭發(fā)中的黑色素對ROS的光產生和清除可能處于一種動態(tài)的平衡，而這種平衡取決于黑色素的含量。在含量高的黑發(fā)中，黑色素主要表現(xiàn)為光敏性，誘發(fā)產生更高水平的過氧化氫； 而在含量較低的灰發(fā)中，黑色素對ROS的抑制/清除作用更強，因此其過氧化氫水平反而低于白發(fā)。

圖6 UVA輻照誘導產生過氧化氫于頭發(fā)接觸的水中

Fig.6 Photogeneration of H2O2in water in contact with human hair fibers resulting from exposure to UVA radiation

3 結 論

運用紫外可見反射光譜、三維熒光光譜和衰減全反射紅外光譜分析技術，以中國漢族人源的頭發(fā)纖維為樣本，獲得了六類代表性頭發(fā)的特征譜圖，對頭發(fā)在UVA人工光老化過程中的光損傷進行了原位、無損的光譜學檢測。研究結果表明，UVA輻照誘導頭發(fā)中的光敏基團通過Ⅱ型電子轉移途徑產生過氧化氫，導致纖維表面蛋白和色素分子的光氧化降解，其中，自然灰發(fā)和白發(fā)主要發(fā)生光黃化，人工染發(fā)和漂白發(fā)分別發(fā)生光褪色和光漂白。高濕度環(huán)境對光損傷有促進作用。首次對頭發(fā)的光誘導過氧化氫水平進行了定量測定，結果發(fā)現(xiàn)，漂染處理會使頭發(fā)處于較高的氧化壓力從而影響頭發(fā)的光穩(wěn)定性； 而頭發(fā)中的黑色素分子，包括天然黑色素和染發(fā)劑的人工黑色素，可能具有自由基產生與清除雙重性。

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(Received Jun. 8, 2015; accepted Nov. 8, 2015)

*Corresponding author

Spectroscopic Investigation of Human Hair from Chinese Subjects During UVA Photoageing

TANG Ying1*, Gerald J.Smith2

1. Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China 2. School of Chemical and Physical Sciences, Victoria University of Wellington, PO Box 600, Wellington, New Zealand

Since ultraviolet radiation is one of the major environmental factors that cause photoageing/photodamage, human hair, including both dyed and undyed hair, are subject to color change following extended exposure to sunlight. In the work described in this paper, six samples of human hair from Chinese volunteers that included untreated, bleached and dyed were subjected to accelerated ageing by exposure to UVA (320～400 nm) radiation. Changes to their chemical compositions during photoageing were non-destructively characterized by reflectance, 3D-fluorescence and attenuated total reflectance Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopies. These techniques, together with a quantitative analysis of the photosensitized generation of hydrogen peroxide, were used to assess the effects of different hair color and bleaching/dyeing treatments on the light stability of hair fibers. The results suggest that UVA irradiation can induce the production of hydrogen peroxide via a type Ⅱ mechanism (electron transfer interaction between photosensitive protein groups in their excited states) and subsequent reaction with oxygen, resulting in photo-oxidative degradation of surface protein and pigments of the hair fiber. Hair fibers of natural or artificial color respond differently in terms of color change during photoageing. Natural white and gray hair fibers exhibited the usual photoyellowing; and chemically black-dyed and bleached hairs showed photofading and additional photobleaching, respectively. Irradiation of hair in the wet state was found to accelerate photodegradation. Chemical bleaching and oxidative dyeing processes were shown to promote the photoinduced production of hydrogen peroxide, which contribute to a higher level of oxidative stress and thereby affects the photostability of human hair. Pigment molecules in hair, including both the natural pigmentation of melanin and that produced by artificial dyes, are suggested to play a dual role, both in the production and in the scavenging of oxygen free radicals. The work is designed to contribute to the establishment of spectroscopic methods for assessing the extent of hair photodamage as well as providing a sound experimental data basis for the research and development of improved hair dyes and after-dye products for the Chinese cosmetic market.

Human hair; UVA radiation; Reflectance spectroscopy; 3D-fluorescence spectroscopy; ATR-FTIR; Hydrogen peroxide

2015-06-08，

2015-11-08

國家自然科學基金項目(51403006)和北京市自然科學基金項目(2144046)資助

唐 穎，女，1983年生，北京工商大學化妝品系副教授 e-mail： tangying@th.btbu.edu.cn *通訊聯(lián)系人

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1783-06