黃芩苷對(duì)大鼠血清孕酮水平的調(diào)控及其對(duì)腦缺血后神經(jīng)功能的影響

劉錦林 潘彥舒 李海燕 程曉娜 王東輝 牟天龍 劉元

摘要：目的 觀察黃芩苷對(duì)腦缺血雌性大鼠血清孕酮及其相關(guān)激素水平的影響，探討其是否通過調(diào)控孕酮水平發(fā)揮對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用。方法 應(yīng)用陰道涂片方法選取成年動(dòng)情期雌性大鼠，隨機(jī)分為正常組、正常+黃芩苷組和造模組。造模組制作左側(cè)大腦半球永久性大腦中動(dòng)脈栓塞模型，成模后隨機(jī)分為模型組、黃芩苷組、孕酮組和孕酮抑制劑組。正常+黃芩苷組和黃芩苷組腹腔注射黃芩苷溶液，正常組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，孕酮組給予黃體酮注射液肌注，孕酮抑制劑組給予黃芩苷溶液腹腔注射和米非司酮溶液灌胃。分別于造模后不同時(shí)間點(diǎn)抓力測(cè)定儀檢測(cè)各組大鼠前肢抓力，并進(jìn)行神經(jīng)功能行為評(píng)分；ELISA檢測(cè)血清孕酮及其相關(guān)激素的水平。結(jié)果 與正常組比較，造模各組大鼠神經(jīng)功能發(fā)生損傷，各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能行為評(píng)分均極顯著升高（P<0.001），各時(shí)間點(diǎn)前肢抓力均極顯著降低（P<0.001）。治療5 d，黃芩苷組顯示出對(duì)神經(jīng)功能改善的趨勢(shì)（P>0.05），并可顯著提高前肢抓力（P<0.01）；治療10 d，黃芩苷組顯著改善神經(jīng)功能行為評(píng)分（P<0.05），并極顯著提高大鼠前肢抓力大小（P<0.001）；與黃芩苷組比較，孕酮抑制劑組第10日對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)有顯著的抑制作用（P<0.05），第5、10日對(duì)抓力恢復(fù)亦有較顯著的抑制作用（P<0.05）。同時(shí)，與模型組比較，黃芩苷組孕酮水平顯著升高（P<0.05），促卵泡激素和促黃體生成素水平有所下降（P>0.05）。結(jié)論 應(yīng)用米非司酮對(duì)孕酮進(jìn)行阻斷后，黃芩苷的神經(jīng)功能保護(hù)作用顯著受到抑制，提示黃芩苷可能通過上調(diào)血清孕酮水平而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

關(guān)鍵字：黃芩苷；腦缺血；血清孕酮；神經(jīng)功能；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.017

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）07-0065-05

Regulation of Baicalin for Serum Progesterone Level and Its Effects on Neural Functions after Cerebral Ischemia in Rats LIU Jin-lin1， PAN Yan-shu1， LI Hai-yan1， CHENG Xiao-na1， WANG Dong-hui1， MU Tian-long2， LIU Yuan3 （1. College of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2. Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China； 3. 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of baicalin on serum progesterone and related hormones in female normal and cerebral ischemia rats； To explore whether baicalin plays a role in cerebral protection of neurological functions by regulating progesterone levels. Methods With vaginal smear method， the adult estrus female SD rats were selected and divided into normal group， baicalin normal group， and molding groups. The left side of the middle cerebral artery of rats in the molding groups was blocked to establish the permanent middle cerebral artery occlusion （pMCAO）. After modeling， the rats were randomly divided into model group， baicalin treatment group， progesterone treatment group and progesterone inhibitor group. The baicalin normal group and baicalin treatment group were given intraperitoneal injection of baicalin solution； the normal group and model group were given normal saline of the same quantity； progesterone treatment group was given intramuscular injection of progesterone； progesterone inhibitor group was given intraperitoneal injection of baicalin solution and intragastric administration of mifepristone solution.

