兔糞中微生物區(qū)系ERIC-PCR DNA指紋圖譜的建立及分析

李云飛，秦翠麗，王忠澤，楊若嵐，李　洋

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

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兔糞中微生物區(qū)系ERIC-PCR DNA指紋圖譜的建立及分析

李云飛，秦翠麗*，王忠澤，楊若嵐，李洋

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

摘要：本研究旨在將ERIC-PCR基因指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于兔糞微生物的分析中，建立一種快速分析檢測(cè)兔腸道菌群變化的方法。通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化確定適合兔糞微生物的ERIC-PCR反應(yīng)條件，對(duì)比兔糞微生物組和兔糞優(yōu)勢(shì)菌的ERIC-PCR DNA指紋圖譜差異，從而分析兔糞微生物ERIC指紋圖譜的特征。結(jié)果建立了適合兔糞樣品 ERIC-PCR 分析的反應(yīng)體系，確定450 bp處條帶為雙歧桿菌特征條帶，1 300和4 000 bp處為大腸桿菌特征條帶；經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證，圖譜中的相應(yīng)條帶亮度變化趨勢(shì)與計(jì)數(shù)平板所測(cè)結(jié)果相一致(相對(duì)亮度R與相對(duì)菌落數(shù)lg cfu的相關(guān)系數(shù)為0.967 6)。本研究?jī)?yōu)化建立了一種快速分析檢測(cè)兔糞中菌群變化的ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)，該技術(shù)可較好反映兔糞中優(yōu)勢(shì)菌含量的變化情況，為兔腸道疾病的預(yù)防、診斷和治療提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：兔糞；糞便菌群；ERIC-PCR；基因指紋圖譜；特征條帶

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)兔產(chǎn)品需求量的提高大大促進(jìn)了養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展，且養(yǎng)兔投資少、見(jiàn)效快，是振興農(nóng)村經(jīng)濟(jì)，解決下崗職工再就業(yè)的好門(mén)路。但由于家兔盲腸和胃壁都很薄，容易患腹瀉等胃腸疾病且很難治愈，這成為困擾養(yǎng)殖戶(hù)的一大難題[1]。動(dòng)物腸道微生物被認(rèn)為是機(jī)體的另一個(gè)器官，有研究指出，腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化與腹瀉等疾病直接相關(guān)，因此建立快速有效的腸道菌群結(jié)構(gòu)分析方法對(duì)于預(yù)防、診斷和治療兔腸道疾病具有重要的意義。

ERIC序列是近十幾年來(lái)，在腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一段長(zhǎng)為126 bp的反向重復(fù)序列，定位于基因組內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域或與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的區(qū)域，且 ERIC 序列散布在整個(gè)基因組中，具有極強(qiáng)的保守性[2]。該技術(shù)自從1991年被發(fā)明以來(lái)得到了廣泛的發(fā)展，R.K.Mishra等[3]基于ERIC-PCR分析對(duì)尖孢鐮刀菌分離菌進(jìn)行基因分型；G.Nath等[4]對(duì)二十年間分離的傷寒沙門(mén)氏菌做ERIC-PCR對(duì)比，分析沙門(mén)氏菌的變異情況；何力等[5]以大腸桿菌的ERIC指紋圖譜為指示因子對(duì)水庫(kù)中的貝類(lèi)產(chǎn)品污染進(jìn)行微生物源示蹤；M.Kosek等[6]將ERIC技術(shù)與檢測(cè)能力較強(qiáng)的脈沖凝膠電泳(PFGE)技術(shù)同時(shí)對(duì)比分析指定菌株為同系或不同系，結(jié)果表明，ERIC技術(shù)的分析結(jié)果與PFGE技術(shù)相關(guān)性達(dá)90.4%，且操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。因此，通過(guò)分析擴(kuò)增出條帶的分布、數(shù)量和亮度等信息，即可從分子水平對(duì)混合樣的菌群組成進(jìn)行鑒定。該技術(shù)與16srRNA、RT-qPCR、PCR-DGGE等細(xì)菌鑒定方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快捷、成本低的優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)以兔糞微生物為研究材料，對(duì)ERIC指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建出能夠代表家兔腸道主要菌群組成的DNA指紋圖譜，分離兔糞中的優(yōu)勢(shì)菌(雙歧桿菌和大腸桿菌)并構(gòu)建其指紋圖譜，從而分析雙歧桿菌和大腸桿菌對(duì)應(yīng)的特征條帶，從而建立一套能夠快速檢測(cè)分析家兔腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的方法。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑

