擬南芥CWINV1啟動子GUS表達載體構建及轉基因植株的鑒定

程 姣，黃 弈，任春梅，2*（湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，長沙4028；2作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙4028）

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擬南芥CWINV1啟動子GUS表達載體構建及轉基因植株的鑒定

程 姣1，黃 弈1，任春梅1，2*
（1湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，長沙410128；2作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙410128）

摘 要：CWINV是編碼細胞壁蔗糖轉化酶的基因。為深入探討CWINV基因的表達調控機理，構建了擬南芥CWINV1基因啟動子的GUS融合表達載體并轉入擬南芥，獲得了轉基因植株。GUS染色的結果進一步驗證了重組表達載體的正確性和實用性。

關鍵詞：擬南芥；CWINV1；載體構建；GUS染色

蔗糖轉化酶是一種最常見的酶，存在于酵母、細菌和植物中，在植物中能夠不可逆地催化蔗糖的水解反應，生成葡萄糖和果糖，因此，蔗糖轉化酶在高等植物蔗糖代謝中起著關鍵的作用。轉化酶參與了植物的生長、器官建成、糖分運輸、韌皮部卸載及調節(jié)庫組織糖分構成及水平［1］。根據(jù)其最適pH、亞細胞定位和溶解度等方面的不同，蔗糖轉化酶可進一步細分為細胞壁蔗糖轉化酶、液泡蔗糖轉化酶和細胞質蔗糖轉化酶［2］。細胞壁蔗糖轉化酶基因最先從胡蘿卜中分離得到［3］，隨后在馬鈴薯、擬南芥、番茄和葡萄等植物中也分離到編碼該酶的全長或部分的cDNA序列。細胞壁蔗糖轉化酶基因在質外體中表達最活躍，并通過增加蔗糖的濃度梯度加快蔗糖卸載［4］。

目前，在擬南芥中分離出了4個編碼細胞壁蔗糖轉化酶的相關基因，其中CWINV1基因的表達水平最高［5］，但其確切的生理生化功能和作用機制尚不清楚。本研究通過構建CWINV1基因啟動子的GUS融合表達載體，轉入擬南芥Col - 0野生型中，并通過抗性篩選和GUS染色鑒定，以獲得穩(wěn)定遺傳的轉基因植株，為深入研究CWINV1基因的表達特征提供基礎材料。

1　材料與方法

1.1實驗材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col -0，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，根癌農桿菌（Agro bacterium tumefactions）GV3101，載體pCAMBIA1301，由作物基因工程湖南省重點實驗室植物信號傳導課題組保存。

1.2植物培養(yǎng)條件

將擬南芥種子用消毒液浸泡10 min后，無菌水清洗3次，播種于含1%蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上，避光4℃春化3 d后，轉入光照培養(yǎng)室生長，培養(yǎng)溫度（22±2）℃；光周期為16 h光照/8 h黑暗。待其生長7 d后，移栽到盛有浸透營養(yǎng)液的人工土壤（東北黑土與蛭石的體積比為1∶1）中，移栽后蓋透明塑料薄膜1～2 d，生長條件同上。

1.3pCWINV1：：GUS表達載體的構建

1.3.1引物設計及CWINV1啟動子片段的克隆

根據(jù)TAIR網(wǎng)站上公布的擬南芥CWINV1基因上游啟動子區(qū)域序列，采用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計1對擴增引物PCWIN - F/ PCWIN -R，并在上下游引物的5′端分別加上PstⅠ和NcoⅠ酶切位點，PCR擴增預期目的片段大小約為1800 bp?？寺∫镄蛄袨椋?/p>

PCWIN - F，5′- AACTGCAGACTTTGATGCCCT G -3′（下劃線標記為PstⅠ酶切位點）；

PCWIN - R，5′- CATGCCATGGCTTTGTGGCTT -3′（下劃線標記為NcoⅠ酶切位點）。

根據(jù)合成引物的預測退火溫度，確定引物PCWIN - F/ PCWIN - R的最適退火溫度為58℃。用SDS法［6］提取擬南芥葉片總DNA，以此為模板，用引物PCWIN - F/ PCWIN - R進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段并純化。

