不同接種密度對Caco-2細胞吸收模型分化及去極化評價指標的影響

唐家明，呂 林，張麗陽，鄒亞學(xué)，王秋悅，羅緒剛*，李素芬**

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066600， 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所)

不同接種密度對Caco-2細胞吸收模型分化及去極化評價指標的影響

唐家明1，呂 林2，張麗陽2，鄒亞學(xué)1，王秋悅1，羅緒剛2*，李素芬1**

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066600， 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所)

為確定不同接種密度對Caco-2細胞吸收模型分化及去極化評價指標的影響，以及細胞模型適用于吸收和轉(zhuǎn)運試驗的時間，采用Caco-2細胞高密度(1×105cells·cm-2)、中密度(5×104cells·cm-2)和低密度(3×104cells·cm-2)等3個接種密度，分別接種于帶聚碳酸酯微孔濾膜插槽的Transwell 6孔板上，培養(yǎng)29 d，通過測定跨膜電阻值(TEER)、堿性磷酸酶活性(ALP)和酚紅透過率，評價細胞單層的完整性、極化和透過性。結(jié)果表明，高、中、低密度接種分別于第12天、第15天和第18天TEER值超過600 Ω·cm2，第27天、第29天和第29天TEER值開始下降。高、中、低密度接種分別于第15天、第18天和第21天上下側(cè)堿性磷酸酶活性的比值都能達到10倍以上，第29天開始降低。高、中、低密度接種分別于第9天、第12天和第15天酚紅透過率小于0.5%。綜合以上3項指標，高密度接種細胞在第15天、中密度接種細胞在第18天、低密度接種細胞在第21天開始，可以用于吸收和轉(zhuǎn)運試驗，27 d以后細胞活力就開始下降，不適合做細胞模型。

Caco-2細胞；跨膜電阻(TEER)；堿性磷酸酶(ALP)；酚紅

Caco-2細胞在體外聚碳酸酯微孔濾膜上培養(yǎng)時，能自發(fā)分化并形成類似腸道上皮細胞的結(jié)構(gòu)特征和生化特性，如在細胞間形成緊密連接，在細胞表面形成良好的刷狀緣和微絨毛結(jié)構(gòu)，并可分泌水解酶以及合成轉(zhuǎn)運糖、氨基酸和藥物等的載體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)等[1]。因此，該模型在藥理[2]、毒理[3]、生化[4]以及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運[1，5]等研究方面具有良好的穩(wěn)定性和重演性[6]。細胞跨膜電阻(Transepithelial electrical resistance，TEER)是評價Caco-2細胞單層完整性的主要指標[7～9]，堿性磷酸酶活性(Alkaline phosphatase，ALP)則是細胞分化而具有極性的標識性指標[10,11]，而細胞單層的透過性是細胞能否用于吸收模型的關(guān)鍵[12,13]。然而，細胞的分化速度及去極化時間受細胞接種密度的影響[14]。至今尚未見到不同接種密度Caco-2細胞分化及去極化時間的系統(tǒng)報道。因此，筆者擬通過細胞形態(tài)學(xué)觀察和TEER值、ALP活性和酚紅透過率等3個細胞模型構(gòu)建關(guān)鍵指標的測定，評價細胞模型構(gòu)建中不同時間細胞分化及去極化狀態(tài)，為Caco-2細胞用于體外模擬小腸吸收和轉(zhuǎn)運模型的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

Caco-2細胞株購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所；DMEM(Dulbecco’s minimum essential medium)培養(yǎng)基(中科邁晨科技有限公司)；非必需氨基酸、雙抗(青、鏈霉素)、胰蛋白酶(質(zhì)量分數(shù)為0.002 g/L的EDTA溶液)、L-谷氨酰胺和Hanks緩沖液(HBSS，pH7.4)引自Gibco公司；胎牛血清(Cat No: SH30084.03E)引自Hyclone公司；堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))。

1.2 儀器和耗材

Millicell-ERS電阻儀購自美國MilliPore公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Model 3110 series, Thermo electron corporation，Marietta, Ohio)購自美國Thermo公司；CK41型倒置生物顯微鏡購自日本Olympus公司；酸度計購自美國HANNA公司；臺式離心機購自中國湘儀公司；超凈工作臺(YJ-1450型)購自蘇州長橋凈化設(shè)備廠；25cm2細胞培養(yǎng)瓶(Cat No: 430167)和帶聚碳酸酯微孔濾膜插槽的Transwell6孔細胞培養(yǎng)板(Cat No：3450)均購自美國Corning公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