糞樣采集：從洛陽(yáng)萬(wàn)壽養(yǎng)殖場(chǎng)挑選90日齡、體重2.4 kg的健康德國(guó)花巨兔，無(wú)菌操作采集其新鮮糞便放于無(wú)菌容器中。養(yǎng)殖場(chǎng)采用3層垂直兔籠單籠飼養(yǎng)，以常規(guī)兔用復(fù)合顆粒飼料飼喂，定期加喂少量胡蘿卜以補(bǔ)充維生素。

主要試劑：Taq酶(5 U·μL-1)、dNTP、DL 5000 DNA Marker、瓊脂糖均購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；擴(kuò)增引物(ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTCAGCG-3′)，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2ERIC-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.1糞樣預(yù)處理無(wú)菌操作取新鮮家兔糞樣1粒加入3 mL無(wú)菌PBS溶液(0.05 mol·L-1，pH 7.4)中，渦旋混勻5～10 min；2 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。此法重復(fù)3次后，取上清液置于離心管中，10 000 r·min-1離心3 min，收集菌體細(xì)胞；再將細(xì)胞用PBS洗滌4次，無(wú)菌水洗滌1次，用0.1 mL去離子水重懸[7]。

1.2.2基因組提取參考宮強(qiáng)等[8]設(shè)計(jì)的改良CTAB法對(duì)樣品的基因組進(jìn)行提取。

1.2.3ERIC-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以糞樣微生物基因組為模板，使用ERIC引物進(jìn)行PCR，針對(duì)TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物和退火溫度4個(gè)影響因素，設(shè)置不同梯度進(jìn)行優(yōu)化(表1)，找出各自最適合的反應(yīng)條件。參考文獻(xiàn)[3，9]，初始反應(yīng)體系為25 μL：其中10×PCR buffer(含Mg2+15 mmol·L-1) 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL，上下游引物(20 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板2 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)充至25 μL；初始PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃末端延伸10 min。PCR結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，70 V電泳1 h，紫外凝膠成像儀檢測(cè)拍照。

1.3腸道優(yōu)勢(shì)菌的分離及其ERIC指紋圖譜的建立1.3.1細(xì)菌分離篩選梯度稀釋預(yù)處理后的糞樣菌懸液，分別涂布Beerens平板(培養(yǎng)雙歧桿菌)、MCA平板(培養(yǎng)大腸桿菌)，Beerens平板放入?yún)捬豕拗校琈CA平板放入恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)并挑取平板上特征較明顯且數(shù)量較多的菌落，鏡檢、生理生化鑒定，篩選出雙歧桿菌和大腸桿菌，接種相應(yīng)液體培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵。

1.3.2分離菌ERIC指紋圖譜的構(gòu)建用CTAB法提取雙歧桿菌、大腸桿菌基因組，用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行ERIC-PCR；反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像檢測(cè)，與糞樣微生物指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)分析，找出各自對(duì)應(yīng)的特征條帶。

表1ERIC-PCR反應(yīng)優(yōu)化影響因素梯度設(shè)置

Table 1The optimization design for influencing factors of ERIC-PCR

影響因素Influencefactor梯度變量GradientvariablesTaq聚合酶/μLTaqpolymerase0.40.60.81.01.2dNTPs/μL0.61.01.41.82.2引物/μLPrimer0.51.01.52.02.5退火溫度/℃Annealingtemperature4952555860

