紅芪多糖對D-半乳糖致衰老小鼠抗免疫衰老作用的研究*

柳春玲，寇　寧，張高林，李磊強(qiáng)，龐大勇，程衛(wèi)東

(1.蘭州市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050； 2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

紅芪多糖對D-半乳糖致衰老小鼠抗免疫衰老作用的研究*

柳春玲1，寇寧2，張高林2，李磊強(qiáng)2，龐大勇2，程衛(wèi)東2

(1.蘭州市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050； 2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

摘要目的：研究紅芪多糖(hedysamn polysaccharide, HPS)的抗免疫衰老作用。方法：使用清潔級昆明種小鼠，采取D-半乳糖腹腔注射的方法構(gòu)建亞急性衰老小鼠模型；分為正常對照組，模型對照組，維生素E組和HPS高、中、低劑量組。除正常對照組外，其余各組小鼠連續(xù)腹腔注射D-半乳糖(120 μg/g)；正常對照組灌胃生理鹽水，維生素E組灌胃維生素E溶液(50 μg/g)，HPS高、中、低劑量組依次灌胃200 ，100，50 μg/g HPS水溶液。觀察小鼠胸腺和脾臟指數(shù)、T淋巴細(xì)胞增殖能力、T淋巴細(xì)胞亞群的水平，測定小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α含量。結(jié)果：模型對照組小鼠臟器指數(shù)、T淋巴細(xì)胞增殖能力、T淋巴細(xì)胞亞群測定、血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α與正常對照組對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，HPS高、中、低劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)、T淋巴細(xì)胞的增殖能力，CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細(xì)胞百分比，CD3+CD28+T細(xì)胞均升高；HPS高、中、低劑量組小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4水平升高，TNF-α水平降低。HPS高、中、低劑量組間諸指標(biāo)對比，高、中劑量作用明顯。結(jié)論： HPS具有一定的抗免疫衰老作用，可通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞作用來延緩衰老，能有效改善亞急性衰老小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。

關(guān)鍵詞紅芪多糖；D-半乳糖；衰老小鼠；抗免疫衰老

伴隨著人類平均壽命的延長，人口老齡化問題日益成為深刻的社會和醫(yī)學(xué)問題，與衰老相關(guān)的疾病呈逐年上升趨勢，尋找能夠延緩衰老、減少老年疾病發(fā)生的藥物和方法，具有非常重要的社會價(jià)值。紅芪為豆科植物多序巖黃芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明：紅芪具有抗自由基、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[2]。有關(guān)衰老機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)：衰老在免疫系統(tǒng)最早出現(xiàn)[3]。本實(shí)驗(yàn)通過建立D-半乳糖致衰老小鼠模型[4]，采用常規(guī)水提醇沉法[5]制備紅芪多糖(hedysamn polysaccharide, HPS)，進(jìn)一步研究紅芪抗免疫衰老的作用機(jī)制，以期為紅芪在延緩衰老方面的推廣使用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

清潔級昆明種小鼠60只，體質(zhì)量18～22g，雌雄各半，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SKXK(甘)201106-0014。

1.2藥品、試劑與儀器

紅芪購自甘肅武都。胎牛滅活血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品，批號0908162；EZ-SepTMMOUSEIX淋巴細(xì)胞分離液，深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號DKW33_R0100；MTT(批號20140102418)、ConA(批號201405162161)，均為美國Sigma公司產(chǎn)品；SDS，天津化學(xué)試劑一廠產(chǎn)品，批號2014021615；RPMI 1640培養(yǎng)基，恒星生物工程有限公司產(chǎn)品，批號NAC1352；小鼠IL-2(ELISA)檢測試劑盒(批號E2020-1506-1)、小鼠IL-4(ELISA)檢測試劑盒(批號E2020-1504-2)、小鼠IFN-γ(ELISA)檢測試劑盒(批號20140801A)和小鼠TNF-α(ELISA)檢測試劑盒(批號E2720-1507-1)，均為深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；FITC-抗小鼠CD 3單克隆抗體(批號B172038)、PE/CY5-抗小鼠CD 4單克隆抗體(批號B17682014)、PerCP-抗小鼠CD 8單克隆抗體(批號B15852815)和PE-抗小鼠CD28單克隆抗體(批號B163165)，均為Biolegend公司產(chǎn)品；維生素E軟膠囊，青島雙鯨藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號20140515；D-半乳糖，上海中泰試劑有限公司產(chǎn)品，批號Z00140730。LxJ-IIB飛鴿牌低速大容量多管離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；Heto-lyo-lab 3000冷凍干燥機(jī)，丹麥heto公司產(chǎn)品；SHE-D循環(huán)水式真空泵，河南鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；A06061422超凈臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO公司產(chǎn)品；TDL-40B型、TGL-16G型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國貝克曼COULTER公司產(chǎn)品。

