水溶性的PEI化殼聚糖的合成

陶鳳

摘 要：殼聚糖是天然聚多糖甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，具有生物兼容性、生物降解性、無(wú)毒性。作為天然陽(yáng)離子聚合物，殼聚糖具有正電性和特殊性能，因而殼聚糖及其衍生物可廣泛用作藥物和基因載體。但是其水溶性不好，單純殼聚糖轉(zhuǎn)染效率也不高，這就大大限制其應(yīng)用范圍。為了提高殼聚糖的溶解性和轉(zhuǎn)染效率，對(duì)殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾極其必要。聚乙二醇能夠有效提高水溶性，當(dāng)其與藥物相連時(shí)能增大分子量，減少腎消除延長(zhǎng)半衰期，增加藥物穩(wěn)定性，并且PEG鏈包裹在藥物表面，能夠遮蔽藥物的抗原，降低藥物的免疫原性。我們通過(guò)合成了O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖衍生物。合成的最終產(chǎn)物，不僅提高殼聚糖的水溶性和穩(wěn)定性，提高轉(zhuǎn)染效率，而且由于引入大量的活性氨基，則便于殼聚糖的進(jìn)一步修飾。反應(yīng)合成的中間體和最終產(chǎn)物都通過(guò)1HNMR和FTIR表征。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；基因載體；改性；聚乙二醇；聚乙烯亞胺

中圖分類號(hào)：O636 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

殼聚糖是天然聚多糖甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，具有生物兼容性、生物降解性、無(wú)毒性。作為天然陽(yáng)離子聚合物，殼聚糖具有正電性和特殊性能，因而殼聚糖及其衍生物可廣泛用作藥物和基因載體。但是其水溶性不好，則大大限制其應(yīng)用范圍。為此本課題通過(guò)對(duì)殼聚糖的修飾，旨在提高其水溶性。與此同時(shí)，殼聚糖作為基因載體，其轉(zhuǎn)染效率也不太理想。為此我們也通過(guò)對(duì)殼聚糖的修飾，提高含氮量來(lái)提高轉(zhuǎn)染效率。所以，通過(guò)修飾得到的殼聚糖衍生物水溶性好，轉(zhuǎn)染效率高，穩(wěn)定性好，免疫原性低，可作為更加理想的基因載體使用。

1 水溶性的PEI化殼聚糖的合成實(shí)驗(yàn)

在水溶性的PEI化殼聚糖的合成實(shí)驗(yàn)中主要使用的是分子量2000的聚乙二醇單甲醚，當(dāng)聚乙二醇與藥物相連時(shí)，能夠增大藥物的分子量，減少腎消除延長(zhǎng)半衰期，增加藥物穩(wěn)定性，并且PEG鏈包裹在藥物表面，能夠遮蔽藥物的抗原，降低藥物的免疫原性。

1.1 實(shí)驗(yàn)合成路線

通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，為合成目標(biāo)產(chǎn)物O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖（mPEG-CS-N-MA-PEI），設(shè)計(jì)了如下的合成路線。首先完成碘代聚乙二醇單甲醚的合成，而后完成N-鄰苯二甲酸酐殼聚糖的合成，再次依次完成O-聚乙二醇單甲醚殼聚糖的合成、O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐殼聚糖的合成、O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖的合成等。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

NMR：Bruker AV400型核磁共振儀，真空泵（SHZ（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵），F(xiàn)T-IR：Perkin-Elmer 2000型紅外光譜儀（KBr壓片），真空干燥箱（DZF-150型），加熱攪拌器（DF-10B集熱恒溫磁力攪拌器），水泵（SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-5299），透析袋（截留分子量為8000-14000，北京索萊寶科技公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

殼聚糖：南京衛(wèi)康生物制品有限公司，脫乙酰度>90%，分子量48KDa；聚乙二醇單甲醚（mPEG）：韓國(guó)Hannong化學(xué)公司，分子量2KDa；聚乙烯亞胺（PEI）：武漢強(qiáng)龍化工有限公司，分子量2KDa；馬來(lái)酸酐：成都市科龍化工試劑廠，含量99.5%；亞磷酸三苯酯：成都市科龍化工試劑廠，含量98.0%；CH3I，DMSO，甲苯，乙醚，成都市科龍化工試劑廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 碘代聚乙二醇單甲醚（mPEGI）的制備

稱取10g MPEG加入50mL三頸燒瓶中，再加入1.3mL亞磷酸三苯酯和0.6mL碘甲烷，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，升溫至120℃，攪拌下反應(yīng)8h后停止。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，抽濾，所得濾液攪拌下倒入冰水中析出淺棕色固體，濾餅用乙醇索氏提取，直到提取液近乎無(wú)色為止。所得產(chǎn)品放置在紅外燈下干燥，碾碎得淺棕色粉末。產(chǎn)率：89%。

1.3.2 N-鄰苯二甲酸酐殼聚糖的制備

稱取5g殼聚糖和13.6g鄰苯二甲酸酐加入200mL單頸瓶中，再加入100mL DMF，升溫至130℃，攪拌條件下反應(yīng)8h。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，抽濾，所得濾液攪拌下倒入冰水中析出淺棕色固體，用乙醇洗滌兩次，所得產(chǎn)品放置在紅外燈下干燥，碾碎得淺棕色粉末。產(chǎn)率：92%。

