單增李斯特菌膜裂解相關(guān)基因缺失突變株的構(gòu)建及生物學特性鑒定

江玲麗，高有領，周向陽，白　帆，方　春，錢國英*，方維煥

(1.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，寧波 315100；2.浙江萬里學院，寧波 315100；3.舟山出入境檢驗檢疫局，舟山 316000；4.浙江大學動物預防醫(yī)學研究所，杭州 310058)

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單增李斯特菌膜裂解相關(guān)基因缺失突變株的構(gòu)建及生物學特性鑒定

江玲麗1，高有領2，周向陽3，白帆4，方春4，錢國英2*，方維煥4

(1.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，寧波 315100；2.浙江萬里學院，寧波 315100；3.舟山出入境檢驗檢疫局，舟山 316000；4.浙江大學動物預防醫(yī)學研究所，杭州 310058)

摘要：擬探明單核細胞增多性李斯特菌(單增李斯特菌)分離株M7可能的低致病力機制。利用SOE-PCR及同源重組法構(gòu)建M7膜裂解相關(guān)基因hly及plcB單缺失(M7-Δhly和M7-ΔplcB)及雙缺失突變株(M7-Δhly/plcB)，比較它們與親本株的生物學特性差異。結(jié)果如下：PCR及反轉(zhuǎn)錄PCR表明突變株構(gòu)建成功。突變株M7-Δhly和M7-Δhly/plcB因hly缺失致其溶血活性喪失。plcB缺失突變株M7-ΔplcB和M7-Δhly/plcB無可見溶脂活性。單缺失突變株M7-ΔplcB、M7-Δhly與M7具有相似的細胞黏附及增殖能力(P>0.05)。MOI為1 000時，雙缺失突變株M7-Δhly/plcB對Caco-2細胞毒性最低(11.10%)，M7-Δhly次之(23.53%)(P<0.05)?？瞻咴囼灡砻骶闙7和M7-ΔplcB僅能在無慶大霉素培養(yǎng)基中形成空斑。hly及plcB缺失致單增李斯特菌對免疫抑制小鼠毒力降低。單增李斯特菌M7低致病力可能與hly及plcB的高水平表達有關(guān)，致細菌對宿主細胞毒性增強而從細胞內(nèi)逸出，使其不能躲避宿主免疫系統(tǒng)而被清除。

關(guān)鍵詞：單增李斯特菌；膜裂解相關(guān)基因；細胞毒性；生物學特性

單核細胞增多性李斯特菌(簡稱單增李斯特菌)為重要的食源性病原菌，可致胃腸炎、敗血癥、腦炎和腦膜炎，老人、兒童和免疫抑制人群最易感，孕婦感染后致流產(chǎn)。雖然發(fā)生率不高，但死亡率較高[1]。單增李斯特菌在自然界廣泛存在，在土壤、水、廢水、農(nóng)場、植物表面及食品加工表面等環(huán)境中營腐生生活[1]。此外作為胞內(nèi)菌，單增李斯特菌在巨噬細胞中具備強大的存活能力；能侵襲入非吞噬細胞(如肝細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞等)并能高效復制和增殖[2]。單增李斯特菌的細胞內(nèi)感染過程主要包括：1)由內(nèi)化素A和B(InlA和InlB)主導的黏附與侵襲；2) 由溶血素O(LLO)以及磷脂酶A和B(PLcA和PLcB)協(xié)同作用逃離吞噬體并逸入細胞質(zhì)中；3)在肌動蛋白ActA和內(nèi)化素C(InlC)的介導下實現(xiàn)細胞間的擴散。上述毒力因子主要由轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PrfA所調(diào)控[3-4]。

LLO由hly基因編碼，為單增李斯特菌主要毒力因子，屬于膽固醇依賴型膜穿孔蛋白家族(CDCs)，通過插入它的蛋白疏水區(qū)到宿主細胞膜的磷脂雙層，進而破壞宿主細胞吞噬體膜，為細菌逸入細胞質(zhì)中增殖所必需[5]。在小鼠模型中，感染初期LLO能引發(fā)樹突細胞及淋巴細胞的凋亡[6]。在變形蟲等原生動物模型中，單增李斯特菌能抑制纖毛蟲四膜蟲生長并加速其胞囊形成，究其原因主要與LLO的消化性空泡裂解有關(guān)[7]。

此外，單增李斯特菌分泌的磷脂酶PLcA和PLcB參與吞噬體膜的裂解和細菌逃逸。PLcA和PLcB分別屬于磷脂酰肌醇特異性磷脂酶(PI-PLC)和廣譜磷脂酶(PC-PLC)。PC-PLC(編碼基因plcB)主要以協(xié)同LLO的方式參與吞噬體膜的裂解，為單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌、綠膿桿菌等胞內(nèi)菌主要的毒力因子[8]。有研究表明，結(jié)核分枝桿菌主要通過磷脂酶對宿主細胞產(chǎn)生毒性，致宿主細胞壞死[8]。