1.4特征條帶的驗(yàn)證及穩(wěn)定性分析

1.4.1發(fā)酵前后糞樣中雙歧桿菌與大腸桿菌含量變化分析參照文獻(xiàn)[10]配制與腸道內(nèi)容物相近的發(fā)酵培養(yǎng)基(配方(g·L-1)：牛肉膏 2.4、蛋白胨 10、L-半胱氨酸 0.6、葡萄糖 2.5、酵母膏 5.0、氯化鈉 5.0、pH 6.5)，接種1%經(jīng)過(guò)預(yù)處理的糞樣菌懸液，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h；取發(fā)酵液用CTAB法提取基因組，用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行ERIC-PCR，得到發(fā)酵菌群ERIC基因指紋圖譜，與發(fā)酵前的糞樣菌群基因指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)。用Beerens、MCA平板分別對(duì)發(fā)酵液中的雙歧桿菌與大腸桿菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并與指紋圖譜結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.4.2圖譜分析及數(shù)據(jù)處理通過(guò)凝膠成像儀的圖像處理軟件Image Lab 3.0對(duì)圖譜進(jìn)行處理，以圖譜中標(biāo)準(zhǔn)條帶DL 5 000 Marker的 1 000 bp條帶亮度(對(duì)應(yīng)150 ng的量)為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)(R0=1)，對(duì)其他條帶的亮度進(jìn)行定量，獲得相對(duì)亮度值R。采用DPS 7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1ERIC-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

ERIC-PCR反應(yīng)體系中各因素不同梯度設(shè)置的ERIC-PCR電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1中不同因素梯度的條帶亮度不同，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果不同。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 5000；1～5.Taq酶的濃度梯度依次為0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 μL；6～10.引物濃度梯度依次為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μL；11～15.dNTPs濃度梯度依次為0.6、1.0、1.4、1.8和2.2 μL；16～20.退火溫度梯度依次為49、52、55、58、60 ℃M.DL 5000 marker；1-5.Taq polymerase concentration gradient followed by 0.4，0.6，0.8，1.0 and 1.2 μL；6-10.Primer concentration gradient followed by 0.5，1.0，1.5，2.0 and 2.5 μL；11-15.dNTPs concentration gradient followed by 0.6，1.0，1.4，1.8 and 2.2 μL；16-20.Annealing temperature gradient followed by 49，52，55，58 and 60 ℃圖1　ERIC-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化電泳圖Fig.1　The electrophoresis figure of the ERIC-PCR reaction condition optimization

2.1.1TaqDNA聚合酶的優(yōu)化圖1表明，Taq酶添加量為1.0 μL最為合適。添加量在0.8 μL以下時(shí)條帶稀少且亮度弱，添加1.2 μL時(shí)亮度很大但雜帶較多拖尾較嚴(yán)重。

2.1.2引物濃度的影響圖1中6～10泳道表明，加入引物濃度1.5 μL最為合適。加入量為0.5、1.0 μL時(shí)條帶亮度小且較為模糊；2.0 μL以上時(shí)條帶亮度大，但底部出現(xiàn)引物二聚體條帶，因此以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。

2.1.3dNTPs添加量的優(yōu)化圖1中11～15泳道表明，dNTPs添加量為1.4 μL時(shí)最好。添加量過(guò)高會(huì)與Mg2+結(jié)合，使體系中游離的Mg2+減少，從而影響Taq酶活性，且增大錯(cuò)配機(jī)率；而濃度不足又會(huì)影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量。

2.1.4退火溫度對(duì)擴(kuò)增條帶的影響圖1中16～20泳道表明，當(dāng)退火溫度選用52 ℃時(shí)亮度大，效果最好。55 ℃以后條帶暗且較稀疏，擴(kuò)增效率低；溫度為49 ℃時(shí)條帶較模糊有拖尾。

經(jīng)過(guò)對(duì)各個(gè)影響因素的優(yōu)化，得到了適合構(gòu)建兔糞微生物ERIC-PCR DNA指紋圖譜的反應(yīng)體系：25 μL體系，其中10×PCR buffer(含Mg2+15 mmol·L-1) 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1) 1.4 μL，上下游引物(20 μmol·L-1)各1.5 μL，DNA模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)1.0 μL，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃末端延伸10 min。

2.2兔糞中雙歧桿菌和大腸桿菌菌落特征與含量測(cè)定

通過(guò)平板分離、鏡檢與生理生化鑒定，獲得了兔糞較具代表性的雙歧桿菌與大腸桿菌。兔糞中分離的雙歧桿菌與大腸桿菌菌落特征及含量測(cè)定的平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2兔糞中分離菌的含量及菌落特征

Table 2Content and colony characteristics of isolated bacteria from rabbit manure