1.3紅芪多糖的提取

精確稱取紅芪干燥根1 000 g，粉碎，加950 mL/L乙醇，回流脫脂2 h；藥渣干燥后加水煎煮3次(煎煮時(shí)間分別為2 h、1.5 h、1 h)，合并煎煮液并濃縮；冷卻后加入950 mL/L 乙醇，充分混勻，靜置，離心得到沉淀。將沉淀溶于蒸餾水中，上清液用Sevage法去除蛋白質(zhì)，劇烈振蕩30 min后靜置12 h，離心，經(jīng)冷凍干燥后得到HPS，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組，模型對照組，維生素E組和 HPS高、中、低劑量組6組，每組10只，雌雄各半。

各組小鼠灌胃藥物劑量均按照體表面積[6]進(jìn)行換算，得到小鼠所需劑量。成人紅芪每日用量9～30 g，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物劑量和紅芪多糖提取率3.24%換算，HPS高、中、低劑量組等效劑量(生藥量)依次為6，3，1.5 g/(kg·d) 。正常對照組以 9 g/L 生理鹽水灌胃 10 μL/g，不行腹腔注射；模型對照組腹腔注射D-半乳糖120 μg/g[7]，灌胃9 g/L生理鹽水10 μL/g；維生素E組腹腔注射D-半乳糖120 μg/g，灌胃維生素E溶液50 μg/g； HPS高、中、低3個(gè)劑量組腹腔注射D-半乳糖120 μg/g，并依次灌胃紅芪多糖水溶液200,100,50 μg/g。連續(xù)42 d。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)

末次給藥24 h后，稱小鼠體質(zhì)量，經(jīng)眼眶取血后處死小鼠，取胸腺、脾臟。精確稱量胸腺、脾臟質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。計(jì)算公式如下：

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

1.5.2T淋巴細(xì)胞增殖能力和T淋巴細(xì)胞亞群

脾淋巴懸液的制備：將小鼠處死后置于750 mL/L的乙醇中浸泡，超凈臺下在無菌環(huán)境下取脾臟;用200目尼龍膜平鋪于裝有EZ-SepTMMOUSEIX淋巴細(xì)胞分離液的無菌培養(yǎng)皿上，將摘取的脾臟放置于尼龍膜上，使用適中力度進(jìn)行研磨，分離并提取淋巴細(xì)胞；將含有脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞分離液移至離心管，加入200 μL 1640完全培養(yǎng)液，離心后吸出淋巴細(xì)胞，再次加入10 mL 1640培養(yǎng)液經(jīng)吹打混勻，再次離心棄去上清，加入1640完全培養(yǎng)液，吹打混勻之后計(jì)數(shù)，調(diào)整淋巴細(xì)胞懸液濃度為1×107/mL為后續(xù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。

T淋巴細(xì)胞增殖能力測定：將制備好的淋巴細(xì)胞懸液調(diào)整為1×106/mL，加入96孔培養(yǎng)板中；每個(gè)樣本設(shè)8個(gè)復(fù)孔，其中4孔加ConA(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg/L)，另外4孔加含胎牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)液做陰性對照。每孔加淋巴細(xì)胞懸液100 μL，在培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)68 h后，取出并加入MTT(最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/L)10 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入100 μL 100 g/L SDS，吹打混勻，37 ℃放置過夜，于酶標(biāo)儀570 nm處測定OD值。按照下列公式計(jì)算刺激指數(shù)，以代表小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖程度。刺激指數(shù)(SI)=實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值

淋巴細(xì)胞亞群的測定: 取制備好的淋巴細(xì)胞懸液(1×107/mL)，在EP管中加100 μL，共分裝2組，每組6管，共12管。第一組每管加FITC-抗小鼠CD3 1 μL、PE/CY5-抗小鼠CD4(用PBS 稀釋10倍)3 μL、PE-抗小鼠CD28 2 μL，第二組每管加FITC-抗小鼠CD3 1μL、PerCP-抗小鼠CD8 1.25 μL、PE-抗小鼠CD28 2μL，混合均勻后4 ℃冰箱避光孵育30 min；加PBS洗滌2次，2 500 r/min離心5 min，棄上清，加500 μL PBS，吹打混勻；流式細(xì)胞儀檢測CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3+CD28+T淋巴細(xì)胞水平。

