缺氧缺血致腦白質(zhì)損傷的新生大鼠腦中ephrinB2和EphB4表達的研究

房貴巍，　張麗華，　許洪偉，　孫穎

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實驗論著

缺氧缺血致腦白質(zhì)損傷的新生大鼠腦中ephrinB2和EphB4表達的研究

房貴巍，張麗華，許洪偉，孫穎

154000 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學康復醫(yī)學院研究生處(房貴巍)；154002 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學附屬第三醫(yī)院腦癱康復二科(張麗華，許洪偉，孫穎)；佳木斯大學兒童神經(jīng)康復實驗室(張麗華，許洪偉，孫穎)

【摘要】目的評估缺氧缺血誘導的腦白質(zhì)損傷大鼠模型腦組織中的微血管密度和ephrinB2及其受體EphB4表達的水平。方法將新生3日齡Wistar大鼠60只隨機分為實驗組和假手術(shù)組各30只。實驗組行右側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎后給予氮氧混合氣體(94% N2+6% O2)4 h；假手術(shù)組只分離右側(cè)頸總動脈但不結(jié)扎并常規(guī)給氧。4 d后分別測定第7日齡大鼠腦組織中微血管密度以及ephrinB2和EphB4表達的水平。結(jié)果實驗組大鼠腦組織中的微血管密度、ephrinB2和EphB4的水平高于假手術(shù)組；假手術(shù)組大鼠腦組織中表達的ephrinB2和EphB4的百分比相近，實驗組大鼠腦組織中ephrinB2的表達高于EphB4。結(jié)論缺氧缺血誘導的腦白質(zhì)損傷后有新生血管生成，并且動脈多于靜脈。

【關(guān)鍵詞】腦白質(zhì)損傷；缺氧缺血；微血管密度；ephrinB2；EphB4；大鼠

近年來，隨著新生兒救治水平的提高，早產(chǎn)兒的存活率也隨之提高，然而幸存下來的早產(chǎn)兒，尤其是那些極低出生體重兒卻容易產(chǎn)生腦損傷，導致認知、行為障礙、腦性癱瘓等后遺癥，這已經(jīng)成為了嚴重的公共健康問題[1]。腦白質(zhì)損傷又稱腦室周圍白質(zhì)軟化，是早產(chǎn)兒腦損傷的主要神經(jīng)病變[2-3]。腦白質(zhì)損傷可分為兩種形式：局灶性損傷和彌漫性損傷，這種局灶性和彌漫性損傷在一定程度上似乎與供應腦白質(zhì)血管的發(fā)展有關(guān)。在早產(chǎn)兒腦中這些血管的末端沒有得到充分發(fā)育，因此，腦血流量減少，這些區(qū)域遭受嚴重缺血[4]。Marti等[5]在中動脈梗阻小鼠模型的大腦中發(fā)現(xiàn)梗死后48～72 h，梗死灶的周圍血管數(shù)增多，提示有新生血管生成，表明腦組織缺氧缺血后存在反應性的新生血管生成。新生血管生成是指由血管內(nèi)皮細胞出芽形成血管網(wǎng)絡(luò)的復雜過程，主要包括兩種形式：血管發(fā)生和血管生成。血管發(fā)生是內(nèi)皮細胞前體形成內(nèi)皮血管的過程；血管生成是從已有血管出芽形成新的血管的過程[6]。Eph(erythropoietin-producing hepatocyte)受體EphB4及其配體ephrinB2是酪氨酸激酶受體家族中最大的成員[7]。血管生成的早期階段，ephrinB2特異地表達在動脈內(nèi)皮細胞上，而EphB4則特異地表達在靜脈內(nèi)皮細胞上，EphB4/ephrinB2這種分布不同提示EphB4/ephrinB2參與原始的血管向動靜脈分化的過程；也提示EphB4/ephrinB2參與調(diào)節(jié)動靜脈血管的分布[8-9]。本研究旨在研究缺氧缺血誘導的腦白質(zhì)損傷大鼠模型腦組織中的微血管密度和ephrinB2及其受體EphB4表達的水平，以確定新生血管的正確分配。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組新生3日齡清潔級Wistar大鼠60只，性別不限，由佳木斯大學動物實驗室提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(黑)-2013-001。60只大鼠按隨機數(shù)字表法分為實驗組和假手術(shù)組各30只。