腸道菌Intestinalbacteria培養(yǎng)基Culturemedium菌落數(shù)/(cfu·mL-1)Colonycount菌落特征Colonycharacteristics雙歧桿菌BifidobacteriaBeerens培養(yǎng)基2.52E+07特小;乳白色或淡白色;邊緣較整齊;中央有突起;乳白顏色均勻;淡白中間顏色重;有淡淡麥香味大腸桿菌E.coliMCA培養(yǎng)基1.34E+07較大桃紅或粉紅色;無(wú)明顯特殊味道;邊緣整齊,有突起;中間顏色重;粉色均勻,突起較高

2.3糞樣微生物DNA指紋圖譜的建立與特征條帶分析

發(fā)酵前、后的混合菌指紋圖譜與分離菌指紋圖譜見(jiàn)圖2。圖2表明，雙歧桿菌有2條ERIC條帶，其中在450 bp處有1條明顯的特征條帶；大腸桿菌有4條ERIC條帶，其中1 300與4 000 bp處為較為明顯的2條特征條帶；并且，雙歧桿菌與大腸桿菌的這3條特征條帶，均可在糞樣菌圖譜中找到明顯的對(duì)應(yīng)條帶。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 5000；1.糞樣菌群ERIC基因指紋圖譜；2.發(fā)酵后菌液ERIC基因指紋圖譜；3、4.雙歧桿菌ERIC基因指紋圖譜；5、6.大腸桿菌ERIC基因指紋圖譜M.DL 5000 marker；1.ERIC genetic fingerprint of fecal samples flora；2.ERIC genetic fingerprint of bacteria liquid after fermentation；3，4.ERIC genetic fingerprint of the Bifidobacteria；5，6.ERIC genetic fingerprint of the E.coli圖2　有益菌及有害菌特征條帶分析圖Fig.2　The analysis figure of beneficial bacteria and harmful bacteria characteristic bands

2.4特征條帶的穩(wěn)定性

對(duì)分離菌基因組和兔糞微生物基因組進(jìn)行5次重復(fù)擴(kuò)增，獲得的特征條帶大小以及糞樣指紋圖譜中450、1 300 bp和4 000 bp處的相對(duì)亮度數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。對(duì)亮度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可知變異系數(shù)CV均比較小(在5%以下)，表明確定的條帶位置以及圖譜中相應(yīng)條帶的相對(duì)亮度具有很好的穩(wěn)定性。

2.5特征條帶的驗(yàn)證

雙歧桿菌與大腸桿菌發(fā)酵前后的特征條帶的相對(duì)定量值R變化與相對(duì)菌落數(shù)變化見(jiàn)表4，特征條帶相對(duì)亮度與相對(duì)菌落數(shù)的關(guān)系見(jiàn)圖3。表4中雙歧桿菌的R值取450 bp條帶的相對(duì)亮度值，大腸桿菌R值取1 300和4 000 bp條帶相對(duì)亮度的平均值。圖2中，發(fā)酵后ERIC指紋圖譜中的條帶向低位方向遷移，從表4也可看出，發(fā)酵后450 bp處的條帶亮度顯著提高(相對(duì)亮度由0.56提高到1.48)，而1 300 bp處的條帶僅隱約可見(jiàn)，4 000 bp處的條帶基本沒(méi)有(兩條帶相對(duì)亮度平均值由0.50降低到0.04)，說(shuō)明發(fā)酵液中雙歧桿菌生長(zhǎng)較好、大腸桿菌受到抑制。圖3表明，條帶亮度變化與相應(yīng)菌數(shù)變化明顯呈正相關(guān)；對(duì)相對(duì)菌落數(shù)lg cfu和相對(duì)亮度R進(jìn)行回歸分析，得到二者的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.967 6，表明特征條帶的相對(duì)亮度也能較好的表征對(duì)應(yīng)菌在復(fù)合樣中的含量。

表3特征條帶穩(wěn)定性分析

Table 3The stability analysis of characteristic bands

組別Group特征條帶/bpCharacteristicband相對(duì)亮度Relativebrightness雙歧桿菌Bifidobacteria大腸桿菌E.coli450bp1300bp4000bp1450.161286.804011.560.560.500.512455.241325.784005.650.570.530.523447.621308.763987.490.540.480.484450.171321.973990.180.580.510.535440.361277.724017.560.550.520.50平均值Mean448.711304.214002.490.560.500.51標(biāo)準(zhǔn)差Standarddeviation4.8519.0111.800.010.020.02變異系數(shù)/%Coefficientofvariation1.081.460.292.463.553.00