1.5.3血清IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α

將靜脈血自然靜置3 h，使血清充分析出，以1 500 r/min 離心10 min，收集血清。用生理鹽水將各組血清樣本稀釋10倍后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測血清IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的含量。具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，在酶標(biāo)儀450 nm波長測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以ng/L為單位，計(jì)算其含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)對比

模型對照組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)低于正常對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，HPS高、中劑量組和維生素E組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)提高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；低劑量組較之差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)對比　　±s

注：與正常對照組對比， **P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2各組小鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力對比

與正常對照組對比，模型對照組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)下降, 差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，HPS高、中劑量組和維生素E組的刺激指數(shù)增高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；低劑量組較之差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　各組小鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力對比±s

注：與正常對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，##P<0.01。

2.3各組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群對比

2.3.1各組小鼠CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T對比

與正常對照組對比，模型對照組CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分比均減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，HPS高、中、低劑量組和維生素E組CD3+T、CD3+CD4+T均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型對照組對比，HPS高、中劑量組和維生素E組CD3+CD8+T細(xì)胞升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與低劑量組對比，高劑量組CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細(xì)胞均升高明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中劑量組CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細(xì)胞均升高明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與HPS中劑量組對比，高劑量組CD3+T、CD3+CD4+T細(xì)胞升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3各組小鼠CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T對比

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)CD3+T/%CD3+CD4+T/%CD3+CD8+T/%正常對照組—63.07±4.0740.98±5.2523.03±5.17模型對照組0.1231.54±2.33**21.40±4.65**11.54±2.98**維生素E組0.0546.02±2.46##36.45±5.67##21.26±4.85##HPS高劑量組0.250.53±3.06##△△*38.17±3.26##△△*22.78±4.64##△△HPS中劑量組0.145.33±4.42##△△33.70±4.84##△△20.36±4.79##△△HPS低劑量組0.0537.67±2.34#27.72±4.31##14.42±2.49

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05， ##P<0.01；與HPS低劑量組對比，△△P<0.01；與HPS中劑量組對比，＊P<0.05。

2.3.2各組小鼠CD28分子表達(dá)對比

與正常對照組對比，模型對照組CD3+CD28-T細(xì)胞升高，CD3+CD28+T細(xì)胞降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，HPS高劑量組CD3+CD28-T細(xì)胞升高， HPS高、中、低劑量組和維生素E組CD3+CD28+T淋巴細(xì)胞明顯降低，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與低劑量組對比，HPS高、中劑量組CD3+CD28+T細(xì)胞升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與HPS中劑量組對比，高劑量組CD3+CD28+T細(xì)胞升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4　各組小鼠CD28分子表達(dá)對比

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01；與HPS低劑量組對比，△△P<0.01；與HPS中劑量組對比，＊P<0.05。

2.4各組小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α對比

與正常對照組對比，模型對照組血清IL-2、IFN-γ、IL-4降低，TNF-α升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，HPS高、中、低劑量組和維生素E組血清IL-2水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；HPS高、中劑量組和維生素E組血清IFN-γ、IL-4水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)； HPS高劑量組和維生素E組血清TNF-α水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與HPS低劑量組對比，高劑量組血清IL-2、IFN-γ、IL-4升高、TNF-α降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；中劑量組血清IFN-γ、IL-4水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與HPS中劑量組對比，高劑量組血清IL-2升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表5。

表5各組小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α對比

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)IL-2IFN-γIL-4TNF-α正常對照組—24.35±3.5397.63±4.0419.28±4.8350.26±2.82模型對照組0.1210.35±2.67**77.21±2.23**13.08±2.28**58.36±3.61**維生素E組0.0520.96±4.01##90.58±2.43##17.99±2.15##53.46±2.36##HPS高劑量組0.221.79±2.75##△△**91.35±2.57##△△18.15±3.76##△△53.74±2.81##△HPS中劑量組0.117.65±3.05##91.61±4.36#△△17.76±2.23##△56.86±4.65HPS低劑量組0.0514.77±3.81#80.23±4.0114.33±0.9257.76±4.76

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01；與HPS低劑量組對比，△P<0.05，△△P<0.01；與HPS中劑量組對比，＊＊P<0.01。

