12個白花泡桐種源的遺傳多樣性分析

李海英, 茹廣欣, 侯 婷, 李翰書(. 河南農(nóng)業(yè)大學, 河南 鄭州450002； 2. 華北水利水電大學, 河南 鄭州 4500)

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12個白花泡桐種源的遺傳多樣性分析

李海英1,2, 茹廣欣1, 侯 婷1, 李翰書1
(1. 河南農(nóng)業(yè)大學, 河南 鄭州450002； 2. 華北水利水電大學, 河南 鄭州 450011)

采用AFLP分子標記對12個白花泡桐種源進行遺傳多樣性分析，篩選出8對引物組合，共擴增出980個多態(tài)性位點，平均每對引物擴增的總帶數(shù)為122.5條，多態(tài)性條帶百分率為97.32%，有效等位基因數(shù)為1.228 5～1.263 9，Nei基因多樣性指數(shù)為0.164 6～0.189 1，Shannon信息指數(shù)變化為0.275 4～0.307 2。這些表明白花泡桐具有豐富的遺傳性。經(jīng)UPMGA聚類分析, 將12個白花泡桐種源分為3類，聚類結(jié)果與材料的地理來源有一定的相關(guān)性。

白花泡桐；種源；AFLP；遺傳多樣性

白花泡桐(Paulowniafortunei) 原產(chǎn)中國，隸屬于玄參科(Scrophulariaceae)泡桐屬(Paulownia)，是泡桐屬中一個優(yōu)良速生樹種，具有生長快、干形好、樹體高大、抗病性強等特點[1]。白花泡桐的自然分布區(qū)在北緯20°～30°、東經(jīng)100°～122°之間，長江流域以南分布廣泛。由于悠久的栽培歷史和分布區(qū)內(nèi)多變的生態(tài)環(huán)境條件，白花泡桐的種內(nèi)變異十分豐富。長期以來，由于生態(tài)環(huán)境的惡化以及人為砍伐，導致速生樹種白花泡桐種質(zhì)資源流失嚴重，部分種源分布區(qū)日益縮小，種源數(shù)量急劇下降，嚴重威脅著中國珍貴的白花泡桐資源的生存和發(fā)展，因此，對于白花泡桐種質(zhì)資源的調(diào)查和收集，并進行遺傳多樣性的系統(tǒng)性研究迫在眉睫。為了充分利用其種內(nèi)變異特性，研究各層次變異的規(guī)律性，馬浩等[2]進行了白花泡桐種源、家系和個體的多水平試驗和優(yōu)良家系選擇。蘇金樂等[3]對白花泡桐不同種源葉片比較解剖學研究，探究其解剖構(gòu)造的差異性及其與生態(tài)環(huán)境的關(guān)系。近年來，研究人員利用RAPD，RFLP，ISSR等分子標記對泡桐屬植物的遺傳多樣性進行了研究[4-6]，國外對于白花泡桐的研究也主要集中在生長特性和理化性質(zhì)等方面[7-9]。AFLP分子標記技術(shù)多態(tài)性高，重復性好，可以提供大量的遺傳變異信息, 是研究種源遺傳多樣性水平的有力工具[10-11]。本研究采用AFLP技術(shù)，以白花泡桐主要分布區(qū)的12個種源為試驗材料進行遺傳多樣性分析，揭示其遺傳變異規(guī)律，為白花泡桐種質(zhì)資源保護及合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來自中國5個省的12份白花泡桐種源，種源分布區(qū)位于23°24′～29°34′ N，106°72′～120°02′ E。材料見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 12個白花泡桐種質(zhì)基因組 DNA提取 采用改良CTAB法[10-11]提取，從硅膠干燥的幼葉中提取總DNA，提取的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和核酸測定儀檢測其濃度和純度，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 用篩選出的8對引物組合(表2)經(jīng)熒光標記后進行選擇性擴增(對Mse I引物的5’端進行熒光標記)。25 μL擴增體系中含有2 μL預擴稀釋樣品，2.5 μL 10×PCR buffer，0.5 μL dNTPs，Pst I和Mse I引物各1 μL，0.5 μL Taq酶，最后用ddH2O補足體系。將上述體系混勻，離心數(shù)秒后，按下列擴增程序進行選擇性擴增，第1輪擴增參數(shù)：94 ℃擴增 30 s，64 ℃預變(以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃)30 s，72 ℃延伸 80 s，擴增12輪；然后94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s 再擴增23輪；最后72 ℃ 延伸5 min，4 ℃保存。

