基于拉曼光譜技術(shù)的枇杷果實(shí)β-胡蘿卜素含量無損測定研究

王 濤，裘正軍，張衛(wèi)正，趙艷茹，何 勇

浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058

基于拉曼光譜技術(shù)的枇杷果實(shí)β-胡蘿卜素含量無損測定研究

王 濤，裘正軍*，張衛(wèi)正，趙艷茹，何 勇

浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058

β-胡蘿卜素；枇杷；拉曼光譜；HPLC

引 言

枇杷被譽(yù)為“水果皇后”，不但多汁酸甜，口感良好，而且富含類胡蘿卜素，是人們喜愛的保健水果。β-胡蘿卜素(C40H56)屬于類胡蘿卜素，是一種橘黃色脂溶性化合物，具有廣泛的藥用價(jià)值。因此果蔬中的β-胡蘿卜素含量是衡量果蔬營養(yǎng)價(jià)值以及果蔬品質(zhì)分級的重要指標(biāo)之一。

傳統(tǒng)檢測植物內(nèi)類胡蘿卜素的方法主要是薄層層析法和高效液相色譜法(HPLC)。這些方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。無論是薄層層析法還是高效液相色譜法，都需要長時(shí)間的樣品準(zhǔn)備過程，色素的萃取提純對操作者的操作要求比較高，分離效果也會(huì)因此打折扣。因此，需要尋求一種更為簡單、快速的方法對植物體內(nèi)的類胡蘿卜素進(jìn)行測量。

光譜技術(shù)是近年來被廣泛研究的快速無損檢測技術(shù)，其在果蔬檢測和品種分類領(lǐng)域也取得了較大的成果。李占龍等利用紅外光譜和拉曼光譜對玉米種子成分進(jìn)行分析，得到了種子不同部位(胚乳、糊粉層、外層)的成分差異[1]，然而卻并未定量分析出各組分的含量差異。鄒小波等利用近紅外高光譜圖像對黃瓜葉片色素(葉綠素a，b，β-胡蘿卜素)含量進(jìn)行預(yù)測，所有建模方法得到的預(yù)測集相關(guān)系數(shù)Rp均小于0.85[2]。湯旭光等將小波分析引入高光譜數(shù)據(jù)特征量提取，用于估算大豆葉綠素含量，其反演模型預(yù)測Rp最高僅為0.776。由此可見，傳統(tǒng)的光譜學(xué)方法更多的是應(yīng)用于果蔬定性分類或分級，在定量分析上總體精度還有待提升。而高光譜雖然可以進(jìn)行定量，然而光譜信息十分龐大，波段數(shù)量多，相比波段相對確定的拉曼光譜，其對數(shù)據(jù)篩選要求高，這也是其預(yù)測模型精度未能進(jìn)一步提升的原因之一。

拉曼光譜是以拉曼效應(yīng)為基礎(chǔ)建立起來的分子結(jié)構(gòu)表征技術(shù)，其信號來源于分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，因此可以很便捷地找到特定物質(zhì)的頻移波段[13]，相比于其他光譜學(xué)繁雜的特征波段提取有巨大的優(yōu)勢。其分析方法不需要對樣品進(jìn)行前處理，也沒有樣品的制備過程，避免了一些誤差的產(chǎn)生，并且具有在分析過程中操作簡便，測定時(shí)間短，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。Schulz，Baranska和Baranski介紹了FT-Raman在現(xiàn)場檢測植物組織內(nèi)類胡蘿卜素上具有其他方法無法企及的優(yōu)越性，可以檢測到HPLC無法分辨的類胡蘿卜素的順反異構(gòu)體[3]。

在國內(nèi)利用拉曼光譜檢測活體植物內(nèi)的有機(jī)化合物的研究鮮有報(bào)道。本文通過拉曼光譜對枇杷果實(shí)進(jìn)行分析，結(jié)合高效液相色譜數(shù)據(jù)，建立枇杷果實(shí)中的β-胡蘿卜素的預(yù)測模型，實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素的定量檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)中采用的枇杷果實(shí)樣本為杭州塘棲“紅毛丫頭”，樣本采集時(shí)間分別為2014年的4月28日、5月8日和5月16日三個(gè)時(shí)間段，相對應(yīng)為枇杷果實(shí)未成熟階段、成熟初期階段以及完全成熟階段。每批樣本30個(gè)，共獲取90個(gè)樣本。將樣本置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，在實(shí)驗(yàn)前2小時(shí)取出置于室溫條件下。

