CYP450酶基因多態(tài)性對丙戊酸血藥濃度的影響

張，徐善森，劉長文，楊帆，陳亞南，肇麗梅Δ

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110004；2.東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，遼寧 沈陽 110869)

CYP450酶基因多態(tài)性對丙戊酸血藥濃度的影響

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110004；2.東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，遼寧 沈陽 110869)

目的 探究CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6基因多態(tài)性對單用丙戊酸(Valproic acid，VPA)治療的癲癇患兒血藥濃度的影響。方法 收集單用VPA治療的癲癇患兒400例，記錄患兒的年齡、性別、體質(zhì)量、日服藥劑量等基本信息；應(yīng)用熒光偏振免疫法(fluorescence polarigation immunoassay，F(xiàn)PIA)測定VPA血藥濃度；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增目的片段，分別采用直接測序法、巢式PCR法和質(zhì)譜法檢測CYP2C9*3、 CYP2A6*4和CYP2B6*6位點的基因型。應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)考查基因多態(tài)性對VPA血藥濃度的影響。結(jié)果 400例癲癇患兒CYP2C9*3、CYP2A6*4、CYP2B6*6的等位基因頻率分別為2.75%、6.50%、23.00%，其中CYP2C9*3和CYP2A6*4基因多態(tài)性可以顯著升高VPA標(biāo)準(zhǔn)化血藥濃度(concentration dose ratio，CDRVPA)(P=0.024；P=0.000)，但CYP2B6*6基因多態(tài)性對CDRVPA的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.95)。結(jié)論 CYP2C9*3和CYP2A6*4等位基因多態(tài)性均能影響CDRVPA，因此CYP2C9*3和(或)CYP2A6*4等位基因攜帶的患兒VPA使用劑量應(yīng)低于常規(guī)劑量，以避免發(fā)生不良反應(yīng)。

丙戊酸；CYP450酶；基因多態(tài)性；血藥濃度

丙戊酸(Valproic acid，VPA)是臨床廣譜抗癲癇藥物，相對于其它抗癲癇藥物，VPA療效高，耐受性較好，但其體內(nèi)代謝受多種因素影響，個體差異較大，需要監(jiān)測血藥濃度，進(jìn)行個體化給藥治療[1]。VPA是簡單的支鏈脂肪酸，主要經(jīng)細(xì)胞色素P450酶(CYP450)、線粒體β-氧化和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase，UGT)3種途徑代謝[2]。

近年來，隨著藥物基因組學(xué)和遺傳藥理學(xué)的發(fā)展，針對VPA在藥物代謝過程中的個體差異和代謝酶基因多態(tài)性的研究也較多。研究表明[3-7]：在CYP450代謝途徑中，CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6是代謝VPA的主要酶，其基因多態(tài)性與丙戊酸的代謝密切相關(guān)，且野生型CYP2C9*1、CYP2A6*1、CYP2B6*1代謝丙戊酸的能力明顯強于突變型CYP2C9*3、 CYP2A6*4和CYP2B6*6。VPA清除率下降，在體內(nèi)蓄積，可能會誘發(fā)不良反應(yīng)，如肉毒堿減少、血氨增加、血象異常等[8]。同時，也有研究證實[9-10]，VPA的肝毒性代謝產(chǎn)物主要經(jīng)CYP途徑產(chǎn)生。然而，國內(nèi)關(guān)于癲癇患兒體內(nèi)CYP酶基因多態(tài)性對VPA代謝影響的報道較少。本研究旨在通過分析單用VPA的癲癇患兒CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6的基因多態(tài)性對VPA血藥濃度的影響，以期為臨床合理用藥提供參考，從而減少不良反應(yīng)的發(fā)生，實現(xiàn)個體化治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月～2015年7月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)VPA血藥濃度監(jiān)測的患兒血樣，共400例。其中男212例，女188例；患兒平均年齡(8.05±6.28)歲，平均體質(zhì)量(18.28±8.81)kg，平均日服藥劑量/每公斤體重為(16.90±6.53)mg/kg。

入組標(biāo)準(zhǔn)：①臨床和腦電圖檢查均符合癲癇診斷；②單用丙戊酸治療且服藥3個月以上，血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平；③肝、腎功能指標(biāo)正常；④體重指數(shù)(BMI)在18～24范圍內(nèi)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①非癲癇性發(fā)作，如假性發(fā)作；②顱腦CT或MRI提示有進(jìn)行性腦部器質(zhì)性疾病，如炎癥腫瘤變性疾病者；③不能完成長期隨訪的患兒。

1.2 方法 患兒服用VPA達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度(經(jīng)過4～5個半衰期；丙戊酸的半衰期為7～10h)后，于次日服藥前采集靜脈血2～3 mL(穩(wěn)態(tài)谷濃度)于采血管中，分離血清，采用熒光偏振免疫法(FPIA，美國雅培公司)測定VPA的血藥濃度，質(zhì)控誤差<5%。