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2012CB518602）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81202832）

通訊作者：潘彥舒，E-mail：13911209998@163.com

The neurological function deficit scores were evaluated and rat forelimb holding power was detected by Grip Strength Meter respectively at different time points. Serum was taken from the rats and the progesterone and related hormones levels in the serum of every group were measured by ELISA. Results Compared with normal group， neurological functions of rats in molding groups were damaged， and neural functional behavior scores of different time points were the most strongly increased （P<0.001）， and rat forelimb holding power was the most strongly reduced （P<0.001）. 5 days after treating， baicalin showed the trend of improvement of neurological functions （P>0.05） and more significant improvement of the forelimb holding power （P<0.01）； 10 days after modeling， baicalin treatment group significantly increased neural functional behavior scorce （P<0.001） and the most significantly improved the forelimb holding power （P<0.001）. Compared with baicalin treatment group， the progesterone inhibitor group had a significant inhibitory effect on neural functional recovery （P<0.05） 10 days after modeling， and the group also had a significant inhibitory effect on the recovery of holding power （P<0.05） 5 days and 10 days after treating. At the same time， compared with the model group， progesterone level in baicalin treatment group increased significantly （P<0.05）， and FSH and LH decreased （P>0.05）. Conclusion After applying mifepristone to block progesterone， baicalin neurologic protection is significantly inhibited. The results demonstrated that baicalin may play a role in cerebral protection via up-regulating serum progesterone level.

Key words： baicalin； cerebral ischemia； serum progesterone； neurologic function； rats

腦血管疾病是當(dāng)今社會(huì)嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，亦是導(dǎo)致死亡和殘障的主要原因之一，缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，占全部腦卒中的80%左右[1]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)孕酮在腦缺血治療方面的基礎(chǔ)研究較為成熟，并已經(jīng)明確了其對(duì)腦缺血或者腦外傷的神經(jīng)保護(hù)作用[2]。然而，由于孕酮的不良反應(yīng)阻礙了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，因此尋找孕酮的天然替代藥物治療腦缺血損傷具有較好前景。

黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，其主要成分黃芩苷對(duì)腦缺血具有良好的治療效果，在清開靈注射液的相關(guān)研究中也得到證實(shí)[3-4]；同時(shí)有研究表明，黃芩苷可調(diào)節(jié)體內(nèi)孕激素的水平[5]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型，觀察黃芩苷對(duì)血清孕酮（P）、促卵泡激素（FSH）和促黃體生成素（LH）水平以及腦缺血損傷大鼠神經(jīng)功能的影響，初步推測(cè)黃芩苷是否通過調(diào)節(jié)P水平發(fā)揮對(duì)腦缺血的治療作用，為后續(xù)的研發(fā)工作奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雌性健康SPF級(jí)SD大鼠46只，12周齡，體質(zhì)量（220±20）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫24 ℃、濕度50%，明暗交替12 h/12 h，室內(nèi)風(fēng)速控制在0.1～0.2 m/s。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h，保留水供應(yīng)。

1.2 藥物及制備

黃芩苷，成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-15062716，純度98.59%；黃體酮注射液，浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格20 mg，批號(hào)20150124；米非司酮，湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格25 mg，批號(hào)150301。黃芩苷溶液配制：將黃芩苷粉末用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.0）配制成7.5 mg/mL黃芩苷溶液，用2倍生理鹽水稀釋；米非司酮溶液配制：將米非司酮片碾成粉末狀，溶于純芝麻油，配制成1.302 mg/mL米非司酮溶液。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠P、FSH和LH ELISA試劑盒，北京華英技術(shù)研究所，批號(hào)均為20151215；PBS，Solarbio，批號(hào)20150626；美藍(lán)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20141104。4.5 g電子分析天平（AE160 型，瑞士Mettler公司），手術(shù)顯微鏡（SXP-1B，上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠），高頻小電刀（1411型，上海醫(yī)療器械技術(shù)公司），低溫高速離心機(jī)（xiangyi L-550，Sigma公司），光學(xué)顯微鏡（CH型，日本Olympus公司），抓力測(cè)定儀（47200型，Ugo Basile公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)情周期檢測(cè)