實(shí)驗(yàn)采用的拉曼光譜儀為Ocean Optics公司的QE65pro采集枇杷果實(shí)的拉曼光譜，該儀器的基礎(chǔ)參數(shù)包括激光波長： 785 nm；像素總數(shù)： 1 044×64；檢測波長： 779.3～1 148.1 nm；光柵常數(shù)： H14；狹縫寬度： 50 μm。

采用高效液相色譜儀獲得枇杷果實(shí)的β-胡蘿卜素含量參考值，型號為島津公司的LC-20AD型液相色譜儀。實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑： 石油醚(沸程30～60 ℃)、甲醇(色譜純，分析純)、丙酮(分析純)、乙腈(色譜純)、三氯甲烷。所有提取液均置于-18 ℃冷凍避光保存。

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)樣品購自Sigma-aldrich公司，純度大于95%。用于提取拉曼光譜特征頻移，并為HPLC提供標(biāo)準(zhǔn)曲線取樣點(diǎn)。

1.2 拉曼光譜數(shù)據(jù)

設(shè)置拉曼光譜激發(fā)波長為785 nm，TEC溫度為-20 ℃，積分時(shí)間為5 s，平均次數(shù)2次，平滑度為3。將激光發(fā)射器置于暗箱內(nèi)，待拉曼光譜穩(wěn)定后，開始采集數(shù)據(jù)。首先測光譜儀暗場光譜并保存，扣除暗場背景后，為了減少隨機(jī)誤差，取枇杷果實(shí)樣本中心位置附近兩個(gè)受測點(diǎn)作為采樣點(diǎn)。以兩個(gè)采樣點(diǎn)均值表征該樣本的拉曼光譜，所有光譜數(shù)據(jù)均進(jìn)行了高斯平滑預(yù)處理，濾波器寬度為3。

對三個(gè)成熟階段的樣本分別進(jìn)行拉曼光譜的采集。每個(gè)樣本經(jīng)過表面干燥、去柄、編號、稱量、測直徑等預(yù)處理后，進(jìn)行拉曼光譜的測量。獲取完拉曼光譜之后，用高效液相色譜儀對樣本進(jìn)行β-胡蘿卜素的含量測定。

1.3 高效液相色譜

高效液相色譜法測量β-胡蘿卜素是標(biāo)準(zhǔn)公認(rèn)的檢測方法。先利用HPLC對不同梯度濃度的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，得到β-胡蘿卜素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后通過HPLC對枇杷果實(shí)樣品提取液進(jìn)行分析，并比對β-胡蘿卜素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線以獲得對應(yīng)樣品中β-胡蘿卜素含量的參考值。

精確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg于燒杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗滌燒杯數(shù)次，溶液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用石油醚定容，濃度為250 μg·mL-1，置于-18 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。根?jù)所需濃度取一定量的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)液用甲醇稀釋為100 μg·mL-1。β-胡蘿卜素在開始著色期間，含量都較低，因此稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度至0.1，0.5，1 μg·mL-1。

枇杷果實(shí)中β-胡蘿卜素提取液的制備過程參考國標(biāo)GB T 5009.83 2003。將所獲提取液置于-18 ℃保存，次日將樣本進(jìn)行高效液相分析。高效液相分析參數(shù)，色譜柱： Spherisorb C18柱4.6 mm×150 mm；流動(dòng)相： 甲醇+乙腈(90+10)；流速： 1.2 mL·min-1；波長： 448 nm；進(jìn)樣量： 10 μL。

以第一批次樣本為例，配置濃度梯度為： 0.02，0.1，0.5，1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)β-胡蘿卜素溶液進(jìn)行HPLC分析，

得到β-胡蘿卜素濃度(x)與高效液相色譜特征峰峰面積(y)的線性表達(dá)式：y=64 909x-1 213.8，R2為0.997，具有相當(dāng)高的線性關(guān)系。通過該表達(dá)式和HPLC積分而得到的特征峰峰面積，可以得到提取液中β-胡蘿卜素的濃度。

1.4 化學(xué)計(jì)量方法

采用了多元線性回歸(MLR)、偏最小二乘法回歸(PLSR)和最小二乘支持向量機(jī)(LS-SVM)對樣本的拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立定量模型。采用校正集相關(guān)系數(shù)(Rc)、交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)、預(yù)測集相關(guān)系數(shù)(Rp)和預(yù)測均方根誤差(RMSEP)作為比對分析與評價(jià)模型的評判標(biāo)準(zhǔn)。

多元回歸是指多個(gè)影響因素作為自變量來解釋因變量的變化，因此更適用于實(shí)際問題的研究。當(dāng)多個(gè)自變量與因變量之間是線性關(guān)系時(shí)，所進(jìn)行的回歸分析就是多元線性回歸(MLR)。