1.3.2載體連接及農桿菌的轉化

用PstⅠ和NcoⅠ限制性內切酶對目的片段和pCAMBIA1301載體進行雙酶切，回收目的片段和目的載體。用T4連接酶將CWINV1基因啟動子連接至pCAMBIA1301載體的相應位點。通過熱激法將重組載體轉化至大腸桿菌DH5α，取陽性克隆送上海鉑尚公司測序。提取測序驗證正確的重組質粒通過電擊法轉化到根癌農桿菌GV3101中，進行菌落PCR鑒定和質粒PCR驗證。

1.4擬南芥的轉化與GUS染色

挑選經驗證已轉入重組載體的農桿菌陽性菌落置于含有卡那霉素（50 mg/ L）、慶大霉素（100 mg/ L）、利福平（50 mg/ L）的YEB液體培養(yǎng)基中活化擴大。采用浸花法［7］轉化擬南芥Col - 0野生型。收獲T0代種子播種于含有潮霉素（25 mg/ L）的MS固體培養(yǎng)基上，長日照培養(yǎng)2周后將抗性植株移栽至含有營養(yǎng)液的人工土壤中正常生長。為了檢測目的片段是否已經整合到轉化子的基因組上，設計1對載體檢測引物pC1301 - F/ pC1301 - R，預期片段大小約為2000 bp。檢測引物序列為：

用SDS［6］法提取抗性植株葉片的總DNA，以此為模板，用檢測引物pC1301 - F/ pC1301 - R進行PCR檢測，同時取擬南芥Col - 0野生型做對照，鑒定轉化子。

選取抗性植株的幼苗進一步進行GUS組織化學染色鑒定，同時取相同生長狀況的轉入pCAMBIA1301質粒的擬南芥幼苗以及Col - 0野生型做對照。取新鮮組織，置于GUS染液中完全浸泡，37℃染色過夜，染色后去除GUS染液，用卡諾固定液脫色5～10 h后75%無水乙醇洗滌1～2次，用顯微鏡觀察染色結果并拍照。

2　結果與分析

2.1CWINV1啟動子的GUS表達載體構建

利用PlantCARE對CWINV1基因上游啟動子序列進行分析，其包含了大量核心啟動子元件TATA - box以及在啟動子和增強區(qū)域常見的順式作用元件CAAT - box。此外，該啟動子還包含了與光響應有關的元件Box 4、G - Box、I - Box等以及一些熱誘導和調控植物激素的元件。這表明CWINV1基因啟動子在調控植物生長發(fā)育的過程中有著重要的作用。為了進一步確定擬南芥CWINV1基因啟動子的時空表達模式，利用PCR克隆了CWINV1基因上游啟動子區(qū)域序列，約有1800 bp，用限制性內切酶PstⅠ和NcoⅠ雙酶切CWINV1基因啟動子片段和pCAMBIA1301載體，用T4連接酶將目的片段連接到帶有報告基因GUS的pCAMBIA1301載體上，構建成了pCWINV1：：GUS融合表達載體（圖1）。為了驗證載體的正確性，對pCWINV1：：GUS進行PstⅠ和NcoⅠ雙酶切（圖2）。結果顯示：目的片段與預期結果相符，表明pCWINV1：：GUS表達載體構建成功。

圖1　pCWINV1：：GUS表達載體示意圖Fig.1 Schematic diagram of pCWINV1：：GUS vector

圖2　pAtCWINV1：：GUS表達載體雙酶切檢測結果Fig.2 Identification of pAtCWINV1：：GUS vector by restriction enzyme digestion

