表面增強激光拉曼光譜測定豆制品中的堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ、皂黃

閆 正，張麗冰，任孟偉，楊照生，布雅楠，蔡立鵬

1. 河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北 保定 071002 2. 河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091

表面增強激光拉曼光譜測定豆制品中的堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ、皂黃

閆 正1，張麗冰1，任孟偉1，楊照生1，布雅楠1，蔡立鵬2*

1. 河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北 保定 071002 2. 河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091

以表面增強激光拉曼光譜技術快速檢測了豆制品中堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ和皂黃的含量，并以高效液相色譜-串聯(lián)質譜法進行了確證。優(yōu)化出最佳提取溶劑為甲醇-水(7+3)溶液，樣品前處理采用快速溶劑萃取儀(ASE)提取和凝膠滲透色譜(GPC)凈化，對ASE和GPC條件進行了優(yōu)化，提高了提取效率、檢測靈敏度、減少提取溶劑用量并且有效去除了基質中大分子的干擾物。對三種色素的表面增強拉曼譜中的特征峰進行了歸屬認證。堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ和皂黃的定量特征峰分別為652，995和983 cm-1； 方法檢出限為3.0，1.0和4.0 mg·kg-1。三種色素定量特征峰與色素濃度呈良好的線性關系，實驗的回收率在83.48%～92.59%范圍內，相對標準偏差小于7.2%。該方法新穎、前處理、設備操作簡單、分析速度快、重現(xiàn)性好、靈敏度高，成功的對食品中色素進行了定性和定量測定，為食品中色素的檢測提供了可靠的參考。

表面增強激光拉曼光譜； 堿性嫩黃Ⅱ； 堿性橙Ⅱ； 皂黃； 液相色譜-串聯(lián)質譜法

引 言

堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ和皂黃均為偶氮類堿性工業(yè)染料，主要用于綢、紙張、油漆、紡織品、皮革制品、木制品、腈綸、棉織品的染色。

豆制品是生活中不可缺少的食品，其主要原料是黃豆，但一些不法分子為了獲取暴利，將劣質黃豆摻入新鮮的黃豆中，這樣生產出來的產品不僅質量差，且顏色也有差異。因堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ和皂黃與蛋白質吸附較牢固，色澤鮮艷、不易褪色、價格低廉，故常被不法商販用來對豆制品染色。毒理研究顯示上述染料對皮膚黏膜有刺激作用，長期接觸或食入會引起中毒甚至致癌，嚴重危害了消費者的身體健康。根據(jù)GB 2760—2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》規(guī)定，禁止堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃Ⅱ、皂黃在食品中添加[1]。目前檢測食品中色素的方法主要是高效液相色譜法[2-6]，單掃描極譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[8]、毛細管電泳法[9]、薄層色譜掃描法[10]等，但這些方法前處理繁瑣，分析周期長(大約需要3～4 h)，操作復雜，成本高，不能實現(xiàn)快速檢測。

本研究以表面增強激光拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)技術對豆制品中的堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ和皂黃進行了檢測研究，建立的方法操作簡單、快速、準確。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

便攜式拉曼檢測儀(RamTracer-200型，OptoTrace Technogies, Inc)； 漩渦混勻器(VORTEX Genius 3，IKA)； 離心機(3K15，Sigma)； 加速溶劑萃取儀(ASE 350 美國Dionex公司)； 凝膠色譜凈化系統(tǒng)(PrepLinc Plat，美國J2公司)； 旋轉蒸發(fā)儀(RV-10數(shù)顯型，IKA)； 氮氣濃縮儀(N-EVAP 111，IKA)； 高效液相色譜-串聯(lián)質譜(QTRAP 5500，AB Sciex)。

堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ、皂黃標準品(純度≥99%，TOKYO KASEI)； 乙酸乙酯、環(huán)己烷、甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)； 去離子水； 金納米增強試劑、無機鹽凝聚劑[11-12](OTR202，OTR103，OptoTrace Technogies, Inc)； 硅藻土，樣品為市售包裝腐竹、豆皮、豆奶粉。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

精確稱取各標準品0.1 g，分別用甲醇溶解，定容至100 mL，制得1 000 mg·L-1的儲備液，于4 ℃冰箱中保存。使用時逐級稀釋至所需濃度。

1.2.2 樣品前處理

提取(ASE法)： 稱取搗碎樣品1 g于小燒杯中，與硅藻土均勻混合。將樣品混合物加入到裝有纖維素膜的11 mL不銹鋼萃取池中。空余體積用硅藻土填滿(以減少溶劑消耗)，旋上萃取池蓋。按設定提取程序運行，收集萃取液，55 ℃旋轉蒸發(fā)至干。