DNA抽提采用經(jīng)典的酚-氯仿法，提取DNA后測定OD值(A260/A280≈1.8)，檢測DNA水平。

CYP2C9*3擴增產(chǎn)物采用直接測序方法(北京六合華大生物科技股份有限公司)，根據(jù)不同峰圖判斷基因型。CYP2A6*4基因分型采用巢式PCR[11]，采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，CYP2C9*3和CYP2A6*4位點引物序列見表1?；靹蚝蟮姆磻?yīng)體系放入TaKaRa PCR擴增儀進(jìn)行擴增，產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。CYP2B6*6的基因分型采用質(zhì)譜法-MALDI-TOF system(上海生工生物工程股份有限公司)檢測。

為排除患兒體質(zhì)量對VPA血藥濃度的影響，將血藥濃度的測定結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化血藥濃度(concentration dose ratio，CDR)=VPA血藥濃度/(日劑量/體質(zhì)量)。

表1 CYP2C9*3和CYP2A6*4基因多態(tài)性位點引物序列

2 結(jié)果

2.1 CYP2C9*3基因分型 CYP2C9*3位點PCR產(chǎn)物及測序結(jié)果見圖1。

圖1 CYP2C9 *3位點PCR產(chǎn)物及基因測序結(jié)果圖Ⅰ：PCR產(chǎn)物的電泳圖；Ⅱ：CYP2C9 *3位點的測序圖，A：野生純合型(AA)；B：突變雜合型(AC)Fig.1 PCR products and sequencing results of CYP2C9 *3 gene Ⅰ:Electro phoresis results of PCR products;Ⅱ:Sequencing results of CYP2C9*3，A:wild homozygous type(AA);B:Mutant hybrid type(AC)

2.2 CYP2A6*4基因分型 CYP2A6*4位點PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。其中1～3、4～6、7～9泳道分別為3例患者的3次PCR產(chǎn)物。分析可知1～3泳道患者基因型為CYP2A6*1/*1，4～6泳道患者基因型為CYP2A6*4/*4，7～9泳道患者基因型為CYP2A6*1/*4。

圖2 CYP2A6*4基因巢式PCR產(chǎn)物電泳圖M：DL2000 marker；1、4、7：PCRⅠ反應(yīng)產(chǎn)物；2、5、8：引物8F6和R2反應(yīng)產(chǎn)物，即CYP2A6*1；3、6、9：引物8F7和R2的反應(yīng)產(chǎn)物，即CYP2A6*4Fig.2 Nested PCR products of CYP2A6*4 geneM:DL2000 marker;1,4,7:PCRⅠproducts;2,5,8:products(CYP2A6*1) of primer 8F6 and R2;3,6,9:products (CYP2A6*4) of primer 8F7 and R2

2.3 CYP2B6*6基因分型 CYP2B6*6質(zhì)譜法基因分型結(jié)果見圖3、圖4。

圖4 CYP2B6*6 785A>G位點質(zhì)譜圖A：CYP2B6 A785G野生型；B：CYP2B6 A785G突變雜合型；C：CYP2B6 A785G突變純合型Fig.4 Mass spectrogram of CYP2B6*6 785A>G siteA:CYP2B6 A785G wild type;B:CYP2B6 A785G mutant hybrid type;C:CYP2B6 A785G mutant homozygous type

2.4 CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6基因型分布 癲癇患兒CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。各SNP位點等位基因、基因型分布情況見表2。CYP2C9*3等位基因頻率為2.75%，CYP2A6*4等位基因頻率為6.50%，CYP2B6*6等位基因頻率為23.00%。

表2 CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6位點等位基因和基因型頻率分布

2.5 不同基因型對VPA血藥濃度以及CDRVPA的影響 VPA血藥濃度在CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6 3種基因型中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.46，P=0.75，P=0.62)。但CYP2C9*1/*3基因型的CDRVPA顯著高于CYP2C9*1/*1(P=0.024)；CYP2A6*4/*4基因型的CDRVPA顯著高于CYP2A6*1/*4和CYP2A6*1/*1(P=0.000)；而CYP2B6*6的3種基因型對CDRVPA并無影響(P=0.95)。見表3。

表3 癲癇患兒基因型與血藥濃度的關(guān)系(n=400)

3 討論

本研究考察了VPA的CYP代謝途徑中主要代謝酶CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6在400例癲癇患兒中CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6等位基因及基因型頻率的分布，結(jié)果顯示，3個等位基因頻率分別與文獻(xiàn)上報道的亞洲人頻率2%～5%[12]、6.7%～24.2%[13]以及中國漢族人頻率18.4%較為一致[14]，并未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*3/*3純合突變。