3結(jié)果

紅芪具有多種活性成分，包括紅芪多糖、黃酮、皂苷、氨基酸等。在對紅芪的藥理作用研究中發(fā)現(xiàn)，紅芪具有一定的抗癌活性，對心腦血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，還能提高體液免疫和細(xì)胞免疫能力，具有清除自由基和抗氧化作用等[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型對照組小鼠的臟器指數(shù)、T淋巴細(xì)胞增殖程度、T細(xì)胞亞群水平、血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α均與正常對照組存在明顯差異，表明亞急性衰老小鼠模型建立。HPS高、中、低劑量組均可提高小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，對衰老動(dòng)物模型免疫器官萎縮有一定的抑制作用，還可升高T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，HPS對亞急性衰老小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖能力有恢復(fù)作用，能夠升高T淋巴細(xì)胞亞群的百分比， CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3+、CD28+T細(xì)胞升高作用明顯，HPS具有一定的抗免疫衰老作用，可通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞作用來延緩衰老。HPS高、中、低劑量組小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α水平均發(fā)生不同程度變化。因此，HPS能有效改善亞急性衰老小鼠模型的免疫功能，糾正機(jī)體細(xì)胞因子的免疫失衡狀態(tài)。HPS 3個(gè)劑量組之間，高、中劑量組作用明顯，說明HPS劑量的高低會影響其抗免疫衰老作用，在一定劑量能增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，測定臟器指數(shù)可粗略估計(jì)免疫功能的強(qiáng)弱，對判斷是否衰老具有一定的參考價(jià)值。研究表明，免疫細(xì)胞的增殖及分化都會引起脾臟質(zhì)量的增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對照組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯低于正常對照組。胸腺和脾臟萎縮，反映出機(jī)體免疫功能減弱。與模型對照組對比，HPS高、中、低劑量組和維生素E組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)不同程度提高，說明紅芪多糖對亞急性衰老小鼠的胸腺及脾臟萎縮起到了抑制作用，對老齡小鼠的免疫器官有一定的保護(hù)作用，而且在HPS高、中劑量時(shí)的保護(hù)作用更加顯著。

T淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)[9]是檢測細(xì)胞免疫功能的常用方法之一，通過觀察實(shí)驗(yàn)藥物對T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響來判斷其對細(xì)胞免疫功能的影響，有較高靈敏度且結(jié)果可靠[10]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，模型對照組小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中刺激指數(shù)明顯降低，機(jī)體對ConA的增殖反應(yīng)能力下降，是衰老的免疫學(xué)特征之一。HPS高、中、低劑量組和維生素E組均不同程度升高了小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的刺激指數(shù)，其中HPS高、中劑量組升高作用明顯，說明紅芪多糖對亞急性衰老小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖能力有恢復(fù)作用，而且在HPS高、中劑量時(shí)的作用較明顯。

CD3是T細(xì)胞重要的表面抗原，通常以CD3+T細(xì)胞亞群代表T淋巴細(xì)胞總數(shù)。CD3+T細(xì)胞水平下降表示成熟T淋巴細(xì)胞減少，細(xì)胞免疫功能下降。外周血成熟T淋巴細(xì)胞又可以分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)通常表達(dá)CD4，而細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc細(xì)胞)表達(dá)CD8。Th細(xì)胞又分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞亞群，并產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子。通常Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的百分比、INF-γ、IL-4水平應(yīng)維持平衡。CD4+T和CD8+T在體內(nèi)免疫應(yīng)答時(shí)既相互協(xié)同又相互拮抗，其平衡失調(diào)會導(dǎo)致免疫功能紊亂。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型對照組與正常對照組相比，CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞降低，說明參與免疫功能的T細(xì)胞總數(shù)和T細(xì)胞亞群減少，而免疫功能的正常發(fā)揮是以足夠數(shù)量的免疫細(xì)胞為物質(zhì)基礎(chǔ)的，T細(xì)胞及其亞群的減少將會影響到如黏附功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等免疫功能，造成老齡個(gè)體的免疫功能降低。HPS高、中、低劑量組和維生素E組均使小鼠CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細(xì)胞百分比升高，說明紅芪多糖對亞急性衰老小鼠的T淋巴細(xì)胞及亞群有升高作用。

CD28分子是T細(xì)胞表面重要的共刺激分子， CD28分子表達(dá)的缺失是免疫衰老的重要標(biāo)志之一[11]，隨著年齡的增加，CD28分子的表達(dá)逐漸下降甚至喪失[12]。CD28表達(dá)水平的降低會使T細(xì)胞缺乏共刺激信號而失去免疫功能，在無CD28信號時(shí)，TCR表現(xiàn)為失活狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組CD3+CD28+T細(xì)胞明顯減少，提示由其介導(dǎo)的免疫功能已經(jīng)降低。HPS高、中、低劑量組和維生素E組不同程度升高了小鼠CD3+CD28+T細(xì)胞百分比，并且在HPS高、中劑量時(shí)的作用表現(xiàn)的較為明顯。