表1 白花泡桐供試材料Table 1 The tested P.fortunei in this study

表2 不同引物組合在白花泡桐種源中的擴增多態(tài)性Table 2 The polymorphism of different primers combination in P.fortunei provenances

1.2.3 電泳與數(shù)據(jù)分析 擴增后的樣品在ABI 377自動測序儀上電泳分離檢測，得到AFLP的指紋圖譜，通過GeneScan 3.1軟件生成由“l(fā)”和“0”組成的原始矩陣。采用軟件POPGENE 1.32對12個白花泡桐種源分別計算多態(tài)性條帶(AP)、多態(tài)位點百分率(P)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)，種群水平的Nei′s遺傳距離(D) 。運用NT-SYSpc2.10進行UPGMA聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 12種白花泡桐種質(zhì)基因組DNA的AFLP 擴增片段多態(tài)性

試驗采用8對AFLP選擇性引物對12份白花泡桐種質(zhì)基因組DNA進行了AFLP擴增分析，都得到了清晰的多態(tài)性指紋圖譜。在白花泡桐12個種源共檢測到大小為70～500 bp的多態(tài)性條帶980條，平均每對引物擴增的總帶數(shù)為122.5條，多態(tài)帶比例為97.32%(表2)，這表明12份白花泡桐種源具有高比例的多態(tài)性條帶。其中P-GTG/M-CAG檢測到的多態(tài)性條帶最多，為148條，P-GAT/M-CAG檢測到的最少，為86條，P-GAA/M-CAG， P-GAA/M-CAC ，P-GAG/M-CAG，P-GTG/M-CAC這4對引物效率最高，其產(chǎn)生位點的多態(tài)性條帶比率達到100%，而引物P-GAT/M-CAG擴增出的條帶的多態(tài)性比率最低，其多態(tài)性條帶比率93.47%，表明8對引物組合具有較強的檢測白花泡桐種源內(nèi)及種源間遺傳變異的能力。

衡量種群遺傳多樣性最常用的指標有多態(tài)位點比率(P)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)。統(tǒng)計結(jié)果表明(表3)，白花泡桐種源多態(tài)位點比率變化為77.42%～81.56%，平均為79.72%。平均有效等位基因數(shù)變化為1.228 5～1.263 9，平均為1.243 0。Nei基因多樣性指數(shù)變化為0.164 6～0.189 1,平均為0.173 9。Shannon信息指數(shù)變化為0.275 4～0.307 2，平均為0.2908，而其種級水平分別達到1.245 3，0.181 8和0.314 9。分析結(jié)果說明，12個白花泡桐種源具有豐富的遺傳多樣性。此外，不同白花泡桐種源的遺傳多樣性也存在顯著差異，其中湖南懷化和江西吉安的Nei基因多樣性指數(shù)值和Shannon信息指數(shù)都較大，而來自貴州凱里及遵義種源的Nei基因多樣性指數(shù)值和Shannon信息指數(shù)都較小。這些數(shù)據(jù)表明，白花泡桐的12個種源具有較為豐富的遺傳多樣性，其中來自湖南懷化、江西吉安和江西九江等遺傳多樣性水平較高，而來自貴州的種源多樣性水平較低。

表3 白花泡桐種源遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of P.fortunei provenances

注:Na，等位基因數(shù);Ne，有效等位基因數(shù);H，Nei基因多樣性指數(shù);I，Shannon信息指數(shù)。

Note:Na，means observed number of alleles;Ne，means effective numner of alleles;H，means Nei’s gene diversity;I，means Shannon’s information index.

2.2 12種白花泡桐種源的遺傳一致度和遺傳距離分析

遺傳一致度和遺傳距離作為進一步分析種群間遺傳分化程度的依據(jù)，從相同和相反的方向?qū)z傳關(guān)系進行分析。本試驗利用POPGENE 32軟件，計算了種群間的Nei′s遺傳距離和遺傳一致度[12]。從表4可以看出，白花泡桐遺傳一致度變化范圍為0.985 2～0.994 5，遺傳距離為0.006 1～0.014 8，遺傳一致度最大的來自貴州遵義和貴州凱里的種群之間(0.994 5)，其遺傳距離最小(0.006 5)，而湖南懷化和貴州遵義的遺傳一致度最小(0.985 2)，遺傳距離最大(0.014 8)。

表4 白花泡桐種群的遺傳一致度和遺傳距離Table 4 Genetic identity and genetic distance of P.fortunei populations

注：表中對角線以上的數(shù)據(jù)為Nei′s遺傳一致度，以下為遺傳距離。

Note：Nei′s genetic identity(above diagonal )and genetic distance(below diagonal).