在前期研究中，作者分離到單增李斯特菌M7，該菌株具有強溶血、溶脂活性，較高的細胞黏附及侵襲能力，但在小鼠模型及體外培養(yǎng)細胞空斑試驗中毒力較弱[9-10]。因而是否可能因為該菌株的強溶血及溶脂活性致細菌對宿主細胞毒性增強，致宿主細胞裂解，因而細菌不能躲避宿主的免疫系統(tǒng)攻擊而被清除，從而呈現(xiàn)低毒力？本研究旨在構(gòu)建與吞噬體膜裂解相關(guān)基因hly與plcB單基因(全基因)缺失突變株(M7-Δhly、M7-ΔplcB)及雙基因(全基因)缺失突變株M7-Δhly/plcB，通過研究突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB、M7-Δhly/plcB的細胞毒性、細胞黏附率、細胞內(nèi)增殖能力及對小鼠致病力等生物學特性，進而為闡明M7低致病力的可能機制奠定重要基礎。

1材料與方法

1.1菌株，質(zhì)粒，培養(yǎng)基，試劑和引物

大腸桿菌 DH5α及質(zhì)粒pUC18、單增李斯特菌消毒奶分離株M7系本實驗室保存。李斯特菌培養(yǎng)基TSB-Y和BHI購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司。單增李斯特菌標準菌株EGD由丹麥哥本哈根大學Jakobsen教授惠贈，穿梭質(zhì)粒pKSV7由美國康奈爾大學Wiedmann博士惠贈。T4多聚核苷酸激酶、DNA連接試劑盒、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ購自TaKaRa寶生物(大連)公司，dNTPs、SuperTaq購自上海申能博彩生物技術(shù)有限公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、UNIQ-10膠回收試劑盒購于AXYGEN公司，慶大霉素、TaqDNA聚合酶購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。中性紅、Triton X-100購自美國Sigma公司，細胞培養(yǎng)基DMEM、RPMI 1640(不含酚紅)購自美國Gibco公司，細胞毒性試劑盒CytoTox96購自美國Promega公司。本文中涉及的引物均由英濰捷基 (上海)貿(mào)易有限公司合成(表1)。

表1本試驗所涉及的引物列表

Table 1Primers used in the current study

引物Primer序列(5'-3')Sequence(5'-3')擴增長度/bpProductlengthhly-ahly-bATAAGCTTTAATATCGATGTACCGTATTCCTGCTT(HindⅢ)aTTATTACTTTTAAAAGGGTTTCACTCTCCTTCTAC581hly-chly-dTTTTAAAAGTAATAAAAAATTAAGAATAAAACCGCTTCAGAATTCTCCATTTATGAAAGTGATTTTATTATC(EcoRⅠ)650hly-ID2CATGTAGTGGCCTCTGGAGCAAT3156or1566plcB-aplcB-bGGGAAGCTTCCAAAGCTAGCAGCACTTCC(HindⅢ)ATCACTCACCTCACTTTTTTCTTTCAT444plcB-cplcB-dAGTGAGGTGAGTGATCAATATTTAGGAATGCATTCCGCGAATTCCTAACAAACCGCACTATTACAATAG(EcoRⅠ)512plcB-ID2CACTCAATCTCCTTTGCATCGCTTA2053or1183

a下劃線部分表示引入的酶切位點

aThe underlined sequences indicate the introduced restriction enzyme cutting site

1.2實驗動物與細胞系

ICR小鼠購自浙江省中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心。L929細胞由浙江省醫(yī)學科學院戴方韋女士惠贈，HeLa細胞由浙江大學動物科學學院孫紅祥教授惠贈，Caco-2細胞系本實驗室保存。

1.3突變株的構(gòu)建

參照課題組已經(jīng)建立的同源重組方法[11-12]，構(gòu)建hly全基因和plcB全基因單缺失突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB及雙基因缺失突變株M7-Δhly/plcB。首先在靶基因hly和plcB兩端外側(cè)分別設計兩對引物(標記為引物a、b、c、d，并在引物a和d中分別引入HindⅢ和EcoR Ⅰ酶切位點)(表1)。利用基因切割和重疊延伸(SOE)PCR方法[13]擴增出hly-ad和plcB-ad靶基因片段，克隆于pUC18，構(gòu)建成pUC-hly-ad和pUC-plcB-ad，經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ酶切及PCR鑒定后，再利用pUC18和pKSV7質(zhì)粒中相應的酶切位點，將目的片段亞克隆于穿梭質(zhì)粒pKSV7，構(gòu)建重組質(zhì)粒pKSV7-hly-ad和pKSV7-plcB-ad。