在25 cm2細胞培養(yǎng)瓶(美國Corning)中對細胞進行傳代培養(yǎng)，試驗所用培養(yǎng)基為DMEM高糖混合培養(yǎng)基，其主要成分(含量)如下：胎牛血清(體積分數(shù)0.10)、非必需氨基酸(質(zhì)量濃度10 g/L)、L-谷氨酰胺(2 mmol·L-1)、青霉素(100 000 U·L-1)、鏈霉素(100 mg·L-1)和DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液。細胞在37 ℃，體積分數(shù)為0.05的CO2和90%相對濕度的CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，Marietta，Ohio)中進行培養(yǎng)。接種后48 h進行換液，之后每天換液1次。當(dāng)細胞生長至80%～90%鋪滿瓶底時(4～5 d)，棄去細胞培養(yǎng)廢液，用HBSS沖洗2～3遍，然后加入0.5 mL含EDTA的胰蛋白酶進行消化，細胞脫壁后，用吸管吹打成懸浮液，按1∶3比例接種于新的25 cm2培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)。

1.4 Caco-2細胞模型的構(gòu)建

當(dāng)細胞生長至80%～90%鋪滿瓶底時(4～5 d)，棄去細胞培養(yǎng)廢液，用HBSS沖洗2～3遍，然后加入0.5 mL含EDTA的胰蛋白酶進行消化，細胞脫壁后，用吸管吹打成懸浮液，細胞計數(shù)后，分別按高密度(1×105cells·cm-2)、中密度(5×104cells·cm-2)和低密度(3×104cells·cm-2)接種1.5 mL細胞懸液于6孔Transwell細胞培養(yǎng)板的插入槽中(膜孔徑0.4 μm，生長面積4.7 cm2)，作為轉(zhuǎn)運槽頂膜側(cè)(Apical side，AP)，插槽下層加入2.6 mL混合培養(yǎng)基，作為基底側(cè)(Basolateral side，BL)。第1周每48 h進行換液，一周之后每24 h換液。

1.5 Caco-2細胞模型的評估

分別于細胞培養(yǎng)不同時間在顯微鏡(Olympus CK41，日本)下觀察細胞形態(tài)變化與生長狀況。在細胞模型建立過程中，用Millcell-ERS電阻儀于第3天，第6天，第9天，第12天，第15天，第18天，第21天，第23天，第25天，第27天和第29天測量細胞TEER值。將電極兩端依次插入6孔Transwell培養(yǎng)槽各孔的上下孔中檢測電阻值，同時測定空白(未接種細胞)電阻值，最后的TEER值為扣除空白值后的電阻值與生長面積的乘積，以Ω·cm2為單位表示。

在細胞接種第3天，第6天，第9天，第12天，第15天，第18天，第21天，第23天，第25天，第27天和第29天，分別收集上、下兩側(cè)細胞培養(yǎng)基，按堿性磷酸酶測定試劑盒說明書測定上、下兩側(cè)細胞培養(yǎng)基中的堿性磷酸酶活力(金氏單位/100 mL)，計算上、下兩側(cè)細胞培養(yǎng)基中的堿性磷酸酶活力的比值。

在細胞接種的第3天，第6天，第9天，第12天，第15天，第18天，第21天，第23天，棄去Transwell 6孔板中上、下兩側(cè)細胞培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)熱的無酚紅培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中平衡30 min，然后棄去無酚紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)板上層加入含酚紅濃度為20 mg·L-1的預(yù)熱培養(yǎng)基1.5 mL，下層加入無酚紅培養(yǎng)基2.6 mL，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育3 h。取出培養(yǎng)板，收集上、下側(cè)培養(yǎng)液。取0.25 mL上、下側(cè)培養(yǎng)液加入0.5 mL 1 mol·L-1硼酸-氫氧化鈉緩沖溶液，搖勻后，以1 mol·L-1硼酸-氫氧化鈉緩沖溶液為空白，560 nm測定吸收度(OD)。

酚紅透過率=[OD下層/(OD上層+OD下層)]×100%

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用SAS(9.0)軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。方差分析差異顯著者，采用Duncan’s法比較平均數(shù)間的差異顯著性。結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示，P<0.05認為是差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察

體外培養(yǎng)的Caco-2上皮細胞為貼壁型細胞，其在培養(yǎng)瓶中呈膜狀貼壁型生長。單個細胞形態(tài)為扁平狀，呈多角形，胞體近中央可見圓形細胞核。當(dāng)將細胞接種在聚碳酯微孔濾膜上時，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，細胞會自發(fā)進行形態(tài)學(xué)上的分化，在細胞表面形成良好的刷狀緣以及在細胞間形成緊密連接，從而形成緊密的細胞單層。細胞之間緊密連接，高密度接種在第4天就能鋪成單層膜結(jié)構(gòu)，而低密度接種