2.1.1 性周期判定標(biāo)準(zhǔn) 參照文獻(xiàn)[6]大鼠性周期陰道涂片細(xì)胞變化特點(diǎn)劃分大鼠性周期的各階段：①動(dòng)情前期：持續(xù)時(shí)間17～21 h，涂片可見大量有核上皮細(xì)胞、少量角化上皮細(xì)胞；②動(dòng)情期：持續(xù)時(shí)間9～15 h，涂片可見滿視野角化上皮細(xì)胞、少量有核上皮細(xì)胞；③動(dòng)情后期：持續(xù)時(shí)間10～14 h，涂片可見角化上皮細(xì)胞及白細(xì)胞；④動(dòng)情間期：持續(xù)時(shí)間為60～70 h，涂片可見大量白細(xì)胞及少量黏液。

2.1.2 大鼠陰道涂片方法 參照文獻(xiàn)[7]于每日8：00進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)4～5 d。將消毒細(xì)棉簽用生理鹽水濕潤(rùn)，輕輕插入大鼠陰道內(nèi)，慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)兩下取出，把帶有陰道黏液的棉簽在載玻片上均勻轉(zhuǎn)動(dòng)做成涂片，酒精燈烘干后，用堿性美藍(lán)溶液染色5 min，用蒸餾水沖去多余染液，顯微鏡觀察，并根據(jù)大鼠陰道涂片細(xì)胞變化明確大鼠所處的性周期階段。將動(dòng)情周期規(guī)律的大鼠列為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.2 造模

繼續(xù)觀察列為實(shí)驗(yàn)對(duì)象大鼠的動(dòng)情周期，每只大鼠均在其處于動(dòng)情期時(shí)造模。參照文獻(xiàn)[5]方法制作大鼠左側(cè)大腦半球永久性MCAO模型。10%水合氯醛溶液大鼠腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，頸部正中切口，結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈（ECA）遠(yuǎn)心端，電斷ECA，由ECA殘端剪口插入栓線，阻斷大腦中動(dòng)脈，用縫合線結(jié)扎ECA殘端，剪斷多余栓線，術(shù)區(qū)使用青霉素粉少許，逐層縫合手術(shù)切口。

2.3 分組及給藥

按Bederson等[8]神經(jīng)功能評(píng)分法將造模后的大鼠隨機(jī)分為模型組（6只）、黃芩苷組（10只）、孕酮組（8只）和孕酮抑制劑組（簡(jiǎn)稱抑制劑組，10只），另將處在動(dòng)情期的正常大鼠分為正常組（6只）和正常+黃芩苷組（6只）。黃芩苷組和正常+黃芩苷組大鼠腹腔注射15 mg/kg黃芩苷溶液，正常組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，孕酮組肌肉注射8 mg/kg黃體酮，抑制劑組腹腔注射15 mg/kg黃芩苷溶液并予2.604 mg/kg米非司酮溶液灌胃。各組均于術(shù)后24 h給藥，此后每日同一時(shí)間點(diǎn)給藥。

2.4 檢測(cè)方法及觀察指標(biāo)

2.4.1 神經(jīng)功能行為評(píng)分 參照文獻(xiàn)[8]方法，總分為10分。①提起鼠尾，觀察右前肢表現(xiàn)。1分：內(nèi)收，但不貼身；2分：內(nèi)收，貼于身體；3分：內(nèi)收貼于身體并踡縮；4分：大鼠軀體向右側(cè)旋轉(zhuǎn)。②將動(dòng)物置一金屬網(wǎng)上，向后輕提鼠尾，觀察兩側(cè)前肢肌張力。0分：兩側(cè)前肢緊拉金屬網(wǎng)肌力無明顯差異；1分：右前肢拉金屬網(wǎng)但肌力明顯弱于左側(cè)；2分：右前肢不能拉金屬網(wǎng)。③將動(dòng)物置光滑平面上，觀察側(cè)向推擋阻力。0分：雙側(cè)推擋阻力無明顯差異；1分：右側(cè)推擋阻力明顯弱于左側(cè)；2分：右推大鼠時(shí)其向右側(cè)傾倒。④大鼠左眼上瞼下垂，左眼分泌物增多者評(píng)2分。以上4項(xiàng)評(píng)分相加為最后神經(jīng)功能評(píng)分。

