HPLC法測定白屈菜不同器官多種生物堿的質(zhì)量比

鄒　翔，方月妮，曲中原，石　鑫，劉　欣，汪　波，陳　敏

(1. 哈爾濱商業(yè)大學 藥物研究所博士后科研工作站，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學 藥學院，哈爾濱 150076；3. 哈爾濱商業(yè)大學 中藥學博士后科研流動站，哈爾濱 150076)

HPLC法測定白屈菜不同器官多種生物堿的質(zhì)量比

鄒翔1，方月妮1，曲中原2,3，石鑫2，劉欣1，汪波1，陳敏1

(1. 哈爾濱商業(yè)大學 藥物研究所博士后科研工作站，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學 藥學院，哈爾濱 150076；3. 哈爾濱商業(yè)大學 中藥學博士后科研流動站，哈爾濱 150076)

摘要：采用高效液相色譜法分析白屈菜不同器官生物堿的種類及質(zhì)量比.取白屈菜不同器官粉碎，以甲醇∶水溶液(4∶1, V∶V)熱回流提取，提取液蒸干后用50%甲醇溶液溶解，濾過后采用HPLC分析.采用Diamonsil C18色譜柱，流動相為乙腈-0.1%三乙胺水溶液(24∶76，三乙胺溶液用磷酸調(diào)至pH至3)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為290 nm.白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿、黃連堿分離良好，各成分質(zhì)量濃度與峰面積在測定范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系(r>0.999 6)，重現(xiàn)性良好，5種成分的RSD值(n=5)均小于2.0%；平均加樣回收率(n=5)為97.78%～99.63%.白屈菜不同器官所含生物堿的種類有所差異，根、莖及果實中所含生物堿的種類較多，質(zhì)量比較高.明確了白屈菜堿各器官所含主要生物堿種類，為白屈菜的合理開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)；所建立的白屈菜多種生物堿同時測定的HPLC方法穩(wěn)定可靠，簡便易行，可用于白屈菜藥材及其制劑的質(zhì)量評價.

關(guān)鍵詞：白屈菜；不同器官；生物堿；質(zhì)量比測定；高效液相色譜法

白屈菜為罌粟科白屈菜( Chelidonium majus L.) 的干燥全草，別名地黃連、牛金花、土黃連等.主要分布于東北、華北、西北地區(qū)及長江中下游等省區(qū)[1].白屈菜始載于《救荒本草》，在我國、歐洲、德國和匈牙利藥典中均有收載.中藥白屈菜性涼，味苦；有小毒.歸肺，心，腎經(jīng).白屈菜全草功效為解痙止痛，止咳平喘，主治胃脘攣痛，咳嗽氣喘，百日咳[2].白屈菜根具有散瘀、止血、止痛、解蛇毒之功效，主治勞傷瘀血，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)，消化性潰瘍病和蛇咬傷等[3].目前研究表明異喹啉類生物堿是白屈菜的主要活性成分，主要包括原阿片堿、隱品堿、白屈菜堿、血根堿、白屈菜紅堿、黃連堿、小檗堿及四氫黃連堿等[4-5].本文采用反相高效液相法同時測定白屈菜植物根、莖、葉、花、果實中白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿及黃連堿的質(zhì)量比，明確白屈菜各器官中所含生物堿的種類及質(zhì)量比，為全面了解白屈菜的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供詳實的數(shù)據(jù).

1儀器與試藥

1.1儀器

Waters 高效液相色譜系統(tǒng)(600型泵、2996型二極管陣列檢測器、717型自動進樣器和Empower色譜工作站、CBL100型柱溫箱)；FW100 型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省常州市恒久儀器制造有限公司)；PL203 型電子分析天平( 瑞士METTLER TOLEDO 公司) ；KQ5200DB 型數(shù)顯超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；JM-B2002 型電子天平(余姚市紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司).