將重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-hly-ad 和pKSV7-plcB-ad電轉(zhuǎn)化入野生型M7菌株，通過溫度和氯霉素抗性壓力的雙重篩選實現(xiàn)同源重組[11]，將目的基因片段整合于M7基因組中，經(jīng)PCR及RT-PCR鑒定，獲得兩個單基因缺失突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB。此外，將重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-hly-ad電轉(zhuǎn)入突變株M7-ΔplcB感受態(tài)細胞中，通過溫度和氯霉素抗性壓力實現(xiàn)同源重組，經(jīng)PCR及RT-PCR鑒定，構(gòu)建膜裂解相關(guān)基因hly和plcB雙基因缺失的突變株M7-Δhly/plcB。

1.4溶脂活性試驗

卵黃瓊脂試驗參照本實驗室優(yōu)化的方法進行[12]，卵黃瓊脂平板為BHI平板經(jīng)高壓滅菌冷卻至55 ℃加入5%的卵黃懸液配制而成。將突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB、M7-Δhly/plcB劃線接種至卵黃瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.5溶血活性試驗

按照T.Ono等建立的方法進行[14]。設PBS為陰性對照，陽性對照為終濃度0.2% 的Triton X-100。以各菌株在每個時間點的OD570 nm值與陰性對照OD570 nm的差值為縱坐標繪制圖表，以比較各突變株及其親本株的溶血活性。

此外，劃線接種突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB、M7-Δhly/plcB和親本株M7到含5%綿羊血的BHI平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h以觀察其溶血現(xiàn)象。

1.6HeLa細胞黏附及細胞內(nèi)增殖試驗

按本實驗室優(yōu)化的方法[12，15]進行。突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB和親本株M7過夜培養(yǎng)物調(diào)整OD600 nm至0.12左右(約1×108cfu·mL-1)，以1∶10與DMEM培養(yǎng)液混合，以每孔0.3 mL(12孔板)加入到融合度為80%左右的HeLa單層細胞中，在37 ℃、5%CO2感染1 h后加入100 μg·mL-1慶大霉素以殺滅細胞外細菌，PBS洗滌兩次后，換用含10 μg·mL-1慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液(2%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)至12 h，用0.1% Triton-100和0.25%胰酶裂解細胞，細胞裂解液10倍梯度稀釋后于BHI平板上進行細菌計數(shù)。黏附率計算公式：CFUrec/CFUadded×100(其中CFUrec表示細胞裂解后的細菌數(shù)，CFUadded代表加入孔內(nèi)的實際細菌數(shù))。細胞內(nèi)增殖則用12 h的細胞裂解數(shù)與慶大霉素作用1 h后的細胞裂解數(shù)之間的對數(shù)差值表示。采用SPSS軟件(IBM SPSS statistics 19)對突變株及親本株的黏附和細胞內(nèi)增殖進行統(tǒng)計學分析(P<0.05表明統(tǒng)計學差異顯著)。

1.7細胞毒性試驗

按照Y.R.Kim等[16]建立的方法進行。采用Cytotox 96?非放射性細胞毒性檢測試劑盒，通過測定感染細胞培養(yǎng)上清液中的乳酸脫氫酶含量確定各菌株對Caco-2細胞的毒性。設置細菌與Caco-2細胞比例(MOI)分別為1 000、100、10，每個菌株包含3個重復，設標準菌株EGD為陽性對照。細胞毒性計算公式為細胞毒性=(OD試驗孔-OD空白孔)/(OD陽性孔-OD空白孔)。采用SPSS軟件(IBM SPSS statistics 19)進行統(tǒng)計學分析(P<0.05表明統(tǒng)計學差異顯著)。

1.8L929細胞空斑試驗

參照實驗室優(yōu)化的方法進行[12，17-18]，調(diào)整各單增李斯特菌突變株及親本株M7細菌濃度至1×108cfu·mL-1，以每孔5 μL加入至融合度為80%左右的L929單層細胞中，37 ℃、5% CO2感染1 h，經(jīng)0.01 mol·L-1PBS (pH 7.4)洗滌3次后，覆蓋3 mL含0.7%瓊脂糖和含20 μg·mL-1慶大霉素的DMEM，同時設立不含慶大霉素處理組。待出現(xiàn)可見空斑(2～3 d)覆蓋2 mL含0.7%瓊脂糖和0.01%中性紅的DMEM并拍照，以標準菌株EGD為陽性對照。