凈化： 用10 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1+1)溶液分三次洗滌旋蒸瓶，轉移至10 mL凝膠滲透色譜(GPC)進樣瓶中，進樣5 mL。用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1+1)洗脫，流速4.0 mL·min-1，棄去前面9 min的淋洗液，收集后續(xù)5 min的淋洗液。將收集液40 ℃氮吹至干，用2 mL甲醇-水(7+3)溶解，經0.22 μm有機濾膜過濾，濾液待測。

1.2.3 儀器條件

進入RamAnalyzer系統(tǒng)，對儀器進行校正，找出校準液的最佳焦距，在2 mL玻璃樣品瓶中依次加入OTP202金納米增強試劑500 μL，待測液20 μL，OTP103無機鹽凝聚劑100 μL，混勻后放入樣品池中測定。激光功率： 200 mW； 積分時間： 10 sec； 平均次數(shù)： 2； 平滑參數(shù)： 1。每個樣品重復掃描3次取平均值。

2 結果與討論

2.1 溶劑的選擇

分別考察了乙腈、丙酮、甲醇、乙醇等及其與水混合的溶劑，對豆制品中的堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ、皂黃進行提取。結果表明，甲醇-水(7+3)溶液提取效果最佳。

2.2 ASE條件優(yōu)化

傳統(tǒng)的萃取方法有索式提取法、超聲法、微波輔助提取法等，但因耗時長，不能滿足快速檢測工作需求[13-15]。實驗采用ASE對被測物質進行提取，并對主要參數(shù)進行了優(yōu)化[16-18]，最終得出ASE最佳條件： 溫度60 ℃，壓力1 500 psi，靜態(tài)萃取5 min，用池體積50%的萃取溶劑沖洗萃取池，吹掃時間60 s，循環(huán)萃取兩次。

2.3 GPC條件優(yōu)化

通過調整流速，使大分子物質與分析物分開，以響應值為縱坐標與時間為橫坐標作圖。結果見圖1。得出最佳GPC條件為： 收集時間9～14 min，流速4.0 mL·min-1。

2.4 拉曼技術的選擇

以堿性橙Ⅱ為比對樣，用普通拉曼技術對堿性橙Ⅱ水溶液進行檢測，濃度為100 μg·mL-1時未出現(xiàn)特征峰(圖2b)，而在溶液中加入金納米表面增強試劑和無機鹽凝聚劑后，濃度為4 μg·mL-1時，拉曼特征峰已很明顯(圖2c)，圖2a為增強試劑的拉曼圖，對比三個拉曼圖說明表面增強拉曼光譜可以明顯增強檢測靈敏度，對微量物質進行測定。

2.5 拉曼光譜圖的分析

圖1 GPC條件優(yōu)化圖

圖2 表面增強拉曼光譜的比較a: 202+103拉曼譜圖； b: 普通拉曼； c: 表面增強拉曼

2.6 方法的線性、檢出限和基質效應

稱取1 g空白豆制品為基質，加入適量標準溶液(1.2.1)，按照1.2.2進行處理、1.2.3中拉曼光譜儀的儀器條件進行測定。以被測物特征峰響應值為縱坐標，基質加標溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表1。

本研究對堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ、皂黃在腐竹、豆皮和豆奶粉中的基質效應進行了研究，通過基質匹配的標準溶液的標準曲線斜率與溶劑標準溶液的標準曲線斜率之比進行計算，結果見表1，從表1得出堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ和皂黃在腐竹、豆皮和豆奶粉中的基質效應分別均小于100%，說明基質對實驗有抑制效應。

2.7 方法回收率和精密度

以空白豆制品為基質，在檢出限和10倍檢出限兩個添加水平下，回收率為83.48%～92.59%，相對標準偏差為4.3%～7.2%，詳見表2。

圖3 三種色素的表面增強激光拉曼光譜(10 μg·mL-1)

表1 三種色素的線性范圍、線性相關系數(shù)、基質效應及檢出限

Table 1 Linear range, Correlation coefficient, Matrix effectand Limit of detection