圖1 Caco-2生長至第21天的顯微鏡照片(200×)

在第6天鋪成單層膜結(jié)構(gòu)，到第15天以后單層膜明顯整體呈“鋪路石樣形態(tài)”。圖1為接種在聚碳酯微孔濾膜上的細胞生長至第21天的細胞單層。

2.2 跨膜電阻值

隨著培養(yǎng)時間的延長，接種不同密度的細胞單層兩側(cè)之間的跨膜電阻也迅速增加(表1)。高密度接種第12天，TEER值超過600 Ω·cm2；第18天～第25天，TEER值增長緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定；第27天TEER值開始下降。中密度接種第15天，TEER值超過600 Ω·cm2；第18天～第27天，TEER值增長緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定；第29天TEER值開始下降。低密度接種第18天，TEER值超過600 Ω·cm2；第21～27天TEER值增長緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定；第29天TEER值開始下降。除中密度接種第27天TEER值高于其他兩個接種密度外，第3天～第25天TEER值由高到低呈現(xiàn)高密度接種、中密度接種、低密度接種的變化趨勢(P<0.01)，但第29天3種接種密度的TEER值均降低至相近數(shù)值。

2.3 堿性磷酸酶活性

隨培養(yǎng)時間的延長，上下側(cè)堿性磷酸酶活性比值也迅速增加(表2)。高密度接種第15天、中密度接種第18天和低密度接種第21天，上下側(cè)堿性磷酸酶活性比值超過10，以后繼續(xù)增加，但第29天時比值均開始降低。高、中密度接種細胞分化而具有極化的速度快，而低密度接種則有利于細胞的分化。

2.4 酚紅透過率

隨培養(yǎng)時間的延長，細胞單層的酚紅透過率逐漸降低(表3)。高密度接種第9天、中密度接種第12天和低密度接種第15天，酚紅透過率均小于0.5%，并在所測定的接種第23天保持不透過性。

表1 Caco-2細胞單層TEER值與時間的關(guān)系(n=4)

注：A,B,C,D,E,F,G,H,I同一行中具有不同上標數(shù)值間差異顯著(P<0.01)，a,b,c同一列中具有不同上標 數(shù)值間差異顯著(P<0.01)。以下同。

表2 Caco-2細胞單層上下側(cè)堿性磷酸酶活性比值與時間的關(guān)系(n=4)

表3 Caco-2細胞單層酚紅透過率與時間的關(guān)系(n=4)

3 討 論

Caco-2細胞在體外培養(yǎng)時能進行形態(tài)和功能上的分化，在結(jié)構(gòu)和功能上與小腸上皮細胞很相似，被認為是研究營養(yǎng)物質(zhì)腸道吸收最好的細胞模型之一。細胞層的緊密連接與跨上皮細胞TEER值具有密切相關(guān)，TEER值越大，說明細胞結(jié)構(gòu)致密性越好，細胞緊密連接越強。Ranaldi等[15]的研究結(jié)果表明，Caco-2細胞隨著培養(yǎng)條件的變化，其極化后的細胞層TEER值范圍在500～1 500 Ω·cm2之間。查龍應(yīng)[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TEER值達到620 Ω·cm2時，Caco-2細胞完成極化狀態(tài)。本次試驗中，高密度接種第12天、中密度接種第15天和低密度接種第18天TEER值都能達到600 Ω·cm2以上，以后趨于穩(wěn)定，說明細胞單層完成極化狀態(tài)。高密度接種在第25天、中密度接種和低密度接種在第7天以后TEER值下降，說明細胞單層開始去極化。

堿性磷酸酶是小腸刷狀緣細胞的標志性酶，細胞在生長至一定階段后，腸腔側(cè)堿性磷酸酶活性明顯提高，說明細胞生長已經(jīng)具有了極性。查龍應(yīng)[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Caco-2細胞被接種于聚碳酯微孔濾膜21天后，細胞層AP側(cè)堿性磷酸酶活性是BP側(cè)的10倍之多。本次試驗條件下研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)6天以后，細胞層AP側(cè)ALP活性顯著高于BL側(cè)，培養(yǎng)至第21天以后，AP側(cè)是BL側(cè)10倍以上，這說明堿性磷酸酶已經(jīng)在刷狀緣側(cè)聚集，細胞單層達到極化狀態(tài)。第29天堿性磷酸酶活性開始下降，說明細胞單層開始去極化。