1.9小鼠毒力試驗

參照本實驗室方法[12]建立小鼠免疫抑制模型，比較突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB、M7-Δhly/plcB和親本株M7對ICR小鼠毒力的差異，以強毒參考菌株EGD為陽性對照。20～22 g ICR正常雌性小鼠腹腔注射角叉膠(200 mg·kg-1)，24 h后收集各菌株過夜培養(yǎng)物，經(jīng)PBS重懸調(diào)整濃度至109cfu·mL-1(OD600 nm值為1.2)，10倍梯度稀釋后進行平板計數(shù)以確定實際接種量。選取100～10-5稀釋度腹腔接種小鼠，劑量為0.1 mL，每組接種6只小鼠，同時設PBS陰性對照組。連續(xù)觀察10 d，每天記錄小鼠死亡情況，改良寇氏法計算LD50(LD50= log-1[Xm-i(∑P-0.5)]，其中Xm為最大劑量的對數(shù)值；i為相鄰兩組劑量對數(shù)值之差；P代表各組小鼠死亡率，用小數(shù)形式表示；∑P代表各組小鼠死亡率總和)。

2結(jié)果

2.1突變株構(gòu)建與鑒定

提取可疑重組菌的基因組DNA，于引物d外側(cè)區(qū)域設計一條引物分別為hly-ID2(hly缺失突變株)和plcB-ID2(plcB缺失突變株)進行PCR鑒定。結(jié)果表明野生型菌株能獲得3 156和2 053 bp條帶(圖1第3泳道，圖2第3泳道)，而M7-Δhly、M7-ΔplcB的擴增片段大小分別為1 566和1 183 bp條帶(表1，圖1第1泳道，圖2第1泳道)，表明突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB已成功構(gòu)建。雙基因缺失突變株M7-Δhly/plcB的鑒定如前，以該菌株的基因組DNA為模板，以hly-a/hly-ID2及plcB-a/plcB-ID2為引物對，同時擴增hly和plcB引物 a和d外側(cè)片段，結(jié)果表明該雙基因缺失突變株M7-Δhly/plcB成功構(gòu)建(圖1、2，第2泳道)。對突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB和M7-Δhly/plcB反轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明野生型菌株M7能得到相應的hly(1 590 bp)或plcB(870 bp)目的片段(圖3、4，第3泳道)，而突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB、M7-Δhly/plcB和陰性對照均無相應片段的擴增(圖1、2，第1、2和4泳道)，表明毒力基因hly或(和)plcB已成功缺失。

M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1.單缺失突變株M7-Δhly的PCR擴增；2.雙缺失突變株M7-Δhly/plcB的PCR擴增；3.親本株M7的PCR擴增；4.陰性對照M.DL5000 DNA marker；1.PCR amplification from single mutant M7-Δhly；2.PCR amplification from double mutant M7-Δhly/plcB；3.PCR amplification from the wild type strain M7；4.Negative control圖1　hly缺失突變株(M7-Δhly、M7-Δhly/plcB)的PCR鑒定Fig.1　PCR identification of L.monocytogenes mutants with hly full gene deletion

M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1.單缺失突變株M7-ΔplcB的PCR擴增；2.雙缺失突變株M7-Δhly/plcB的PCR擴增；3.親本株M7的PCR擴增；4.陰性對照M.DL5000 DNA marker；1.PCR amplification from the single mutant M7-ΔplcB；2.PCR amplification from double mutant M7-Δhly/plcB；3.PCR amplification from the wild type strain M7；4.Negative control圖2　plcB缺失突變株(M7-ΔplcB、M7-Δhly/plcB)的PCR鑒定Fig.2　PCR identification of L.monocytogenes mutants with plcB full gene deletion

M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1.單缺失突變株M7-Δhly的RT-PCR擴增；2.雙缺失突變株M7-Δhly/plcB的RT-PCR擴增；3.親本株M7的RT-PCR擴增；4.陰性對照M.DL5000 DNA marker；1.RT-PCR amplification from single mutant M7-Δhly；2.RT-PCR amplification from double mutant M7-Δhly/plcB；3.RT-PCR amplification from the wild type strain M7；4.Negative control圖3　hly缺失突變株(M7-Δhly、M7-Δhly/plcB)的RT-PCR鑒定Fig.3　RT-PCR identification of L.monocytogenes mutants with hly full gene deletion

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1.單缺失突變株M7-ΔplcB的RT-PCR擴增；2.雙缺失突變株M7-Δhly/plcB的RT-PCR擴增；3.親本株M7的RT-PCR擴增；4.陰性對照M.DL2000 DNA marker；1.RT-PCR amplification from single mutant M7-ΔplcB；2.RT-PCR amplification from double mutant M7-Δhly/plcB；3.RT-PCR amplification from the wild type strain M7；4.Negative control圖4　plcB缺失突變株(M7-ΔplcB、M7-Δhly/plcB)的RT-PCR鑒定Fig.4　RT-PCR identification of L.monocytogenes mutants with plcB full gene deletion