1.2缺氧缺血動物模型制備實驗組大鼠于室溫下乙醚麻醉，仰臥位固定，頸部周圍皮膚消毒，沿正中線作頸部切口，找到并游離右側(cè)頸總動脈，近心端結(jié)扎后剪斷。該過程持續(xù)時間<10 min，剔除出血過多的大鼠。術(shù)后2 h將大鼠放入37 ℃恒溫密閉箱內(nèi)，向箱內(nèi)通氮氧混合氣體(94% N2+6% O2)，持續(xù)時間4 h，然后取出并放回母鼠籠中進行飼養(yǎng)4 d[10]。這個過程誘導腦室周圍白質(zhì)的主要病變。病理檢查可見腦白質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)細胞胞體腫脹、小膠質(zhì)細胞增生、星形膠質(zhì)細胞肥大、膠質(zhì)細胞排列紊亂、核固縮變圓，上述腦白質(zhì)損壞的病理過程和臨床床邊B超核磁共振等所見到的過程相一致。假手術(shù)組大鼠僅游離右側(cè)頸總動脈，不做結(jié)扎處理并正常給氧。

1.3測定微血管密度于室溫下將制備成功的實驗組缺氧缺血大鼠用乙醚麻醉后仰臥位固定在手術(shù)臺上，用手術(shù)用小剪刀剪開大鼠劍突下皮膚、橫膈膜及左右肋弓，再沿中線剪開肋骨，使心臟充分暴露。心尖插入灌注針頭，灌注液為常溫滅菌生理鹽水，與此同時剪開右心耳，開放靜脈血，待大鼠前肢以及兩肺發(fā)白以后，將灌注液換成4%多聚甲醛。待灌注大鼠身體僵硬后，開始斷頭，用大剪刀剪開頭皮，暴露頭及頸段，分離并去除后頸部肌肉，用彎鉗剔除顱骨，過程中注意避免劃傷腦組織，暴露大腦后小心剝離，取出腦組織(冠狀面上視覺交叉前后3 mm)。在4 ℃下，于4%多聚甲醛/0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液的固定液中固定12～14 h。脫水、透明、浸蠟、包埋，并制成厚度為10 μm的切片，多聚賴氨酸處理玻片。再在4 ℃下，將切片與抗CD34一級抗體(10 mg/L，北京奧博森生物技術(shù)有限公司)一起培養(yǎng)12～14 h，然后在室溫下與抗山羊二級抗體(1∶1 000，艾博抗上海貿(mào)易有限公司)一起培養(yǎng)2 h。假手術(shù)組大鼠做同樣處理。腦組織中的微血管密度在200倍鏡下進行計數(shù)，由于計數(shù)微血管的方法在觀察者之間存有差異，因此選定兩位不知情的獨立觀察者進行操作。每個被標記的CD34內(nèi)皮細胞間接觸定義為一個微血管，每一組細胞作為一個單獨的血管被計數(shù)[11]。每個樣本取2張切片，每張切片選擇相同的3個不重復視野進行微血管計數(shù)，求其平均數(shù)，作為微血管密度值。

1.4實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定ephrinB2及EphB4的水平用Trizol(上海生物工程有限公司)一步法提取腦組織總的RNA，總RNA的1 μg用于反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時RT-PCR測定ephrinB2及EphB4的mRNA的水平。用于擴增的引物對分別如下：ephrinB2，上游引物5′-CTG GTA CGA ATG GGA GAA GTT-3′，下游引物5′-GAG CAG CAG CAC CAC CAA-3′；EphB4，上游引物5′-GGC ACG GTA CCA AGG TCT AC-3′；下游引物5′-ACC TCT TCA ATC TTG ACA TAG GAG-3′；β-肌動蛋白，上游引物5′-CTG AAC CCT AAG GCC AAC C-3′，下游引物5′-AGC GCG TAA CCC TCA TAG AT-3′。引物由上海生物工程有限公司合成提供。β-肌動蛋白是作為內(nèi)部控制的參照基因。使用ABI7500快速系統(tǒng)進行(美國應用生物系統(tǒng)公司)定量RT-PCR測定。擴增條件：95 ℃下cDNA變性2 min(95 ℃ 10 s→60 ℃ 40 s)循環(huán)30次。使用2-ΔΔCt方法對相關(guān)基因的表達進行分析。

2結(jié)果

2.1腦損傷大鼠腦組織中微血管密度比較在缺氧缺血損傷后4 d，即第7日齡大鼠，在腦白質(zhì)周圍區(qū)域檢測到CD34標記的內(nèi)皮細胞間接觸。實驗組微血管密度為3.25±0.97，高于假手術(shù)組1.60±0.76，差異有統(tǒng)計學意義(t=-10.37，P<0.05)。

2.2腦損傷大鼠腦組織中新生血管的分配見表1。

表1　大鼠腦組織中血管表達的ephrinB2和EphB4的百分比及其mRNA表達水平比較±s)