CYP2C9基因位于人染色體10q24.2上，全長約50.71kb，有9個外顯子，8個內(nèi)含子，編碼490個氨基酸殘基。CYP2C9*3是外顯子7的第1075基因座上的堿基A突變?yōu)镃，結(jié)果致使酶的活性降低[15]。CYP2A6具有遺傳多態(tài)性，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了30余種等位基因，在東方人中頻率較高的是CYP2A6*1A、CYP2A6*1B、CYP2A6*4和CYP2A6*9[11,16-17]。有研究證實，CYP2A6*4等位基因在亞洲人中的突變率較高，CYP2A6*4(包括 *4A、 *4B、*4C和*4D)等位基因是CYP2A6基因的整體缺失，源于高度相似的CYP2A6與CYP2A7基因的不平等交換(從內(nèi)含子8到3’端)，導(dǎo)致CYP2A6酶活性喪失[18]。人CYP2B6由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成，全長2.8kb，編碼由491個氨基酸組成的功能蛋白。CYP2B6自發(fā)現(xiàn)以來，因蛋白含量及催化活性呈明顯的個體差異[19]，其基因多態(tài)性受到關(guān)注。至今已確定了CYP2B6的29個等位基因，發(fā)現(xiàn)了100多個單核苷酸多態(tài)性突變。CYP2B6*6包含2個突變位點，即4號外顯子上的G516T和5號外顯子上的A785G，在我國漢族人中的突變率分別約為0.21和0.28。

CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6是VPA代謝產(chǎn)生肝毒性代謝產(chǎn)物的主要代謝酶[10,20]，因此，探究其基因多態(tài)性與VPA血藥濃度的相關(guān)性具有重要的意義。慢代謝型(CYP2C9*1/*3、CYP2A6*1/*4&*4/*4、CYP2B6*1/*6&*6/*6)使VPA的清除率下降，導(dǎo)致患兒體內(nèi)VPA蓄積，肝毒性代謝物增多，易誘發(fā)肝損傷等不良反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，CYP2C9*3和CYP2A6*4的患兒CDRVPA顯著升高，與前人研究較一致[5,21-22]。而CYP2B6*6 的3種基因型對應(yīng)的CDRVPA差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻(xiàn)報道相反。分析原因有以下2點：其一，譚蘭等[23]的研究，病例數(shù)較少，僅70例，可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；其二，Kiang等[24]通過探討肝微粒體中CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6對VPA代謝的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CYP2C9生成4-ene-VPA、4-OH-VPA和5-OH-VPA的速率較快，經(jīng)CYP2A6生成3-OH-VPA的速率較快，而CYP2B6對代謝物生成的貢獻(xiàn)并不占主導(dǎo)地位，因此猜測VPA經(jīng)CYP2B6代謝的比例較小，從而導(dǎo)致本研究并未發(fā)現(xiàn)CYP2B6*6對CDRVPA有顯著影響。

本研究首次考察了在口服VPA的中國漢族癲癇患兒CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6基因型情況對血藥濃度的影響。在臨床使用VPA治療時，如患兒攜帶CYP2C9*3和/或CYP2A6*4，建議先給予較小的VPA劑量，并定期監(jiān)測血藥濃度，以免因VPA濃度過高而引起不良反應(yīng)。

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(編校：吳茜)

Effects of CYP450 enzymes polymorphisms on plasma Valproic acid concentration

ZHANG Ti1, XU Shan-sen1, LIU Chang-wen2, YANG Fan1, CHEN Ya-nan1, ZHAO Li-mei1Δ

(1.Department of Pharmacy, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China; 2.Northeast Pharmaceutical Group Shenyang NO.1 Pharmaceutical CO., LTD, Shenyang 110869, China)

ObjectiveTo investigate the effects of genetic polymorphisms(CYP2C9，CYP2A6 and CYP2B6) on the concentration of Valproic acid in the epileptic children.MethodsA total of 400 cases were collected in our study. PCR, nest-PCR and direct sequencing were applied to identify the frequency of CYP2C9*3,CYP2A6*4 and CYP2B6*6. One-way ANOVA was used to analyze the influence of the SNPs on CDRVPA.ResultsThe frequencies of allele CYP2C9*3，CYP2A6*4，CYP2B6*6 were 2.75%，6.50%，23.00% respectively. The CDRVPAin epileptic children with allele CYP2C9*3 and CYP2A6*4 were significantly higer than that in children with the wild type(P=0.024;P=0.000), there was no significant difference between the epileptic children with allele CYP2B6*6 and wild type(P=0.095).ConclusionThe CDRVPAis affected by the SNPs of CYP2C9*3 and CYP2A6*4. The dosage of VPA in epileptic children with alleles CYP2C9*3 and CYP2A6*4 should be lower in case of adverse reaction.

Valproic acid; CYP450 enzyme; polymorphism; plasma concentration

國家自然基金(81302857)；遼寧省自然科學(xué)基金(2013021079)

張媞，女，碩士，研究方向：臨床藥理學(xué)，E-mail：zhangti0801@163.com；肇麗梅，通信作者，教授、博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物基因組學(xué)、藥代動力學(xué)、體內(nèi)藥物分析學(xué)等，E-mail：zhaolm@sj-hospital.org。

R969

A

1005-1678(2016)02-0001-04