2.2突變株的生物學特性

2.2.1溶脂溶血活性在5%卵黃瓊脂平板中，plcB缺失突變株M7-ΔplcB、M7-Δhly/plcB無可見強溶脂活性，而突變株M7-Δhly及親本菌株M7仍呈現(xiàn)強溶脂活性(圖5)。此外，如圖6所示，突變株M7-Δhly和M7-Δhly/plcB溶血活性消失，而親本株M7與突變株M7-ΔplcB的溶血情況基本一致，在1 h左右達到最高值(圖6)。在5%綿羊血瓊脂平板中hly缺失突變株M7-Δhly和M7-Δhly/plcB無可見溶血圈(圖7)，而突變株M7-ΔplcB及其親本菌株M7具有相似的溶血活性，具有明顯β溶血環(huán)(圖7)，與前面的細菌、紅細胞共培養(yǎng)結(jié)果一致。

圖6　突變株及其親本菌株M7與紅細胞共培養(yǎng)時的溶血活性Fig.6　Hemolytic activity of of L. monocytogenes mutants and their parent strain M7 incubated together with red blood cells

圖7　突變株及其親本菌株在5%綿羊血瓊脂平板中的溶血活性Fig.7　Hemolytic activity of of L.monocytogenes mutants and their parent strain M7 on BHI agar plate with 5% sheep blood cells

2.2.2對HeLa細胞的黏附及細胞內(nèi)增殖能力比較突變株M7-ΔplcB、M7-Δhly和其親本菌株M7對HeLa的黏附率分別是17.91%、12.75%和15.78%，統(tǒng)計學差異不顯著(P>0.05)(圖8)。此外，在HeLa細胞內(nèi)培養(yǎng)12 h，突變株M7-ΔplcB、M7-Δhly和其親本菌株M7均有所增殖，分別增加1.86對數(shù)倍數(shù)、2.04對數(shù)倍數(shù)和1.97對數(shù)倍數(shù)，統(tǒng)計學差異不顯著(P>0.05)(圖9)。

圖8　突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB及其親本菌株M7對HeLa細胞的黏附率比較Fig.8　Adherence index of L.monocytogenes mutants and their parent strain M7 to HeLa cells

圖9　突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB及其親本菌株M7在HeLa細胞中培養(yǎng)12 h的增殖力比較Fig.9　Intracellular growth of L. monocytogenes mutants and their parent strain M7 in HeLa cells after infection for 12 h

2.2.3體外培養(yǎng)細胞的細胞毒性比較在Caco-2細胞模型中，當MOI為10，各菌株對宿主細胞毒性較低(均小于20%)(表2)，親本株M7的細胞毒性顯著高于M7-ΔplcB和M7-Δhly/plcB(P<0.05)。提高MOI至100，M7與M7-ΔplcB對宿主 Caco-2細胞毒性分別提高至38.20%和47.70%，顯著高于參考菌株EGD(6.83%)、M7-Δhly(5.40%)和雙缺失突變株M7-Δhly/plcB(6.10%)(P<0.05)。當提高MOI至1 000，M7與M7-ΔplcB對Caco-2細胞的毒性作用分別達到86.83%和83.17%，強毒株EGD為50.23%，M7-Δhly為23.53%，而雙缺失突變株M7-Δhly/plcB細胞毒性最低，僅為11.10%，顯著低于單缺失突變株(M7-Δhly和M7-ΔplcB)、親本菌株M7及參考菌株EGD(P<0.05)。hly缺失突變株M7-Δhly的細胞毒性顯著低于M7、M7-ΔplcB及參考菌株EGD(P<0.05)(表2)。

菌株Strain細菌細胞比10MOI(10∶1)細菌細胞比100MOI(100∶1)細菌細胞比1000MOI(1000∶1)EGD12.20±1.65ab6.83±1.01b50.23±2.07bM716.20±1.28a38.20±4.45a86.83±3.58aM7-Δhly11.90±2.39ab5.40±1.27b23.53±2.56cM7-ΔplcB7.90±1.54b47.70±5.00a83.17±3.68aM7-Δhly/plcB7.60±0.59b6.10±1.19b11.10±2.17d

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，所標字母相同表示差異不顯著(P>0.05)

Different letters indicate significant difference among different strains (P<0.05)，same letters imply no significant difference among different strains (P>0.05)