苯酚紅為水溶性小分子物質(zhì)，不易被腸粘膜代謝且不會通過細胞膜轉(zhuǎn)運，可以間接反應(yīng)單層細胞之間緊密連接處的通透量，作為細胞單層完整性的標示物。因此本試驗采用苯酚紅做為探針藥物評價在插槽內(nèi)培養(yǎng)的Caco-2單層細胞膜的完整性。苯酚透過率小于0.5%為細胞單層形成的標志[14]。During等[12]細胞接種密度為6×104cells·cm-2接種到Transwell 6孔板上，21天后酚紅透過率接近于0。本次試驗研究發(fā)現(xiàn)，高密度接種在第9天、中密度接種在第12天、低密度接種在第15天時苯酚透過率小于0.5%，接種密度越大細胞融合成單層越快。

細胞模型構(gòu)建時間與細胞接種密度直接相關(guān)。Hilgers等[16]以6×104cells·cm-2的接種密度接種Caco-2細胞到Transwell 6孔板上，電鏡下觀察，第4天細胞融合，第7天細胞相連，第10天出現(xiàn)成熟的微絨毛，第14天細胞開始分泌糖原顆粒，第21天細胞開始深入插槽微孔膜的孔中，第28天插槽微孔膜的接受側(cè)也出現(xiàn)堿性磷酸酶，細胞出現(xiàn)去極化現(xiàn)象。Hunter等[7]以7×105cells·cm-2接種密度細胞接種Caco-2細胞到Transwell 6孔板上時, 接種后第14～15天跨膜電阻值大于300 Ω·cm2用于吸收轉(zhuǎn)運試驗。Cavet等[8]以(4.4～5.0)×105cells·cm-2的接種密度接種Caco-2細胞到Transwell 6孔板上，第14～21天細胞單層膜跨膜電阻值達到200～300 Ω·cm2時，細胞單層模型用于藥物吸收和轉(zhuǎn)運試驗。本次試驗TEER值、ALP活性和酚紅透過率等3個指標，高密度接種第15天時，酚紅透過率小于0.5%，ALP活性AP/BP側(cè)為10倍以上，TEER值已達到600 Ω·cm2以上；中密度接種第18天時，酚紅透過率小于0.5%，ALP活性AP/BP側(cè)為10倍以上，TEER值已達到600 Ω·cm2以上；低密度接種第21天時，酚紅透過率小于0.5%，ALP活性AP/BP側(cè)為10倍以上，TEER值已達到600 Ω·cm2以上。所有接種密度第29天TEER值和ALP活性均降低，因此不再適用于吸收和轉(zhuǎn)運試驗。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Effects of Cell Density on Differentiation and Depolarization of Caco-2 Cell Monolayers

(1 College of Animal Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600; 2 Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences；China)

In order to investigate the effects of cell density on differentiation and depolarization of Caco-2 cell monolayer and determine the optimal time for absorption and transport experiment, the Caco-2 cells were inoculated at a density of 1×105(high, H), 5×104(medium, M) or 3×104(low, L) cells·cm-2on six-well transwell plates and cultured for 29 days. The transepithelial electrical resistance (TEER), alkaline phosphatase activities of apical side and basolateral side, and diffusion of phenol red were measured to evaluate the integrity and permeability of cell monolayers. The results showed that the TEER value exceeded 600 Ω·cm2at 12 d, 15 d and 18 d, and decreased at 27 d, 29 d and 29 d when the cells were inoculated at a density of H, M or L, respectively. The ratios of alkaline phosphatase activities of apical side to basolateral side were more than 10 at 15 d, 18 d and 21 d when the cells were inoculated at a density of H, M or L, respectively. The diffusions of phenol red from the apical side to the basolateral side were lower than 0.5% at 9 d, 12 d and 15 d when the cells were inoculated at a density of H, M or L, respectively. According to the above three indexes, the Caco-2 cell monolayers were satisfactory from 15 d, 18 d and 21 d for absorption and transport experiment when the cells were inoculated at a density of H, M or L, respectively. The Caco-2 cell monolayers more than 27 d were no longer suitable for absorption and transport experiment because of their lower vitality.

Caco-2 cell;transepithelial electrical resistance;alkaline phosphatase;phenol red

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.03.011

國家自然科學(xué)基金項目(項目編號：31272465)。

2016-04-27; 修改稿收到日期: 2016-06-25

R329.2+7

A

1672-7983(2016)03-0066-05

唐家明(1988-)，男，碩士研究生。主要研究方向：動物營養(yǎng)生理。

*通訊作者，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師。主要研究方向：家禽礦物元素營養(yǎng)與分子生物學(xué)。E-mail：wlysz@263.net。

**通訊作者，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師。主要研究方向：動物營養(yǎng)生理。E-mail：lisufen88@aliyun.com。