2.4.2 抓力測(cè)定 分別于術(shù)后6 h和1、5、10 d，采用抓力測(cè)定儀檢測(cè)各組大鼠的抓力。大鼠放置光滑平臺(tái)上，前肢抓扶于抓竿上，大鼠在被牽拉尾部向后移動(dòng)時(shí)會(huì)本能地抓住任何物體以阻止后退，直到拉力超過其抓力。大鼠失去抓力后，與其相連接的主儀器自動(dòng)記錄抓力的最大值，重復(fù)測(cè)量3次，記錄大鼠前肢最大抓力。大鼠造模前對(duì)其進(jìn)行第1次抓力測(cè)定，以造模前抓力值為基值，計(jì)算造模后不同時(shí)間點(diǎn)自體抓力變化。抓力變化=造模后抓力值÷造模前抓力值。

2.4.3 大鼠血清孕酮、促黃體生成素和促卵泡激素含量測(cè)定 造模后第10日，按照0.35 mL/100 g體質(zhì)量大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，自腹主動(dòng)脈采血，靜置2 h后，3000 r/min離心15 min，取血清凍存?zhèn)溆谩LISA檢測(cè)血清P、LH和FSH含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，數(shù)據(jù)資料經(jīng)正態(tài)性分布檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后，采用方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)比較組間差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 黃芩苷對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能行為評(píng)分的影響

與正常組比較，造模后大鼠存在神經(jīng)功能缺損，各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；各組術(shù)后1 d大鼠神經(jīng)功能缺損均有所加重，與模型組比較，術(shù)后5 d黃芩苷組大鼠神經(jīng)功能出現(xiàn)恢復(fù)的趨勢(shì)（P>0.05），術(shù)后10 d顯著恢復(fù)（P<0.05）；術(shù)后5 d孕酮組大鼠神經(jīng)功能出現(xiàn)恢復(fù)的趨勢(shì)（P>0.05），術(shù)后10 d顯著恢復(fù)（P<0.05）；黃芩苷組和孕酮組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與黃芩苷組比較，術(shù)后10 d抑制劑組療效受到顯著抑制（P<0.05）。結(jié)果見表1。

組比較，△P<0.05

4.2 黃芩苷對(duì)模型大鼠前肢抓力變化的影響

與正常組比較，造模后大鼠前肢抓力降低，各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；與模型組比較，術(shù)后5 d黃芩苷組大鼠前肢抓力開始顯著恢復(fù)（P<0.01），術(shù)后10 d極顯著恢復(fù)（P<0.001）；術(shù)后5 d孕酮組大鼠前肢抓力開始顯著恢復(fù)（P<0.01），術(shù)后10 d極顯著恢復(fù)（P<0.001）；黃芩苷組與孕酮組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與黃芩苷組比較，術(shù)后5、10 d抑制劑組抓力恢復(fù)均受到較顯著的抑制（P<0.05）。結(jié)果見表2。

比較，△P<0.05

4.3 黃芩苷對(duì)模型大鼠血清孕酮、促黃體生成素和促卵泡激素水平的影響

與正常組比較，正常+黃芩苷組P水平有增加的趨勢(shì)，LH水平有所下降，F(xiàn)SH水平亦略有下降，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，黃芩苷組P水平顯著升高（P<0.05），LH水平有所下降，F(xiàn)SH水平亦略有下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表3。

5 討論

P為脂溶性甾體激素，是在神經(jīng)系統(tǒng)中合成的神經(jīng)活性甾體，除可在外周內(nèi)分泌腺（腎上腺和性腺等）合成，也存在于人腦中?，F(xiàn)已證實(shí)，在急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、創(chuàng)傷性腦外傷、脊髓損傷、腦卒中等大鼠模型中，P可減輕腦水腫、減少炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，P產(chǎn)生的代謝物能減少促凋亡酶和增加抗凋亡酶、加速神經(jīng)髓鞘修復(fù)等[9-11]。盡管P治療腦缺血疾病的療效肯定，而且在基礎(chǔ)研究和Ⅰ期、Ⅱ期臨床研究均比較成熟，然而其不良反應(yīng)也日益顯現(xiàn)，因此進(jìn)入Ⅲ期臨床研究面臨困難，尚未在臨床上展開應(yīng)用。