偏最小二乘法回歸(PLSR)，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)回歸建模、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)簡化以及兩組變量之間的相關(guān)性分析，從而在多個(gè)自變量中提取出系列包含最大預(yù)測效果的隱含變量(Latent Variables)，來解釋因變量。

支持向量機(jī)(SVM)通過結(jié)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)最小化原理來提高泛化能力, 能較好地解決小樣本、非線性、高維數(shù)、局部極小點(diǎn)等實(shí)際問題, 已在模式識別、信號處理、函數(shù)逼近等領(lǐng)域得到了應(yīng)用。最小二乘支持向量機(jī)(LS-SVM)是支持向量機(jī)的一種擴(kuò)展。

MLR建模輸入自變量為三個(gè)特征頻移對應(yīng)光強(qiáng)，而PLSR與LS-SVM建模的輸入自變量均為拉曼光譜所檢測到的有效頻移波段對應(yīng)光強(qiáng)，三種建模方法的輸出值均為HPLC所測得的樣本內(nèi)β-胡蘿卜素含量。擬在三種化學(xué)計(jì)量方法中取一種預(yù)測精度更高的方法來建立較為可靠的預(yù)測模型。

使用的數(shù)據(jù)處理軟件包括Unscrambler 10.1(CAMO AS, Oslo, Norway)、Matlab R2013a(The Math Works, Natick, MA, USA)，Spectrasuite(Ocean Optics，USA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜數(shù)據(jù)

通過HPLC測得各個(gè)枇杷果實(shí)提取液β-胡蘿卜素濃度，乘以稀釋倍數(shù)，可得枇杷果實(shí)中β-胡蘿卜素含量，含量分布如圖1所示。

2.2 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)樣品粉末的光譜曲線

圖1 參考值頻率分布圖

圖2 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)樣品粉末拉曼圖譜

2.3 枇杷果實(shí)原始光譜曲線

本實(shí)驗(yàn)采集的是枇杷果實(shí)800.31～2 001.92 cm-1范圍的350個(gè)拉曼光譜數(shù)據(jù)。選取90個(gè)樣品的平均光譜，所獲拉曼原始光譜曲線如圖3所示。

圖3 枇杷果實(shí)原始拉曼光譜圖

對比圖2和圖3，可以發(fā)現(xiàn)相比于β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)樣品粉末的拉曼圖譜，枇杷果實(shí)原始拉曼光譜中的3個(gè)特征頻移位置的峰并不明顯，圖譜曲線整體上漂，僅有1 521.64 cm-1處出現(xiàn)比較明顯的峰，其他兩個(gè)特征頻移位置波峰并不明顯。其原因是由于在實(shí)際采集樣本拉曼光譜時(shí)，存在較為強(qiáng)烈的熒光背景，不利于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析，因此還需要對樣本原始拉曼光譜曲線進(jìn)行適當(dāng)預(yù)處理，以便消除熒光背景的干擾。

2.4 熒光背景去除

利用拉曼光譜對樣本(尤其是有機(jī)或生物樣本)進(jìn)行分析時(shí)的一個(gè)主要問題就是熒光背景干擾特別強(qiáng)烈，使得潛在的拉曼光譜信噪比非常低[5]。而降低熒光背景干擾的方法主要分為兩類： 實(shí)驗(yàn)方法和化學(xué)計(jì)量法[9]。前者對樣本依賴性大，且成本高昂，因此多選擇化學(xué)計(jì)量法對拉曼光譜進(jìn)行背景扣除。本文所采用多項(xiàng)式擬合(PF)。PF(polynomial fitting)，是一種非線性擬合工具，對于許多不規(guī)則的函數(shù)曲線有比較好的擬合效果[10，14]。當(dāng)其被應(yīng)用到拉曼光譜背景扣除中的時(shí)候，因?yàn)槠鋽M合優(yōu)劣由多項(xiàng)式階數(shù)決定。因此需要分析人員人工剔除拉曼光譜中“非對象”譜線，并且選擇合適的多項(xiàng)式階數(shù)以確保擬合效果。利用PF對截取的可用部分(800.31～2 001.92 cm-1)拉曼光譜進(jìn)行分析，多項(xiàng)式階數(shù)為5。扣除熒光背景后的枇杷果實(shí)拉曼光譜如圖4所示。