2.2.4在L929細胞中的遷移能力比較在L929細胞中，hly缺失突變株M7-Δhly(圖10B)和M7-Δhly/plcB(圖10C)無任何可見空斑形成。而親本菌株M7(圖10D)及突變株M7-ΔplcB(圖10E)在不含慶大霉素(G-)的培養(yǎng)基中能形成若干細小空斑。當培養(yǎng)基中含慶大霉素時，菌株M7和M7-ΔplcB無任何肉眼可見空斑。而參考強毒菌株EGD與培養(yǎng)基中的慶大霉素無關(guān)，均能形成許多清晰可見的空斑(圖10A)。

2.2.5對小鼠致病力比較在角叉膠小鼠免疫抑制模型中，單基因缺失突變株M7-Δhly和M7-ΔplcB的LD50均大于107.95，雙基因缺失突變株M7-Δhly/plcB的LD50大于108.01，而親本株M7和強毒株EGD的LD50分別為107.46和100.95，如表3所示，以最高劑量108cfu·mL-1進行攻毒時仍觀察不到小鼠死亡，其低致病能力可見一斑。

3討論

單增李斯特菌主要經(jīng)污染的食物攝入而引發(fā)感染，并完成環(huán)境腐生菌到致病菌的華麗轉(zhuǎn)換[10]。然而并非所有單增李斯特菌均表現(xiàn)出相同致病能力，主要與其毒力因子，尤其是PrfA調(diào)控的毒力基因表達息息相關(guān)[4]。

表3本研究涉及的各突變株、親本菌株M7及參考菌株EGD在小鼠中的LD50比較

Table 3Pathogenicity ofL.monocytogenesmutants，the parent strain M7 together with the reference strain EGD in terms of LD50in mouse model

菌株Strain半數(shù)致死量log10LD50EGD0.95M77.46M7-Δhly>7.95M7-ΔplcB>7.95M7-Δhly/plcB>8.01

溶血及溶脂試驗表明突變株hly和plcB基因的缺失致其相關(guān)強溶血活性及高溶脂活性喪失(圖5～7)，但不影響細菌的黏附及細胞內(nèi)增殖能力(圖8～9)。雖然LLO與PC-PLC為裂解宿主細胞吞噬體膜所必需，有研究表明單增李斯特菌也可不依賴于LLO，通過腸道派伊爾結(jié)上的M細胞進入感染宿主細胞內(nèi)[19-20]。而且在有些細胞系(如人上皮細胞中)，PC-PLC能夠在缺失LLO情況下介導初級吞噬體膜的裂解[21]，因而突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB呈現(xiàn)與其親本菌株M7相似的黏附及細胞內(nèi)增殖能力可能與上述原因有關(guān)。

圖10　突變株M7-Δhly、M7-ΔplcB、M7-Δhly/plcB和其親本菌株M7及參考菌株EGD在L929培養(yǎng)細胞中的空斑形成比較Fig.10　Plaque forming of L.monocytogenes mutants, the parent strain M7 together with the reference strain EGD

在細胞毒性試驗中，當MOI為100及1 000時，親本株M7的細胞毒性顯著高于強毒參考菌株EGD、突變株M7-Δhly及M7-Δhly/plcB(P<0.05)(表2)。而hly缺失突變株M7-Δhly的細胞毒性顯著弱于親本株M7和M7-ΔplcB(P<0.05)。雙突變株M7-Δhly/plcB的細胞毒性在MOI為10、100及1 000時均顯著低于其親本菌株M7(P<0.05)。細菌遷移試驗中當培養(yǎng)基中不含有慶大霉素時，親本株M7及M7-ΔplcB可形成若干細小空斑(圖10D、E)，而當培養(yǎng)基中含有慶大霉素時無任何可見空斑形成。上述結(jié)果表明M7的低致病力主要與其膜裂解相關(guān)基因hly及plcB的高效表達致宿主強細胞毒性有關(guān)，使細菌無法躲避宿主細胞免疫系統(tǒng)的殺傷作用最終被宿主清除。菌株M7-ΔplcB仍具有較強的細胞毒性，且在MOI 為100及1 000時顯著高于EGD、突變株M7-Δhly和M7-Δhly/plcB(P<0.05)，表明M7的強細胞毒性主要與高水平表達的LLO有關(guān)。

由hly編碼的LLO蛋白為桿狀晶體結(jié)構(gòu)[22]，對多種核化細胞(如Caco-2、HepG2等)具有裂解性[23]，可誘發(fā)細胞凋亡。包含D1、D2、D3和D4 4個結(jié)構(gòu)區(qū)域。其中D1包含25個氨基酸序列的信號肽序列及PEST區(qū)域。PEST區(qū)域為單增李斯特菌逃離吞噬體及建立細胞內(nèi)感染所必需。有研究表明將該PEST區(qū)域缺失后，單增李斯特菌對宿主細胞毒性顯著增強，致宿主細胞裂解，而細菌最終因無法躲避宿主殺傷作用而被清除[24]。J.A.Carrero等研究表明將LLO第491位及492位或僅第492位氨基酸從色氨酸突變?yōu)楸彼岷?，LLO的溶血活性及細胞毒性降低90%以上，但仍然保持其免疫原性[25]。本研究表明將hly全基因缺失后，單增李斯特菌對宿主細胞毒性顯著減弱，溶血活性消除，對免疫抑制ICR小鼠毒力顯著減弱(>107.95vs107.46)，與本課題組前期研究成果及其他學者的結(jié)果一致[26-27]。