2.2擬南芥轉化及轉化子的鑒定

將構建好的pCWINV1：：GUS表達載體通過電擊法轉入根癌農桿菌GV3101，并利用農桿菌介導的浸花法轉入擬南芥Col -0野生型中，獲得4株帶有潮霉素抗性的植株，移至人工土壤正常生長，提取葉片總DNA，用檢測引物pC1301 - F/ pC1301 - R對轉基因植株進行PCR檢測。PCR產物的電泳結果（圖3）顯示，Col - 0野生型沒有出現(xiàn)條帶（1號泳道），而4株抗性植株（2～5號泳道）的PCR產物條帶大小與質粒陽性對照（6號泳道）一致。這表明，轉基因植株基因組序列中導入了目的片段。

圖3　GUS轉化子PCR檢測結果Fig.3 PCR identification of GUS transformed Arabidopsis

2.3轉基因擬南芥的GUS染色檢測

為了進一步驗證重組載體的正確性和實用性，將轉基因擬南芥繼代培養(yǎng)并通過PCR檢測后的T2代播種于含潮霉素（25 mg/ L）的MS固體培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)室生長7 d后對幼苗進行GUS組織化學染色檢測，通過光學顯微鏡觀察染色結果。結果顯示：GUS基因在未轉入重組載體的擬南芥Col -0野生型陰性對照幼苗中沒有表達（圖4A），而在轉入重組載體的Col -0野生型幼苗（圖4B）以及轉入pCAMBIA1301質粒的陽性對照（圖4C）中，GUS基因在幼苗中都有明顯表達，進一步證明了CWINV1基因成功啟動了GUS基因的表達，故pCWINV1：：GUS重組載體成功轉入了擬南芥植株。

圖4　GUS轉化子染色檢測結果Fig.4 Stain identification of GUS transformants

3　結論與討論

本研究成功構建了擬南芥細胞壁蔗糖轉化酶基因CWINV1啟動子的GUS融合表達載體，并通過轉化Col -0野生型的方式獲得了穩(wěn)定遺傳的轉基因植株，為進一步研究CWINV1基因的表達特征提供了可靠的遺傳材料。

本研究中構建的載體，目的是使CWINV1啟動子啟動GUS基因的表達，GUS染色的結果證明了CWINV1基因啟動子已轉入擬南芥中，而其表達調控機理有待于進一步的分析。高等植物細胞壁上的轉化酶是β-呋喃果糖苷酶類的一種，這種細胞壁轉化酶可以與單糖轉運蛋白協(xié)同調控細胞的分裂和生長［8］。現(xiàn)有的研究表明，擬南芥細胞壁轉化酶至少由4個基因編碼，分別是CWINV1、CWINV2、CWINV4、CWINV5，其中CWINV1基因被普遍認為是蔗糖在韌皮部卸載的一個主效基因［9］。由于植株的生長發(fā)育全過程都受控于基因表達，本研究中重組表達載體的成功構建為研究CWINV1基因的表達提供了重要材料，也為深入研究植物細胞壁蔗糖轉化酶的分子機制奠定了研究基礎。

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The GUS Expression Vector Construction of Arabidopsis CWINV1 Promoter and Identification of Transgenic Plants

CHENG Jiao1，HUANG Yi1，REN Chunmei1，2*
（1 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China）

Abstract：CWINV gene encoding the cell wall invertase.CWINV play an important role in plant growth and development，especially blooming，fruit setting，seed formation and other reproductive development period.But its function has not been elucidated in detail.In order to further exploring the mechanism of CWINV gene expression and regulation，the plant expression vectors of CWINV1 gene promoter was constructed with GUS fused report genes，and then transformed into Arabidopsis，transgenic plants were obtained.GUS staining results further verifies the correctness and practicability of the recombinant expression vector.

Keywords：Arabidopsis；CWINV1；vector construction；GUS staining

中圖分類號：Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5280（2016）03-0237-04

DOI：10.16848/ j.cnki.issn.1001-5280.2016.03.01

收稿日期：2015- 12- 08

作者簡介：程 姣（1995 -），女，Email：1196864786@ qq.com；并列第一作者：黃 弈（1990 -），男，碩士研究生，Email：435399406@ qq.com。*通信作者：任春梅，博士，教授，Email：rencm66@163.com。

基金項目：國家自然科學基金項目（30671121）；國家級大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目（（G）SCX1512）。