注：與假手術(shù)組比較，at=-6.33，-3.39，P<0.05；與EphB4比較，bt=20.40，P<0.05。

表1結(jié)果表明，假手術(shù)組ephrinB2和EphB4的mRNA水平均低于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠腦組織中血管表達的ephrinB2和EphB4的百分比相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗組大鼠腦組織中多數(shù)血管表達ephrinB2，少數(shù)血管表達EphB4，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3討論

在早產(chǎn)兒大腦中，供應腦白質(zhì)的動脈末端區(qū)域未完全發(fā)育，導致血流量減少。由于血流量減少，這些區(qū)域在腦白質(zhì)損傷早產(chǎn)兒腦組織中很容易受損。新生血管生成除了有助于正常腦的發(fā)育，還可改善腦損傷組織血流供應，促進神經(jīng)修復，清除壞死組織，對早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的修復有重要作用[12]。由于免疫反應性CD34主要表達在血管內(nèi)皮祖細胞中[13]，所以通過CD34標記的微血管密度研究血管內(nèi)皮祖細胞的增殖，以了解血管的新生情況。本研究中，可觀察到缺氧缺血誘導的腦白質(zhì)損傷大鼠腦組織CD34+細胞首先以單個細胞出現(xiàn)，然后以細胞-細胞接觸的形式進行累積，表明有新生血管生成。雖然在假手術(shù)組中也有新生血管生成，但是比實驗組大鼠腦組織中明顯要少。本研究結(jié)果表明，缺氧缺血促進CD34+細胞聚集形成微血管系統(tǒng)。

EphB4是一種跨膜酪氨酸激酶蛋白，由Bennett等[14]在人類CD34+骨髓單核細胞和肝癌細胞株Hep3B中克隆出。EphB4的特異性配體EphrinB2是一種跨膜蛋白，于1995年在鼠腎小球系膜細胞株SV40MES13中成功克隆出[15]。EphrinB2除了能和EphB4結(jié)合外，還能和EphB1、EphB3等其他的B類受體相結(jié)合，但是EphB4只與ephrinB2結(jié)合[16]?；蚯贸齟phrinB2和EphB4導致多數(shù)的血管缺陷和胚胎致死[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，血管生成的最早階段，動脈和靜脈血管內(nèi)皮分子截然不同，這種不同是通過動脈內(nèi)皮細胞上ephrinB2的表達及其在靜脈內(nèi)皮細胞上同源受體EphB4的表達區(qū)分的[18-19]。ephrinB2和EphB4這種表達的顯著不對稱性提供了最早區(qū)分動、靜脈內(nèi)皮的標記，也提示ephrinB2和EphB4的表達與動靜脈的形成有關(guān)，被認為有利于防止血管形成過程中動靜脈的融合。有研究表明，靶向去除EphrinB2或EphB4的鼠胚導致動、靜脈無法界定[20]。本研究中定量分析了腦白質(zhì)損傷早產(chǎn)大鼠腦組織中ephrinB2和EphB4的表達水平，發(fā)現(xiàn)ephrinB2和EphB4在正常早產(chǎn)大鼠腦組織中表達，而在缺氧缺血損傷后上調(diào)。在假手術(shù)組大鼠大腦組織中，動脈和靜脈的百分比相似，然而，在實驗組動脈的百分比較多。這些結(jié)果表明，新生血管生成主要發(fā)生在缺氧缺血誘導的腦白質(zhì)損傷的動脈。

綜上所述，缺氧缺血誘導的腦白質(zhì)損傷后有新血管生成，并且動脈多于靜脈。在缺血性疾病時，為了向缺血的組織提供新的血液供應必然需要的是動脈血管的生成，因為只有動脈血管生成才能提供足夠的血液到缺血區(qū)。然而目前治療性血管生成等措施并沒有明確動靜脈生成的差異。故缺氧缺血誘導的腦白質(zhì)損傷大鼠模型中的血管生成以及生成血管分配的特異性，可以為促血管新生因子或抗血管新生因子及藥物是否具有動脈選擇性提供檢驗的可能，有重要的理論和臨床價值。

參考文獻

[1]黃志恒.早產(chǎn)兒腦病的研究現(xiàn)狀[J].中國當代兒科雜志,2011,13(10):771-773.

[2]Okada S,Makino H,Nagumo A,et al.Circulating CD34-positive cell number is associated with brain natriuretic peptide level in type 2 diabetic patients[J].Diabetes Care，2008，31:157-158.

[3]Volpe JJ.Brain injury in premature infants:a complex amalgam of destructive and developmental disturbances[J].Lancet Neurol，2009，8:110-124.

[4]Volpe JJ.Neurobiology of periventricular leukomalacia in the premature infant[J].Pediatr Res，2001，50:553-562.

[5]Marti HJ,Bemaudin M,Bellail A，et al.Hypoxia-induced vascular growth factor expression precedes neovascularization after cerebral ischemia[J].Am J Pathol，2000，156(3):965-976.