白細(xì)胞介素(IL-1、IL-2、IL-4等)、干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)等是重要的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。與衰老關(guān)系最密切的是IL-2，是參與免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子[13]。研究表明，老齡小鼠T細(xì)胞分泌IL-2含量和活性均比青齡小鼠明顯降低[14]。本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組小鼠IL-2水平明顯降低，在HPS作用后，HPS 3個(gè)劑量組小鼠IL-2水平均升高，促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞分泌IL-2的能力。IL-4是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)中，HPS 3個(gè)劑量均能不同程度升高IL-4水平，說明能夠增強(qiáng)小鼠的體液免疫。

機(jī)體的IL-4和INF-γ通常維持在相對平衡的狀態(tài)，對小鼠免疫系統(tǒng)的正常功能具有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組小鼠IFN-γ水平明顯降低，在經(jīng)HPS作用后，HPS 3個(gè)劑量組小鼠IFN-γ水平均升高，從而促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖、分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。

腫瘤壞死因子為一類能引起腫瘤組織出血壞死的細(xì)胞因子，是重要的促炎性細(xì)胞因子，在慢性炎癥中發(fā)揮重要作用。TNF-α可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞的增殖及凋亡，腫瘤發(fā)生和衰老等與其相關(guān)，TNF-α與受體結(jié)合后能夠通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起自由基產(chǎn)生過量，進(jìn)而加速機(jī)體的衰老[15]。本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組TNF-α升高，在血清中表達(dá)有增加的趨勢，在衰老過程中可能存在慢性炎癥。紅芪多糖3個(gè)劑量組和維生素E組TNF-α均不同程度下降，減輕了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，可能對機(jī)體衰老的慢性炎癥過程有對抗作用。

本實(shí)驗(yàn)中，對紅芪多糖高、中、低劑量組相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后表明， HPS高、中劑量組作用較顯著，說明紅芪多糖在一定劑量能夠糾正機(jī)體細(xì)胞因子的免疫失衡狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。

4參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[2]楊林,譚玉玲.中藥紅芪研究現(xiàn)狀[J].中外醫(yī)療，2010,5(5):120-121.

[3]AGARWAL S, BUSSE PJ.Innate and adaptive immunosenescence[J].Annals of Allergy, Asthma & Immunology，2010, 104(3):183-190.

[4]龔國清,徐黻本.小鼠衰老模型研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991,22(2):101-103.

[5]韋巍,李雪華.多糖的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)(藥學(xué)分冊)，2005,32(3):179-184.

[6]黃繼漢,黃曉暉,陳志揚(yáng),等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算[J].中國臨床藥理與治療學(xué)，2004, 9(9): 1069-1072.

[7]朱亞珍,朱虹光.D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型的建立及其檢測方法[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007,34(4):617-619.

[8]程衛(wèi)東,李順保.紅芪研究與開發(fā)[M].蘭州:甘肅文化出版社,2012.

[9]HEROLD KC, PESCOVITZ MD, MCGEE P, et al.Increased T cell proliferative responses to islet antigens identify clinical responders to anti-CD20 monoclonal antibody(rituximab) therapy in type 1 diabetes[J].Journal of immunology，2011,187(4)：1998-2005.

[10]WANG LISHENG, SUN JUNHONG, MARGRET HORVAT.Evaluation of MTS, XTT, MTT and 3HTdR incorporation for assessing hepatocyte density[J].Methods in Cell Science，1996, 18(3):249-255.

[11]MALAGUARNERA L, FERLITO L, IMBESI RM, et al.Immunosenescence : a review[J].Archives of Gerontology and Geriatrics，2001, 32(1):1-14.

[12]VALLEJO ABBE N.CD28 extinction in human T cells: altered functions and the program of T cell senescence[J].Immunological Reviews，2005, 205:158-69.

[13]張錫濤,賀松其,劉永源,等.二陳湯對亞急性衰老小鼠器官指數(shù)及自由基代謝的影響[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002,5(4):1.

[14]曹雪濤.白細(xì)胞介素-2的基礎(chǔ)與臨床[M].北京:北京科技出版社，1990.

[15]周建軍,高云飛,王宏芳,等.TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老[J].科學(xué)通報(bào)，2001,46(19):1636-1640.

(編輯陶珠)

文章編號:1001-6910(2016)06-0063-06

中圖分類號:R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.06.31

通信作者：程衛(wèi)東，博士，教授，博士生導(dǎo)師，chengweidong888@sina.com

* 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373806)；甘肅省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(GZK-2012-43)；甘肅省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(GZK-2013-18)

收稿日期：2015-04-23；修回日期：2016-03-28