Table4ChangesofBifidobacteriaandE.colicontentbeforeandafterfermentation

類(lèi)別Category發(fā)酵前Beforethefermentation發(fā)酵后Afterthefermentation雙歧桿菌Bifidobacteria大腸桿菌E.coli雙歧桿菌Bifidobacteria大腸桿菌E.coli相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient相對(duì)菌落數(shù)lgcfu相對(duì)亮度Relativebrightness7.40±0.510.56±0.017.13±0.490.50±0.0210.83±0.521.48±0.014.09±0.750.04±0.020.9676

圖3　特征條帶相對(duì)亮度與相對(duì)菌落數(shù)的關(guān)系Fig.3　The relationship between relative brightness of characteristic bands and lg cfu

3討論

ERIC序列是腸桿菌基因組中普遍存在的保守序列，在不同菌種間的分布及數(shù)量不同。兔糞中菌群組成復(fù)雜，PCR反應(yīng)會(huì)擴(kuò)增出眾多大小不一、亮度不同的條帶，可以將每個(gè)條帶看作是1種細(xì)菌類(lèi)群，條帶亮度代表該類(lèi)群的種群數(shù)量[11]，從而通過(guò)獲得的條帶數(shù)目和亮度信息分析混合菌群的多樣性以及不同樣品間的相似性。

影響ERIC-PCR最終條帶亮度的因素眾多，模板、Taq酶的活性、PCR反應(yīng)的條件等等。為了建立適宜兔糞混合菌群的PCR反應(yīng)體系，本研究對(duì)ERIC-PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使ERIC引物能夠以兔糞微生物基因組為模板擴(kuò)增出較為完整的指紋圖譜。優(yōu)化結(jié)果顯示，以兔糞微生物基因組為模板需要較高的Taq酶濃度(1.0 μL)、引物濃度(1.5 μL)和dNTP濃度(1.4 μL)，以及較為適中的退火溫度(52 ℃)，以滿(mǎn)足此復(fù)雜樣品的擴(kuò)增需要。從圖2中可以看出，獲得的條帶圖譜中有幾條亮度較大的條帶，與糞便中含量較大的幾種菌群(雙歧桿菌和大腸桿菌)有關(guān)。

ERIC指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用廣泛，如菌株的基因分型、微生物污染源示蹤等，然而通過(guò)確定分離株的特征條帶分析其在復(fù)合菌群中相應(yīng)比例的研究很少有報(bào)道。雙歧桿菌為厭氧的有益菌，大腸桿菌為好氧的條件致病菌且含量多不利于腸道健康，二者本身在腸道微生物中的含量較大，加上生長(zhǎng)環(huán)境的差異，易于通過(guò)控制厭氧環(huán)境進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。本研究通過(guò)對(duì)兔糞微生物中的優(yōu)勢(shì)菌分離、鏡檢與生理生化鑒定，獲得特征較為明顯的雙歧桿菌和大腸桿菌菌株；提取分離菌基因組，進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增，得到的指紋圖譜條帶較單一且均有較高亮度的特征條帶，其中雙歧桿菌的特征條帶在450 bp處，而大腸桿菌的特征條帶有2條，分別在1 300和4 000 bp處，這3條條帶在兔糞ERIC指紋圖譜中均能找到，且同樣為亮度較大的特征條帶。

為了驗(yàn)證所確定的3條特征條帶的可信度，對(duì)兔糞微生物進(jìn)行了厭氧發(fā)酵，選擇性地富集了雙歧桿菌，分離計(jì)數(shù)平板測(cè)定了兩類(lèi)菌的含量變化，如表3所示，發(fā)酵后雙歧桿菌含量占據(jù)優(yōu)勢(shì)，而腸桿菌則只剩下極少數(shù)存活。發(fā)酵后菌群的ERIC-PCR DNA指紋圖譜如圖2所示，條帶數(shù)目趨于單一，450 bp處條帶亮度增大，而1 300和4 000 bp處條帶亮度微弱，各條帶亮度值如表3和圖3所示，可以發(fā)現(xiàn)，特征條帶亮度變化情況與菌落變化情況成正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.967 6)，表明這幾條特征條帶亮度可以從很大程度上表征相應(yīng)菌群的含量。