1.2試藥

白屈菜紅堿、小檗堿、黃連堿、血根堿(天津一方科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)98%)、白屈菜堿(深圳市美荷生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)98%).白屈菜植物(采自黑龍江帽兒山，批號20150420，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學藥學院張德連教授鑒定為罌粟科植物白屈菜( Chelidonium majus L.)，趁新鮮分離各器官，自然晾干).乙腈(賽默飛世爾科技有限公司，色譜純)；三乙胺(天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純)；甲醇(色譜純)；磷酸(天津市天力化學試劑有限公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團).

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液的制備

分別精密稱取白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿、黃連堿對照品適量，以50%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.08、0.03、0.02、0.01、0.1 mg/mL的混合對照品儲備液.

2.1.2供試品溶液的制備

取白屈菜不同器官分別粉碎，過3號篩，各取粉末5 g，置于圓底燒瓶，各精密加入50%甲醇水溶液200 mL，稱定質(zhì)量，熱回流1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，各以50%甲醇水溶液補充減失的重量，搖勻，濾過，各精密量取續(xù)濾液100 mL，蒸干，殘渣用50%甲醇水溶液溶解，分別轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，搖勻，濾過，即得.

2.2色譜條件

Diamonsil C18色譜柱，以乙腈-1%三乙胺溶液(磷酸調(diào)pH值至3.0)(24∶76)為流動相，檢測波長為290 nm，進樣量為10 μL，理論塔板數(shù)以白屈菜紅堿計大于2 000.所測5種生物堿能很好的分離，結(jié)果見圖1.

A-混合對照品　B-果實　C-花　D-葉　E-根　F-莖1-白屈菜紅堿　2-白屈菜堿　3-黃連堿　4-血根堿　5-小檗堿圖1　混合對照品及樣品的HPLC色譜圖

2.3線性關(guān)系考察

分別精密量取白屈菜混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL至5 mL容量瓶中，以50%甲醇溶液定容，制得系列混合對照品溶液.分別精密吸各混合對照品10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖.以色譜峰面積積分值為縱坐標(Y)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)進行回歸，建立線性回歸方程.結(jié)果見表1.

表15種生物堿成分線性關(guān)系考察結(jié)果

生物堿回歸方程r線性范圍/(μg·mL-1)白屈菜堿Y=3×107X-5125.80.99964.00～64.00白屈菜紅堿Y=3×107X+458940.99981.50～24.00黃連堿Y=2×107X-48370.99965.00～80.00血根堿Y=3×107X+138590.99991.00～16.00小檗堿Y=4×107X-2775.20.99980.50～8.00

2.4方法學考察

2.4.1精密度實驗

取白屈菜莖供試品溶液重復(fù)進樣5次，測定峰面積.白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿、黃連堿的峰面積RSD值分別為0.49%、0.74%、0.39%、0.88%、0.91%(n=5)，均小于2%，表明儀器精密度良好.

2.4.2穩(wěn)定性實驗

取白屈菜莖供試品溶液5份，分別于0、2、4、6、8、10 h 進樣，測定峰面積，白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿、黃連堿峰面積在不同時間的RSD分別為0.44%、0.38%、0.79%、0.67%、0.91%均小于2%，供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性好.

2.4.3重復(fù)性實驗

取白屈菜莖粉末5份，按“2.1.2”項下方法制備成白屈菜莖樣品溶液，按“2.2”下色譜條件，測定5種生物堿峰面積并進行計算.結(jié)果莖中白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿、黃連堿質(zhì)量分數(shù)的RSD分別為0.73%、1.32%、0.93%、0.77%、0.66%(n=5).

