皇竹草急性毒性實驗研究

趙友華 伍曉春 黃婧怡 鄒盛勤 易增興

摘要：目的 通過小鼠急性毒性試驗研究，對皇竹草的安全性作出初步評價。方法 采取經(jīng)典小鼠急性毒性試驗方法，測定小鼠口服皇竹草水煎液和皇竹草粉末的半數(shù)致死量（median lethal dose LD50）及最大耐受量（maximum tolerated dose MTD）。結(jié)果 小鼠口服皇竹草水煎液和皇竹草粉末的LD50未測出；小鼠口服皇竹草水煎液的MTD為972.0g/kg/d、皇竹草粉末的MTD為10.8g/kg/d。結(jié)論 皇竹草急性毒性低，安全范圍廣。

關(guān)鍵詞： 皇竹草；急性毒性試驗；小鼠；最大耐受量

皇竹草，又稱糧竹草、王草、皇竹、巨象草、甘蔗草等，其為多年生禾本科植物[1，2]?；手癫葑?982年從哥倫比亞引入我國，主要是作為畜牧養(yǎng)殖業(yè)的飼草使用，因其種植管理簡單方便，適應(yīng)能力較強(qiáng)，抗病蟲害能力強(qiáng)，且營養(yǎng)價值高，適口性廣，被越來越多的種養(yǎng)殖戶使用?；手癫荽值鞍缀繛?18.9±4.9g/kg，粗纖維含量為172.6±12.6g/kg，粗脂肪含量為38.7±1.4g/kg，是草食性動物的優(yōu)質(zhì)飼草，具有潛在的飲料開發(fā)價值[3，4]?；手癫莞蛋l(fā)達(dá)，分蘗能力強(qiáng)，產(chǎn)量高，亦有很高的生態(tài)、工業(yè)、觀賞等方面價值，堪稱草中之皇?；手癫轄I養(yǎng)豐富，葉質(zhì)柔軟多汁，適口性廣，目前已經(jīng)在牛、馬、羊、兔、豬、雞、鵝、魚、竹鼠等各類食草動物的喂飼中廣泛推廣使用[5-8]。但是，有關(guān)皇竹草的毒性卻鮮見文獻(xiàn)報道，本實驗對皇竹草的急性毒性進(jìn)行相關(guān)研究，為其作為草食動物的飼料源及其飼料的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄各半，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2015-0303。

1.2 儀器

HHW-600恒溫水浴箱（天津泰斯特）；202A-2電熱干燥箱（上海陽光實驗儀器有限公司）。

1.3 藥物

皇竹草于江西紅壤無污染農(nóng)林業(yè)用地種植，由上高利豐牧業(yè)有限公司提供。皇竹草水煎液：取適量干品皇竹草加水10倍，浸泡30分鐘，煮沸30分鐘，濾去渣為I液；然后濾渣同法再加水8倍煮沸20分鐘，為II液，將I、II液混合，減壓濃縮，致小鼠灌胃器可自由抽取不至于灌胃針孔堵塞為度。計算干草重量與濃縮液的比值，得皇竹草可灌胃的最大水煎濃度為10.8g/ml，4℃保鮮備用。

皇竹草粉末：取曬干的皇竹草于60℃烘箱烘烤2小時，趁熱取出置粉碎機(jī)內(nèi)粉碎，過 100 目篩，粉末密封備用。臨用前以50%甘油（目的為增加潤滑性，便于灌胃針抽?。┡涑苫鞈乙?，濃度以小鼠灌胃器可自由抽取不至于灌胃針孔堵塞為度。計算干粉重量與50%甘油的比值，得皇竹草粉末可灌胃的最大混懸濃度為0.12g/ml。

2 實驗方法

2.1 預(yù)實驗[9]