由于ERIC-PCR指紋圖譜影響因素較多，很難保證結(jié)果能夠與實(shí)際的菌群數(shù)量完全一致[12]，這也是造成圖譜分析結(jié)果與菌落分析結(jié)果并不絕對(duì)相符的原因，二者只能反映出菌群結(jié)構(gòu)變化的趨勢(shì)相似；另外，單從條帶的相對(duì)亮度值很難找出與菌群濃度間的具體對(duì)應(yīng)關(guān)系，需要做進(jìn)一步研究，如對(duì)條帶進(jìn)行序列分析、建立詳細(xì)的圖譜信息數(shù)據(jù)庫(kù)等，最大限度的挖掘指紋圖譜的潛在信息，充分發(fā)揮其指示復(fù)雜樣品菌群結(jié)構(gòu)的能力。

4結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化建立了針對(duì)兔糞微生物進(jìn)行ERIC-PCR的反應(yīng)體系，獲得了兔糞微生物的基因指紋圖譜。將此圖譜與分離出的雙歧桿菌和大腸桿菌ERIC-PCR圖譜進(jìn)行對(duì)比，確定雙歧桿菌的特征條帶在指紋圖譜的450 bp處，大腸桿菌特征條帶在指紋圖譜的1 300與4 000 bp處。通過(guò)比較發(fā)酵前、后兔糞微生物ERIC指紋圖譜的條帶亮度和遷移情況，發(fā)現(xiàn)其與菌落計(jì)數(shù)結(jié)果趨勢(shì)相一致，二者相關(guān)系數(shù)達(dá)0.967 6，表明所確定的條帶有較高的可信度。因此，通過(guò)檢測(cè)兔糞微生物ERIC指紋圖譜中450、1 300和4 000 bp處條帶亮度的變化情況，可了解兔糞中雙歧桿菌和大腸桿菌的含量變化情況，為兔腸道疾病的預(yù)防、診斷和治療提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]郎躍深.肉兔飼養(yǎng)與繁育技術(shù)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2009.

LANG Y S.The rearing and breeding techniques of meat rabbit[M].Beijing：Science and Technology Literature Press，2009.(in Chinese)

[2]陳慶森，高文茹，朱晨晨，等.原料奶中微生物區(qū)系ERIC-PCR DNA指紋圖譜的建立[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2013，29(11)：261-269.

CHEN Q S，GAO W R，ZHU C C，et al.Establishment of ERIC-PCR DNA fingerprint on enterobacteriaceae in raw milk[J].TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineering，2013，29(11)：261-269.(in Chinese)

[3]MISHRA R K，PANDEY B K，PATHAK N，et al.BOX-PCR-and ERIC-PCR-based genotyping and phylogenetic correlation among fusarium oxysporum isolates associated with wilt disease inPsidiumguajavaL[J].BiocatAgricBiotechnol，2014，4(1)：25-32.

[4]NATH G，MAURYA P，GULATI A K.ERIC PCR and RAPD based fingerprinting of Salmonella Typhi strains isolated over a period of two decades[J].InfectGenetEvol，2010，10(4)：530-536.

[5]何力，傅玲琳，馮立芳，等.大腸埃希氏菌ERIC-PCR指紋圖譜構(gòu)建及貝類(lèi)污染微生物源示蹤[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12(8)：163-169.

HE L，F(xiàn)U L L，F(xiàn)ENG L F，et al.ERIC-PCR fingerprinting of fecalEscherichiacoliand microbial source tracking in non-point pollution of the Shellfish culture area of East China sea[J].JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology，2012，12(8)：163-169.(in Chinese)

[6]KOSEK M，YORI P P，GILMAN R H，et al.Facilitated molecular typing of Shigella isolates using ERIC-PCR[J].AmJTropMedHyg，2012，86(6)：1018-1025.