基質樣品色素名稱線性方程基質效應/%線性范圍/(mg·kg-1)r方法檢出限/(mg·kg-1)腐竹堿性嫩黃Ⅱ堿性橙Ⅱ皂黃Y=20.41X+350.32Y=30.234X+362.28Y=45.522X+149.1272.2573.3977.354.0～100.02.0～80.04.0～40.00.99470.99640.99223.01.04.0豆皮堿性嫩黃Ⅱ堿性橙Ⅱ皂黃Y=22.932X+395.47Y=33.99X+427.48Y=49.237X+181.8481.1882.5183.654.0～100.02.0～80.04.0～40.00.99540.99540.99783.01.04.0豆奶粉堿性嫩黃Ⅱ堿性橙Ⅱ皂黃Y=25.048X+418.06Y=36.117X+471.28Y=51.797X+193.5188.6687.6788.004.0～100.02.0～80.04.0～40.00.99800.99770.99353.01.04.0

表2 回收率和精密度(n=7)

2.8 實際樣品檢測及陽性樣品確證

對市售的40個腐竹樣品、5個豆皮樣品以及4個豆奶粉樣品檢測，腐竹中檢出堿性嫩黃Ⅱ和堿性橙Ⅱ各一例，并以液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀(QTRAP 5500，AB SCIEX)對陽性樣品進行了定性和定量確證。色譜條件為： Phenomenex C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.6 μm)，柱溫40 ℃，流速0.3 mL·min-1。質譜條件： 離子源： ESI(+)，離子源溫度500 ℃，噴霧電壓55 00 V。檢測結果和確證結果見表3。

表3 陽性樣品檢測結果

結果表明此方法與液質聯(lián)用檢測結果的RSD<5%，能夠滿足日常檢測準確度的要求。

3 結 論

基于表面增強激光拉曼光譜技術，建立了快速測定豆制品中堿性嫩黃Ⅱ、堿性橙Ⅱ、皂黃的方法，并用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法進行了確證。對ASE和GPC的各項參數(shù)進行了研究和優(yōu)化。ASE的應用縮短了前處理時間，且提高了檢測的靈敏度，樣品通過GPC凈化，雜質峰明顯減少，降低了基質干擾，保證了定性、定量分析的準確度。為快速檢測和在線篩查食品中污染物、實時監(jiān)測食品運輸或發(fā)酵過程等方面的研究提供了一個新的探索方向。

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*Corresponding author

(Received May 27, 2015; accepted Aug. 14，2015)

Fast Determination of Auramine Ⅱ, Basic Orange Ⅱ and Metanil Yellow in Bean Products on Surface Enhanced Raman Spectroscopy and Use High Pergormance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry to Verify

YAN Zheng1, ZHANG Li-bing1, REN Meng-wei1, YANG Zhao-sheng1, BU Ya-nan1, CAI Li-peng2*

1. College of Chemistry & Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002, China 2. Hebei Key Laboraory of Food Safety, Hebei Food Inspecion and Research Institute, Shijiazhuang 050091, China

This experiment adopts Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) to quickly detect auramine Ⅱ, basic orange Ⅱ and metanil yellow in bean products. It uses High Performance Liquid Chromatography (HPLC)-tandem mass spectrometry to verify. The best extraction solvent is methanol-water (Seven plus three) solution. Before classification, extracting the bean products withAccelerated Solvent Extaction (ASE) and purifying it with Gel Permeation Chromatography(GPC), which improves the extraction efficiency, improves the detection sensitivity, reduces the dosage of extraction solvent and effective in the matrix of macromolecular distractors.ASE and GPC conditions are optimized. This study of three types of pigment surface enhanced Raman spectra characteristic peak of the ownership certification. The characteristic peak of auramine Ⅱ, basic orange Ⅱ and metanil yellow is respectively 652, 995 and 983 cm-1; he method detection limit is 3.0, 1.0 and 4.0 mg·kg-1. Three quantitative characteristic peak of pigment had a good linear relationship with pigment concentration，Recovery of this experiment was 83.48%～92.59% range, relative standard deviation less than 7.2%. The method is characterized by simple pretreatment, short analysis period and high sensitivity, etc. The method provides a reliable reference for food pigment detection.

Surface enhanced Raman spectroscopy; Auramine Ⅱ; Basic orange Ⅱ; Metanil yellow; High pergormance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

2015-05-27，

2015-08-14

河北省自然科學基金項目(C2014321003)資助

閆 正，1958年生，河北大學化學與環(huán)境科學學院副教授 e-mail: yanzh@hbu.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: tielang200@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1761-04