圖4 枇杷果實(shí)多項(xiàng)式擬合拉曼光譜圖

圖4中可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過處理的拉曼光譜出現(xiàn)3個(gè)較為明顯的峰值，波數(shù)分別為1 521.64, 1 159.14和982.88 cm-1，表明采用PF去除枇杷果實(shí)拉曼光譜熒光背景的方法是可行的。比較圖2和圖4，發(fā)現(xiàn)在枇杷果實(shí)樣本中觀測到的特征信號與純?chǔ)?胡蘿卜素拉曼峰的位置稍有差異，這種轉(zhuǎn)變的原因可能是植物內(nèi)在類胡蘿卜素與植物基質(zhì)相互作用[11]，改變了他們的化學(xué)形態(tài)或物理結(jié)構(gòu)，從而影響了特征拉曼譜帶的波數(shù)位置[7-8]。本實(shí)驗(yàn)中采用了3個(gè)成熟階段的枇杷果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)對象，圖5顯示了3個(gè)成熟階段枇杷果實(shí)的拉曼圖譜，可以發(fā)現(xiàn)成熟枇杷果實(shí)的拉曼散射峰值較高，推測是由于完全成熟的枇杷果的β-胡蘿卜素含量較高。

2.5 建立模型

由于第一批枇杷果實(shí)處于未成熟階段，其β-胡蘿卜素含量極低，部分樣本中β-胡蘿卜素含量低于HPLC的檢測限(約為0.05 μg·g-1)，因此無法得到這部分的參考值，所以在建模過程中將這部分樣本剔除(共計(jì)23個(gè))。目的是建模和預(yù)測集數(shù)據(jù)的選擇更具有代表性，將剩余樣本按濃度升序排列，以校正集與預(yù)測集比例2∶1，均勻提取數(shù)據(jù)，并保證濃度最小和濃度最大的兩個(gè)樣品包含于校正集中，從而構(gòu)成校正集(共計(jì)45個(gè))和預(yù)測集(共計(jì)22個(gè))，見表1。所有建模光譜數(shù)據(jù)來源見1.2節(jié)。

圖5 三個(gè)成熟階段平均拉曼圖譜(背景扣除后)

表1 校正集和預(yù)測集描述

2.5.1 MLR

圖6 MLR預(yù)測值與參考值線性擬合圖

2.5.2 PLSR

圖7 PLSR預(yù)測值與參考值線性擬合圖

2.5.3 LS-SVM

圖8 LS-SVM預(yù)測值與參考值線性擬合圖

2.6 MLR，PLSR，LS-SVM模型的比較

表2 β-胡蘿卜素三種模型校正集與預(yù)測集結(jié)果

3 結(jié) 論

利用拉曼光譜對枇杷果實(shí)內(nèi)β-胡蘿卜素的含量進(jìn)行預(yù)測。建模結(jié)果表明以可用光譜段建立的LS-SVM模型預(yù)測結(jié)果最為精確，其預(yù)測相關(guān)系數(shù)Rp達(dá)到0.91，可以成功實(shí)現(xiàn)較為精準(zhǔn)的預(yù)測活體枇杷內(nèi)β-胡蘿卜素的含量的目的。相比其他光譜學(xué)方法，本文利用拉曼光譜對植物活體檢測具有易于攜帶、操作簡單、分析快速以及預(yù)測精度高等優(yōu)點(diǎn)，也對未來研制果蔬類胡蘿卜素快速、無損、現(xiàn)場檢測設(shè)備提供了一定的參考，為拉曼光譜檢測技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)以及安全檢測領(lǐng)域的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。

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*Corresponding author

(Received Apr. 20, 2015; accepted Aug. 11, 2015)

Study on Non-Detective Determination of β-Carotene Content in Loquats with Raman Spectroscopy

WANG Tao, QIU Zheng-jun*, ZHANG Wei-zheng, ZHAO Yan-ru, HE Yong

College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

In china，researches on Raman spectroscopy in terms of foodstuff mainly focus on carbohydrates, fatty acids, proteins and vitamins. Conventional methods for determining the carotenoids content require the extraction of the samples as well as other cleanup steps. In this work，Raman spectroscopy is applied to get the measured value form loquats with different mature stage which are compared with the reference value get from High Performance Liquid Chromatography (HPLC)，in order to find new，fast，and nondestructive calibration methods for quantification of β-carotene content in loquat fruits. Least Squares Support Vector Machine and Partial least squares data processing methods are used to analyze the Raman spectra while PLS model has a prediction quality with the correlation coefficient of 0.845; the root-mean-square error of 0.022 μg·g-1and LS-SVM model has a better prediction quality with the correlation coefficient of 0.910 with the root-mean-square error of 0.058 μg·g-1.

β- Carotenoids；Loquats；Raman spectroscopy；HPLC

2015-04-20，

2015-08-11

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD04B04)資助

王 濤，1992年生，浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院博士研究生 e-mail: wtxjzx0330@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: zjqiu@zju.edu.cn

O657.3；S667.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)11-3572-06