4結(jié)論

單增李斯特菌菌株M7低致病力的原因可能與其膜裂解相關(guān)基因hly及plcB高效表達有關(guān)，致其細胞毒性顯著增強，從而對宿主整體的致病力明顯降低。

參考文獻(References)：

[1]LECHOWICZ J，KRAWCZYK-BALSKA A.An update on the transport and metabolism of iron inListeriamonocytogenes： the role of proteins involved in pathogenicity[J].Biometals，2015，28(4)：587-603.

[2]DESHAYES C，BIELECKA M K，CAIN R J，et al.Allosteric mutants show that PrfA activation is dispensable for vacuole escape but required for efficient spread andListeriasurvivalinvivo[J].MolMicrobiol，2012，85(3)：461-477.

[4]VASANTHAKRISHNAN R B，DE LAS HERAS A，SCORTTI M，et al.PrfA regulation offsets the cost ofListeriavirulence outside the host[J].EnvironMicrobiol，2015，17(11)：4566-4579.

[5]STACHOWIAK R，LYZNIAK M，BUDZISZEWSKA B K，et al.Cytotoxicity of bacterial metabolic products，including listeriolysin O on leukocyte targets[J].JBiomedBiotechnol，2012，2012：954375.

[7]PUSHKAREVA V I，ERMOLAEVA S A.Listeriamonocytogenesvirulence factor Listeriolysin O favors bacterial growth in co-culture with the ciliateTetrahymenapyriformis，causes protozoan encystment and promotes bacterial survival inside cysts[J].BMCMicrobiol，2010，10：26.

[9]CHEN J，XIA Y，CHENG C，et al.Genome sequence of the nonpathogenicListeriamonocytogenesserovar 4a strain M7[J].JBacteriol，2011，193(18)：5019-5020.

[10]FANG C，CAO T，CHENG C，et al.Activation of PrfA results in overexpression of virulence factors but does not rescue the pathogenicity ofListeriamonocytogenesM7[J].JMedMicrobiol，2015，64(8)：818-827.

[11]BAI F，CHEN J，CHEN Q，et al.A single substitution in 5′-untranslated region ofplcBis involved in enhanced broad-range phospholipase C activity inListeriamonocytogenesstrain H4[J].ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)，2011，43(4)：275-283.

[12]江玲麗，陳健舜，李愛云，等.單核細胞增多性李斯特菌弱毒株的生物學特性鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學報，2014，45(2)：274-280.

JIANG L L，CHEN J S，LI A Y，et al.Characterization ofListeriamonocytogenesstrains with low virulence[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2014，45(2)：274-280.(in Chinese)

[13]HECKMAN K L，PEASE L R.Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension[J].NatProtoc，2007，2(4)：924-932.

[14]ONO T，PARK K S，UETA M，et al.Identification of proteins secreted viaVibrioparahaemolyticustype III secretion system 1[J].InfectImmun，2006，74(2)：1032-1042.

[15]JIANG L L，XU J J，CHEN N，et al.Virulence phenotyping and molecular characterization of a low-pathogenicity isolate ofListeriamonocytogenesfrom cow’s milk[J].ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)，2006，38(4)：262-270.

[16]KIM Y R，VAN’T OEVER R，LANDAYAN M，et al.Automated red blood cell differential analysis on a multi-angle light scatter/fluorescence hematology analyzer[J].CytometryBClinCytom，2003，56(1)：43-54.

[17]FANG C，SHAN Y，CAO T，et al.Prevalence and virulence characterization ofListeriamonocytogenesin chilled pork in Zhejiang Province，China[J].FoodbornePathogDis，2015，doi：10.10899/fpd.2015.2023.

[18]JIANG L，CHEN J，XU J，et al.Virulence characterization and genotypic analyses ofListeriamonocytogenesisolates from food and processing environments in eastern China[J].IntJFoodMicrobiol，2008，121(1)：53-59.

[19]JENSEN V B，HARTY J T，JONES B D.Interactions of the invasive pathogensSalmonellatyphimurium，Listeriamonocytogenes，andShigellaflexneriwith M cells and murine Peyer’s patches[J].InfectImmun，1998，66(8)：3758-3766.