1.3.3 O-聚乙二醇單甲醚殼聚糖的制備

稱取1.5g鄰苯二甲酸酐保護(hù)的殼聚糖，8g MPEGI和0.8g Ag2O加入到500mL三口瓶中，充入氬氣，再加入90mL DMF，升溫至60℃，攪拌下條件下反應(yīng)16h后，再加入60mL水合肼和100mL蒸餾水，升溫至90℃后接著再反應(yīng)15h。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，過(guò)濾，濾液濃縮，在濾液中加入硫酸鈉分液，取上層黃色油狀粗產(chǎn)物，裝入透析袋中透析4天，減壓濃縮，真空干燥，得淺色固體化合物。

1.3.4 O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐殼聚糖的制備

稱取1.2g制備的O-聚乙二醇單甲醚殼聚糖加入100mL的三口瓶中，加入45mL DMSO充分溶解，然后加入0.9g馬來(lái)酸酐，繼續(xù)攪拌，升溫至60℃，反應(yīng)8h后停止。將裝置改為減壓蒸餾裝置，蒸出大部分的溶劑DMSO，然后加入10mL的蒸餾水，倒入透析袋中透析3天，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干后再減壓抽干得0.7克白色固體。

1.3.5 O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖的制備

稱取0.5g已制備的mPEG-O-CS-N-MA溶于50mL蒸餾水中，然后加入250mL的三口瓶中，稱取4.8g的PEI溶于70mL蒸餾水中，倒入恒壓滴液漏斗中，升溫至60℃，攪拌下將PEI溶液滴入三口瓶中，反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋出大部分水后透析三天，然后旋干，再減壓抽干得0.8g白色固體。

1.4 譜圖及譜圖分析

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以看出，殼聚糖的紅外吸收為：1599cm-1（酰胺II，-NH2伸縮振動(dòng)）和1383cm-1（酰胺III）處為殼聚糖的特征吸收峰。羥基中O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰和N-H的伸縮振動(dòng)吸收峰在3442cm-1處。C-H伸縮振動(dòng)吸收峰為2900cm-1和2873cm-1。1145cm-1為C-O-C彎曲振動(dòng)吸收峰，仲羥基中C-O伸縮振動(dòng)吸收峰為1093cm-1，1021cm-1為伯羥基中C-O伸縮振動(dòng)吸收峰為。

合成后氨基被鄰苯二甲酸酐保護(hù)后，殼聚糖氨基的伸縮振動(dòng)吸收峰1599cm-1消失。同時(shí)，在1712cm-1、1777cm-1處出現(xiàn)鄰苯二甲酰胺上羰基的特征吸收峰。而且，在720cm-1和795cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)的搖擺振動(dòng)特征吸收峰，說(shuō)明氨基已經(jīng)被鄰苯二甲酸酐保護(hù)起來(lái)。

在聚乙二醇化殼聚糖的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酰胺上羰基的特征吸收峰1712cm-1、1777cm-1消失，說(shuō)明在水合肼中的作用下，鄰苯二甲酰基已完全被脫去，氨基被釋放出來(lái)。并且2886cm-1和1114cm-1左右的吸收峰的強(qiáng)度明顯高于殼聚糖，這是由于接枝了mPEG后殼聚糖衍生物中亞甲基和醚鍵大量增加所致。

由紅外譜圖中的數(shù)據(jù)可知，聚乙二醇化殼聚糖接枝馬來(lái)酸酐以后在1720cm-1出現(xiàn)了一吸收峰，這是接入馬來(lái)酸酐后形成特征吸收峰，表明了馬來(lái)酸酐成功接入殼聚糖。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)表明，馬來(lái)酸酐化殼聚糖與PEI發(fā)生邁克爾加成后，1720cm-1處吸收峰消失，說(shuō)明殼聚糖衍生物上的雙鍵與PEI的氨基發(fā)生反應(yīng)。并且接枝PEI后引入了大量的氨基，所以在1600cm-1左右出現(xiàn)了氨基的特征吸收峰。這就表明PEI已經(jīng)成功接枝到殼聚糖上形成預(yù)期的殼聚糖衍生物。

結(jié)語(yǔ)

為改進(jìn)殼聚糖在基因載體方面的應(yīng)用，提高殼聚糖的水溶性、穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率和降低免疫源性，本課題合成了O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖衍生物，。合成的最終產(chǎn)物，不僅提高殼聚糖的水溶性和穩(wěn)定性，提高轉(zhuǎn)染效率，而且由于引入大量的活性氨基，則便于殼聚糖的進(jìn)一步修飾。由紅外譜圖分析可知，6位羥基的mPEG和2位氨基的PEI已經(jīng)接上，得到了預(yù)期的產(chǎn)物。并且由于PEI的引入，引入了大量有反應(yīng)活性的氨基，如果要進(jìn)一步修飾衍生物，比如靶向性的引入半乳糖或者葉酸，則更加容易進(jìn)行。因此PEI的引入，為殼聚糖衍生物的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種殼聚糖衍生物的水溶性很好，水溶性的改進(jìn)達(dá)到了預(yù)期的效果。而由于時(shí)間的限制，此衍生物在轉(zhuǎn)染方面的測(cè)試還沒(méi)來(lái)得及進(jìn)行，還有待繼續(xù)研究。

參考文獻(xiàn)

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