[6]Vadivel A,van Haaften T,Alphonse RS,et al.Critical role of the axonal guidance cue Ephrinb2 in lung growth,angiogenesis,and repair[J].Am J Resp Crit Care，2012，185:5-6.

[7]Lackmann M,Boyd AW.Eph,a protein family coming of age:more confusion,insight,or complexity[J].Sci Signal，2008，1(15):re2.

[8]Adams RH,Diella F,Hennig S,et al.The cytoplasmic domain of the ligand EphrinB2 is required for vascular morphogenesis but not cranial crest migration[J].Cell,2001,104(1):57-69.

[9]Wang HU,Chen ZF,Anderson DJ.Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4[J].Cell,1998,93:741-753.

[10]Back SA,Han BH,Luo NL,et al.Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia[J].J Neurosci,2002,22:455-463.

[11]Li ZQ,Gong LL,Wen ZH,et al.Deltalike ligand 4 correlates with endothelial proliferation and vessel maturation in human malignant glioma[J].Onkologie，2012，35:763-768.

[12]Ergul A,Alhusban A,Fagan SC.Angiogenesis:a harmonized target for rcovery after stroke[J].Stroke,2012，43(8):2270-2274.

[13]Fan YF,Shen FX,Frenzel T,et al.Endothelial progenitor cell transplantation improves long-term stroke outcome in mice[J].Ann Neurol，2010，67:488-497.

[14]Bennett BD,Wang Z,Kuang WJ,et al.Cloning and characterization of HTK,a novel transmembrane tyrosine of the EPH subfamily[J].J Biol Chem,1994,269(19)：14211-14218.

[15]Chrencik JE,Brooun A,Kraus ML,et al.Structural and biophvsical characterization of the EphB4/ephrinB2 protein-protein interaction and receptor specificity[J].J Biol Chem,2006,281(38):28185-28192.

[16]Bergem AD,Zhang L,Chiang MK,et al.Ephrin-B3,a ligand for the receptor EphB3,expressed at the midline of the developing neural tube[J].Oncogene,1998,16(4):471-480.

[17]Gerety SS,Wang HU,Chen ZF,et al.Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development[J].Mol Cell，1999，4:403-414.

[18]Zhang J,Hughes S.Role of the ephrin and Eph receptor tyrosine kinase families in angiogenesis and development of the cardiovascular system[J].J Pathol,2006,208(4):453-461.

[19]Wang Y,Nakayama M,Pitulescu ME,et al.Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis[J].Nature,2010,465(7297):483-486.

[20]Goldshmit Y,McLenachan S,Turnley A.Roles of Eph receptors and ephrins in the normal and damaged adult CNS[J].Brain Res Rev，2006，52:327-345.

(本文編輯：劉穎)

Expression of ephrinB2 and EphB4 in a neonatal rat model of periventricular white matter damage resulting from hypoxia-ischemia

FANGGuiwei,ZHANGLihua,XUHongwei,SUNYing.

TheThirdAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity，ChildrenNeuralRehabilitationLaboratoryofJiamusiUniversity，Jiamusi154000，China.

【Abstract】ObjectiveTo evaluate microvessel density (MVD) and the expression of ephrinB2 and its receptor EphB4 in a hypoxia-ischemia induced PWMD rat model.MethodsPostnatal day 3 Wister rats(n=60) were randomly divided into hypoxia ischemia group(group HI),sham operation group(control group),with 30 rats in each group.The HI group underwent permanent ligation of the right common carotid artery then they were exposed to hypoxia (94% N2+6% O2) for 4 hours.For the control group rats,the same surgery was performed except for ligation and exposure to hypoxia.MVD and levels of ephrinB2 and EphB4 were determined at postnatal day 7.ResultsCompared with control group,MVD,ephrinB2 and EphB4 levels were higher in the brains of hypoxic-ischemic rats.Similar percentages of vessels expressed ephrinB2 and EphB4 in control group,but expression of ephrinB2 was greater in brains injured by hypoxia-ischemia.ConclusionFollowing hypoxic-ischemic injury to the rat brain,there were angiogenesis and more arterioles than venules are acquired.

【Keywords】Periventricular white matter damage；Hypoxia-ischemia；Microvessel density； EphrinB2；EphB4；Rat

作者簡介：房貴巍(1990-)，女，佳木斯大學康復醫(yī)學院2013級碩士研究生在讀。研究方向：小兒腦性癱瘓的綜合康復治療 通訊作者：張麗華，E-mail：zhanglihua59597@qq.com

doi：10.3969/j.issn.1674-3865.2016.03.003

【中圖分類號】R364.4

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-3865(2016)03-0257-04

(收稿日期：2016-02-19)