取體重18-22g昆明種小鼠30只，隨機(jī)數(shù)字表法將動物分為對照組、皇竹草水煎液組、粉末組，每組10只，禁食不禁水12h，分別以生理鹽水、皇竹草水煎液、皇竹草粉末甘油混懸液灌胃，單次灌胃最大容積為0.3ml/10g，1天灌胃3次，只灌胃一天，之后連續(xù)觀察7d。記錄期間小鼠死亡數(shù)和動物一般活動情況，若死亡數(shù)≥30%，則測定小鼠口服半數(shù)致死量（median lethal dose LD50），若不足以引起死亡，則測定動物最大耐受量（maximum tolerated dose MTD）。

2.2 半數(shù)致死量（LD50）的測定[9]

按照改良寇氏法，測定口服LD50。取小鼠120只，給水禁食12h，隨機(jī)數(shù)字表法將動物分成12組，皇竹草水煎液、皇竹草粉末由最大濃度等倍稀釋成不同等級濃度灌胃各6組，即皇竹草水煎液：10.8、5.4、2.7、1.35、0.68、0.34g/ml濃度，皇竹草粉末：120、60、30、15、7.5、3.75mg/ml濃度各一組，按0.3ml/10g體重灌胃，一天三次，連續(xù)觀察7天，分別記錄動物毒性反應(yīng)和組內(nèi)死亡情況，及其中毒發(fā)生時間、持續(xù)時間、中毒癥狀、恢復(fù)期等，計算LD50的可信區(qū)間；對死亡動物按規(guī)定進(jìn)行解剖尸檢，記錄病情變化情況，肉眼不能辨別則進(jìn)行病理切片檢查。

2.3 最大耐受量（MTD）的測定[9]

取體重18-22g昆明種小鼠30只，隨機(jī)數(shù)字表法將動物分為對照組、水煎液組、粉末組，每組各10只。禁食不禁水12h后，分別以生理鹽水、皇竹草水煎液、皇竹草粉末甘油混懸液灌胃，單次灌胃最大容積為0.3ml/10g，1天灌胃3次，之后7d 內(nèi)密切觀察并記錄小鼠精神、活動、飲食、大小便等生理情況及動物死亡數(shù)。

若有小鼠死亡，則將死亡小鼠解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸等臟器的改變。觀察期結(jié)束后，將每組存活的小鼠處死進(jìn)行解剖，同樣對上述主要臟器大體病理變化進(jìn)行肉眼觀察。

2.4 皇竹草水煎液對小鼠體重增長的影響

最大耐受量（MTD）測定之后，以1/3MTD的劑量喂養(yǎng)小鼠一周，觀察皇竹草水煎液對小鼠體重增長的影響。取體重18-22g小鼠20只，隨機(jī)數(shù)字表法將動物機(jī)分為對照組、試驗組，每組10只。對照組給予20%的淀粉糊灌胃，試驗組給予皇竹草水煎液（3.6g/ml）灌胃，灌胃容積0.2ml/10g體重，每天2次，連續(xù)一周，實驗期間正常喂養(yǎng)，觀察并記錄一般情況。稱量給藥前后各小鼠的體重，計算每只小鼠一周內(nèi)的體重增加值，比較兩組小鼠平均體重增加百分率。

體重增加百分率=（給藥后體重-給藥前體重）/給藥前體重*100%.

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用excel軟件，T檢驗比較組間差異。

3 實驗結(jié)果

3.1預(yù)實驗與半數(shù)致量（LD50）的測定

小鼠一天多次口服最大灌胃量皇竹草水煎液、粉末，7天內(nèi)均無死亡發(fā)生，故兩組口服LD50均未測出。

3.2最大耐受量（MTD）

測得皇竹草水煎液的MTD為：10.8×3×30=972.0g/kg/d、粉末為：0.12×3×30=10.8g/kg/d。兩組動物給藥0.5--1h后，大多出現(xiàn)自主活動減少、靜臥不動、閉目、反應(yīng)遲鈍，2h后多數(shù)小鼠恢復(fù)正常。另個別小鼠有活躍、興奮的表現(xiàn)，但6h后亦逐步恢復(fù)正?；顒?。24h后全部小鼠活動恢復(fù)正常。整個過程中未觀察到驚厥、抽搐、瞳孔改變、眼球突出等異常情況。體重、食欲、活動、大小便等均未受影響。7天內(nèi)小鼠全部存活，7d后處死動物并解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，外觀未見異常改變。