[7]VIGSNAES L K，HOLCK J，MEYER A S，et al.Invitrofermentation of sugar beet arabino-oligosaccharides by fecal microbiota obtained from patients with ulcerative colitis to selectively stimulate the growth of Bifidobacterium spp.and Lactobacillus spp[J].ApplEnvironMicrobiol，2011，77(23)：8336-8344.

[8]宮強(qiáng)，關(guān)道明，王耀兵，等.大腸桿菌總DNA快速提取方法的比較研究[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2005，24(4)：63-66.

GONG Q，GUAN D M，WANG Y B，et al.Methods extractedEscherichiacoligenomic DNA using the fast ways[J].MarineEnvironmentalScience，2005，24(4)：63-66.(in Chinese)

[9]王燚，何廷美，鐘志軍，等.不同季節(jié)亞成體大熊貓腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41(8)：778-783.

WANG Y，HE T M，ZHONG Z J，et al.Analysis of the characteristics of intestinal flora with seasonal shift in subadult giant panda by ERIC-PCR fingerprinting[J].ChineseVeterinaryScience，2011，41(8)：778-783.(in Chinese)

[10]YIN Y S，LEI F，ZHU L Y，et al.Exposure of different bacterial inocula to newborn chicken affects gut microbiota development and ileum gene expression[J].ISMEJ，2010，4(3)：367-376.

[11]喬德才，陳敬，魏桂芳，等.采用DNA指紋圖譜技術(shù)分析中長(zhǎng)跑運(yùn)動(dòng)員腸道菌群結(jié)構(gòu)特征[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2004，23(5)：517-521.

QIAO D C，CHEN J，WEI G F，et al.Bacterial community structural dynamics in intestinal tract of long and middle distance runners by DNA fingerprinting analysis[J].ChineseJournalofSportsMedicine，2004，23(5)：517-521.(in Chinese)

[12]AHMED H A，IBRAHIM A F，HUSSEIN M A，et al.ERIC-PCR fingerprinting of some S.Typhimurium isolates from chicken and humans with reference to the microbiological quality of retail chicken meat in dakahlia，egypt[J].GlobalVeterinaria，2014，13(1)：95-104.

(編輯郭云雁)

Establishment and Analysis of ERIC-PCR DNA Fingerprint of Bacteria in Rabbit Manure

LI Yun-fei，QIN Cui-li*，WANG Zhong-ze，YANG Ruo-lan，LI Yang

(CollegeofFood&Bioengineering，HenanUniversityofScience&Technology，Luoyang471023，China)

Abstract:This study was designed to apply ERIC-PCR genetic fingerprinting technology to analyze the microbes in rabbit manure，and establish a rapid analysis and detection method of rabbit manure bacterium changes.The ERIC-PCR DNA fingerprint of bacteria in rabbit manure was established by optimizing PCR reaction conditions.The differences between DNA fingerprints of microbiome and dominant strains isolated from rabbit manure was compared，and then the characteristics of the ERIC fingerprint of bacteria in rabbit manure was analyzed.The ERIC-PCR reaction system for bacteria in rabbit manure was established.The characteristic bands forBifidobacteriawere located at 450 bp，the characteristic bands forE.coliwere located at 1 300 and 4 000 bp.Anaerobic fermentation experiment proved that the trends of the bands’ brightness were consistent with the results of the colony count (the correlation coefficient between the relative brightness and lg cfu was 0.967 6).A rapid analysis and detection method of rabbit manure bacterium changes by using ERIC-PCR genetic fingerprinting technology was established.This method could reflect the changes of beneficial bacteria in rabbit manure，thus providing a basis for prevention，diagnosis and treatment of rabbit intestinal diseases.

Key words:rabbit manure；manure bacterium；ERIC-PCR；DNA fingerprints；characteristic bands

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.011

收稿日期：2015-03-27

基金項(xiàng)目：新鄉(xiāng)市泰弘生物有限公司委托項(xiàng)目(2477)

作者簡(jiǎn)介：李云飛(1991-)，男，河南洛陽(yáng)人，碩士，主要從事畜禽腸道微生物與宿主的關(guān)系、益生菌、動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)飼料添加劑等的研究，E-mail: liyun12fei@163.com *通信作者：秦翠麗，教授，Tel：0379-64282342，E-mail:qincuili308@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：S829.1；Q93-311

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0716-07