[20]CORR S，HILL C，GAHAN C G.Aninvitrocell-culture model demonstrates internalin-and hemolysin-independent translocation ofListeriamonocytogenesacross M cells[J].MicrobPathog，2006，41(6)：241-250.

[21]BURRACK L S，HARPER J W，HIGGINS D E.Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O independent vacuolar escape duringListeriamonocytogenesinfection of human cells[J].CellMicrobiol，2009，11(9)：1382-1398.

[22]K?STER S，VAN PEE K，HUDEL M，et al.Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation[J].NatCommun，2014，5：3690.

[24]DECATUR A L，PORTNOY D A.A PEST-like sequence in listeriolysin O essential forListeriamonocytogenespathogenicity[J].Science，2000，290(5493)：992-995.[25]CARRERO J A，VIVANCO-CID H，UNANUE E R.Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity[J].PLoSOne，2012，7(3)：e32310.

[26]GLOMSKI I J，DECATUR A L，PORTNOY D A.Listeriamonocytogenesmutants that fail to compartmentalize listerolysin O activity are cytotoxic，avirulent，and unable to evade host extracellular defenses[J].InfectImmun，2003，71(12)：6754-6765.

[27]JIANG L L，SONG H H，CHEN X Y，et al.Characterization of a mutantListeriamonocytogenesstrain expressing green fluorescent protein[J].ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)，2005，37(1)：19-24.

(編輯白永平)

Construction and Characterization of Mutant Strains fromListeriamonocytogeneswith Deletion of Vacuolar Lysis Related Genes

JIANG Ling-li1，GAO You-ling2，ZHOU Xiang-yang3，BAI Fan4，F(xiàn)ANG Chun4，QIAN Guo-ying2*，F(xiàn)ANG Wei-huan4

(1.NingboCollegeofHealthSciences，Ningbo315100，China；2.ZhejiangWanliUniversity，Ningbo315100，China；3.ZhoushanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Zhoushan316000，China；4.InstituteofPreventiveVeterinaryMedicine，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China)

Abstract:We attempted to gain insights into the possible mechanism of oneListeriamonocytogenesstrain M7 with naturally low virulence.Splicing by overlap extension-PCR and homologous recombination were utilized to construct the mutant strains with full deletion of vacuolar lysis related geneshlyor (and)plcB.Subsequently，comparisons among mutants and their parent strain M7 together with the reference strain EGD were investigated in terms of hemolytic activity，phospholipase activity，adhesion and intracellular growth in HeLa cells，plaque forming assay in L929 cells，cytotoxicity against Caco-2 cells，as well as virulence to immunocompromised ICR mice.PCR amplification and reverse transcriptional PCR of the target genes indicated the successful construction of the mutants M7-Δhly，M7-ΔplcB and M7-Δhly/plcB.Furthermore，hemolytic and phospholipase activity were devoid in mutants M7-Δhly and M7-ΔplcB，respectively.Neither hemolytic nor phospholipase activity could be seen in the double mutant M7-Δhly/plcB.Besides，mutants M7-Δhly and M7-ΔplcB exhibited similar adhesiveness and intracellular growthinvitro(P>0.05).Cytotoxicity assay under multiplicity of infection (MOI) ratio 1 000 revealed that the double mutant M7-Δhly/plcB showed the lowest cytotoxic to the host Caco-2 cells with the ratio of 11.10%，followed by mutant M7-Δhly with the ratio of 23.53%.Significant difference could be found between the aforementioned two mutants and other test strains (P<0.05).Plaque forming assay pinpointed that mutant M7-ΔplcB together with its parent strain M7 could form plaques only in the medium without gentamycin.The full deletion ofhlyor (and)plcBresulted in even less pathogenicity in immunocompromised ICR mice.This study presents some clues as the low virulence of strain M7 probably result from the over-expression of geneshlyandplcB.Thereafter，the M7 strain might be exposed to the host immune responses due to its detrimentally stronger cytotoxicity.

Key words:Listeriamonocytogenes；vacuolar lysis related genes；cytotoxicity；biological characteristics

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.018

收稿日期：2015-10-10

基金項目：浙江省科技廳公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目(2014C32047)；2015年度留學人員科技活動項目擇優(yōu)資助經(jīng)費項目；浙江萬里學院省重中之重學科開放基金(KF2014007)；寧波市自然科學基金(2015A610189)；浙江檢驗檢疫局重點科研項目(2014-ZKZ-017)

作者簡介：江玲麗(1980-)，女，浙江溫嶺人，研究員，博士，主要從事微生物與食品安全研究，Tel：0574-88126061，E-mail：jllgrace@163.com *通信作者：錢國英，教授，E-mail：qiangy@zwu.edu.cn

中圖分類號：R378.99.4

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0779-10