3.3皇竹草水煎液對小鼠體重增長的影響。實驗期間，兩組小鼠一般狀況良好，未觀察到驚厥、抽搐、大小便改變等任何異常表現(xiàn)。小鼠體重變化情況見表1。

表1 皇竹草水煎液對小鼠體重增長的影響（n=10）

注：與對照組比較 *P<0.05

表1結(jié)果顯示，皇竹草水煎液灌胃一周，與給同體積淀粉液比較，對照組小鼠平均體重增加值及體重增加的百分率雖略高于給藥組，但二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

4 討論

小鼠急性毒性試驗表明，本實驗所使用的皇竹草毒性小安全范圍廣。小鼠口服皇竹草水煎劑的MTD為972g/kg/d，相當(dāng)于一只20g小鼠一天食用19.5g（正常成年小鼠每天攝食量4--6g）。轉(zhuǎn)換成人的劑量，亦相當(dāng)于70kg成人一天攝食皇竹草7.6kg。小鼠皇竹草粉末的MTD為10.8g/kg/d，相當(dāng)于一只20g小鼠一天食用2.2g（約占正常成年小鼠每天攝食量的50%），如果轉(zhuǎn)換成人的劑量，亦相當(dāng)于70kg成人一天攝食皇竹草干粉末0.85kg。由于動物喂飼的是全草，而不是水煎劑，所以皇竹草粉末的MTD更值得參考。如果轉(zhuǎn)換成牛的劑量，亦相當(dāng)于750kg牛一天攝食皇竹草干粉末2.125kg。再有，皇竹草鮮草的含水量80--85%，1kg干草粉末相當(dāng)于7kg的鮮草，相當(dāng)于一頭750kg牛一天可以攝食鮮皇竹草15 kg。由此可見，皇竹草作為作為的飼草使用是較為安全的。通過1周的給藥觀察，小鼠體重均有增加，而未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，結(jié)果亦驗證了皇竹草的安全性，為今后更好地綜合利用皇竹草應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，建議進(jìn)一步開展對其化學(xué)、營養(yǎng)、安全等方面的深化研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙友華，陸云華，陳 武等： 皇竹草綜合開發(fā)利用研究[J].宜春學(xué)院學(xué)報，2015，37（9）：89-91.

[2] 丁翠華.皇竹草特性及綜合開發(fā)利用[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2008，（12）：33-34.

[3] 姜瓊，謝妤，趙友華.宜春引種皇竹草的營養(yǎng)成分和無機(jī)元素的實驗測定與評價[J].宜春學(xué)院學(xué)報， 2014，36（6）：112-114.

[4] Ander so n W F，Dien B S，Brando n S K，et al. Assessment of bermudagrass and bunch grasses as feedstock for conversion to ethanol[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2008，145（1）：13-21.

[5] 于凌云，劉邦輝，王廣軍.投喂皇竹草和生物絮團(tuán)草魚稚魚生長性能對比及營養(yǎng)成分評價[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30（35）：132-138.

[6] 邵智驊，魯進(jìn)學(xué)，江喜春.皇竹草栽培及其飼喂肉羊綜合利用技術(shù)[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2011，17 （7）： 165-166.

[7] 項延潤.皇竹草替代部分精料喂豬的效果試驗[J].浙江畜牧獸醫(yī)，2012，（3）：21-22.

[8] 胡民強(qiáng)，胡敏華.日糧中皇竹草粉含量對馬崗鵝屠宰性能及肉質(zhì)的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，（6）：71-72.

[9] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)（第三版）[M].北京，人民衛(wèi)生出版社，2011：122-124.