2.3 12種白花泡桐種源的聚類分析

采用NT-SYSpc 2.1軟件，根據(jù)白花泡桐Nei′s遺傳距離，對12個種源進行UPGMA聚類分析(圖1)。從圖1中可以看出，種源之間的遺傳相似系數(shù)分布范圍為0.46～0.66。12個白花泡桐種源分為3類：第1類包括10個種源，有湖南常德、廣東韶關(guān)、貴州遵義、貴州凱里、福建福州、福建南平、福建三明、福建龍巖、江西九江；第2類包括湖南懷化1個種源；第3類為1個江西吉安種源。聚類圖顯示，地理來源相近的種源基本聚在一起，通過Mantel相關(guān)性檢驗，地理距離和遺傳距離之間呈正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著(r=0.210 5 ,P= 0.062 1)。

圖1 12種白花泡桐種源聚類圖Fig.1 Dendrogram of 12 kinds of P. fortunei provenances

3 結(jié)論與討論

白花泡桐是泡桐中的原始種，但當其在地球上出現(xiàn)以后，泡桐屬內(nèi)很快變得復雜起來，成為當今許多雜交種的直接或間接親本。本研究對白花泡桐的12個種源進行遺傳多樣性分析，8對AFLP引物共擴增出多態(tài)性條帶980條，多態(tài)帶比率為97.32%，多態(tài)位點百分率變化為77.42%～51.56%，平均有效等位基因數(shù)變化為1.228 5～1.263 9， Nei基因多樣性指數(shù)變化為0.156 6～0.188 7，Shannon信息指數(shù)變化為0.269 2～0.311 7。李芳東等[13]采用ISSR技術(shù)篩選出9條引物對38個白花泡桐種源進行擴增分析，白花泡桐不同引物的多態(tài)位點為73.73%～100.00%,物種水平的多態(tài)位點比率為92.63%，Shannon信息指為0.376，Nei指數(shù)為0.242 4，都反映白花泡桐物種水平遺傳多樣性高。與他們的結(jié)果相比，本研究采用AFLP技術(shù)擴增條帶多，多態(tài)性位點的比率高，說明AFLP技術(shù)可以有效地檢測白花泡桐種源的遺傳多樣性水平。這表明AFLP一種檢測效率很高的分子標記技術(shù)。

遺傳多樣性是物種或居群長期進化的產(chǎn)物，也是其生存、適應和發(fā)展、進化的前提[14]。植物的遺傳多樣性水平與泡桐的進化歷史有關(guān)。從有關(guān)泡桐古植物的資料來看, 泡桐在第四紀以前分布區(qū)十分廣泛，可能是由于在第四紀冰期來臨期間泡桐被迫退卻或在間冰期向北擴展，為了適應各種復雜環(huán)境的結(jié)果，泡桐保留了其豐富的遺傳基礎。

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(責任編輯：常思敏)

Genetic diversity analysis of 12 kinds ofPaulowniafortuneiprovenances

LI Haiying1,2， RU Guangxin1， HOU Ting1， LI Hanshu1
(1. Henan Agricultural University ，Zhengzhou 450002,China； 2. North China University of Water Resources and Electric Power, Zhengzhou 450011,China)

Using AFLP molecular markers,the genetic diversity and relationships of 12Paulowniafortuneiprovenances were studied. 8 pairs were screened from 64 primer combinations,obtaining 980 polymorphic locis. On the average each pair of primers amplification produced 122.5 locis. The percentage of polymorphic bands was 97.32%. The effective number of alleles was 1.2285 to 1.2639. Nei′s genetic diversity and Shannon′s information diversity index ranged from 0.1646 to 0.1891 and from 0.2754 to 0.3072, indicating a rich genetic diversity amongPaulowniafortuneiprovenances. Cluster analysis (UPMGA) results showed that 12Paulowniafortuneiprovenances were divided into 3 groups. The clustering results and the material source of geography had certain relevance.

Paulowniafortunei; provenances; AFLP; genetic diversity

2015-06-10

國家科技支撐計劃專題(2013BAD01B06) ;鄭州市科技領(lǐng)軍人才計劃(10LRC177)

李海英(1974-)，女，河南滑縣人，博士研究生，從事林木遺傳育種方向研究。

茹廣欣(1963-)，男，河南洛陽人，教授，博士生導師。

1000-2340(2015)06-0764-05

S 792.43

A