在很多中藥單體研究中，黃芩主要有效成分之一的黃芩苷藥理作用研究取得了較大進(jìn)展，主要包括抗氧化、抗菌抗病毒、抗炎、抗癌、抗過敏、抗心律失常、降壓和鎮(zhèn)靜作用及對(duì)免疫消化神經(jīng)等系統(tǒng)的保護(hù)作用[12-16]。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，腦缺血第7日黃芩苷組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、前肢抓力及死亡率等改善最為顯著（P<0.01）。同時(shí)考慮到雌性大鼠的動(dòng)情周期為5 d左右，因此選擇在第3個(gè)動(dòng)情期即第10日取材檢測(cè)。本研究結(jié)果顯示，腦缺血10 d時(shí)黃芩苷能顯著改善大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，極顯著恢復(fù)大鼠前肢抓力。

本實(shí)驗(yàn)選用雌性大鼠在動(dòng)情期進(jìn)行造模和取材，是考慮到激素水平在動(dòng)情周期內(nèi)的動(dòng)情期孕激素水平較低，以減小自身激素水平引起的誤差。研究結(jié)果顯示，黃芩苷能增加正常大鼠和腦缺血大鼠血清P水平；對(duì)其負(fù)反饋調(diào)節(jié)的2種相關(guān)激素LH和FSH均略有下調(diào)，尤其是對(duì)LH的影響，這點(diǎn)與生理的反饋調(diào)節(jié)是相對(duì)應(yīng)的。但受實(shí)驗(yàn)大鼠只數(shù)所限，這種差異趨勢(shì)并不顯著。

P在大鼠動(dòng)情周期中有明顯的周期性變化。這一變化與動(dòng)情周期中黃體細(xì)胞的產(chǎn)生和消退密切相關(guān)。LH和FSH均為垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，前者是促進(jìn)卵巢的卵泡發(fā)育和成熟，后者主要是促使排卵，2種激素協(xié)同作用，形成黃體并分泌孕激素。卵巢性激素對(duì)下丘腦促性腺激素釋放激素和垂體促性腺激素（包括LH和FSH）的合成和分泌具有反饋?zhàn)饔?。排卵后，血液中雌激素和孕激素水平明顯升高，兩者聯(lián)合作用，F(xiàn)SH和LH的合成和分泌又受抑制。其中P的分泌與LH的關(guān)系最密切。有研究表明，LH峰的出現(xiàn)可激活卵泡膜中腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶增加，腺苷酸環(huán)化酶引起顆粒細(xì)胞黃體化，使卵泡內(nèi)的P含量增加，從而抑制促進(jìn)LH分泌的雌激素正反饋?zhàn)饔肹17]。

米非司酮為受體水平抗孕激素藥物，具有終止早孕、抗著床、誘導(dǎo)月經(jīng)及促進(jìn)宮頸成熟等作用，與P競(jìng)爭(zhēng)受體而達(dá)到拮抗P的作用。應(yīng)用米非司酮對(duì)P進(jìn)行阻斷后，黃芩苷的神經(jīng)功能保護(hù)作用顯著受到抑制。提示黃芩苷可能是通過上調(diào)血清P水平而發(fā)揮腦保護(hù)作用的。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷對(duì)雌性大鼠局灶性腦缺血具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)血清P水平有關(guān)。黃芩苷已經(jīng)應(yīng)用于臨床其他疾病的治療，鮮有應(yīng)用于腦缺血治療的臨床報(bào)道，本課題的研究意義在于解決P的臨床推廣難題，為尋求P的天然替代藥物奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2016-01-25）

（修回日期：2016-02-14；編輯：華強(qiáng)）