2.4.4加樣回收實驗

取已知質(zhì)量比白屈菜莖粉末(白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿質(zhì)量比分別為1.33、 0.48、0.28、0.32、4.8 mg/g)5份，每份1 g，每份分別加入白屈菜堿標準品1.0 mg，白屈菜紅堿0.5 mg，血根堿0.5 mg，小檗堿0.5 mg，黃連堿5.0 mg.按“2.2”項下方法測定，計算回收率.白屈菜莖中白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿、黃連堿的平均加樣回收率分別為97.78%、99.63%、98.31%、98.56%、98.71%(n=5)，RSD分別為1.0%、1.6%、0.4%、0.9%、1.0%.

2.5樣品測定與結(jié)果

取白屈菜根、莖、葉、花、果實粉末，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.2”項下方法測定不同器官中5種生物堿的質(zhì)量比.結(jié)果見表2.結(jié)果表明白屈菜根、莖和果實中均含有5種生物堿，其中根中白屈菜堿質(zhì)量比最高，莖中黃連堿質(zhì)量比最高，果實中血根堿質(zhì)量比最高；葉中只含有白屈菜紅堿和黃連堿，而花中只含有白屈菜堿、白屈菜紅堿及黃連堿.

表2白屈菜植物不同器官生物堿質(zhì)量比

生物堿不同器官生物堿質(zhì)量比/(mg·g-1)根莖葉花果實白屈菜堿5.3731.3320.5710.3435.996白屈菜紅堿0.9970.480-6.1091.190血根堿1.4920.272--7.307小檗堿0.8210.319--0.121黃連堿4.3474.8001.42317.4054.100總生物堿13.037.201.9923.8618.71

3討論

白屈菜是一味傳統(tǒng)的中藥，具有消炎鎮(zhèn)痛、止咳利尿、抗癌抑菌以及平喘解毒等多種功效[6].目前《中國藥典》白屈菜的質(zhì)量標準中以白屈菜紅堿的質(zhì)量比為指標進行優(yōu)劣評價[3].異喹啉生物堿是白屈菜的主要活性成分，除白屈菜紅堿還有白屈菜堿、血根堿、黃連堿和小檗堿等生物堿，均具有良好的藥理作用.其中白屈菜堿具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、解痙等作用[7]；血根堿具有抗菌、殺蟲、抗腫瘤，改善肝功能等作用[8]；黃連堿具有抗真菌，保護胃黏膜，保護心肌作用[9]；小檗堿具有抗病原微生物、抗腫瘤作用，此外在心血管系統(tǒng)疾病方面表現(xiàn)出良好的活性，對糖尿病及其并發(fā)癥有明顯改善作用[10-11].所以，本文建立HPLC同時測定這5種生物堿的質(zhì)量比對于完善白屈菜藥材的質(zhì)量評價方法具有一定的意義.

白屈菜是全草入藥，莖、葉、花和果實不同器官中生物堿的種類和質(zhì)量比是否相同，本文進行系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，總生物堿質(zhì)量比花>果實>莖>葉，所以一般在5～7月開花時采收地上部分較為合理.莖中5種生物堿均檢測到，葉中檢測到2種，花中檢測到3種，果實中檢測到5種，推測盛果期采收白屈菜，更利于生物堿的積累.白屈菜根作為中草藥收載于《陜西中草藥》，在臨床應(yīng)用較少.本文研究結(jié)果表明根中總生物堿質(zhì)量比較高，其中白屈菜堿質(zhì)量比僅次于果實中的白屈菜堿.白屈菜根作為植物藥，從綜合提取分離純化活性生物堿的角度考慮具有一定的開發(fā)價值.

參考文獻：

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Determination of contents of various alkaloids in different organs of Chelidonium majus L. by HPLC

ZOU Xiang1, FANG Yue-ni1, QU Zhong-yuan2,3, SHI Xin2, LIU Xin1, WANG Bo1, CHEN Min1

(1. Post Doctoral Research Center of material Medica, Harbin University of Commrce, Harbin 150076,China; 2. School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 3. Post Doctoral Research Center of Material Medica, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Abstract：To analyze the types and contents of alkaloids in different organs of Chelidonium majus L. by HPLC, different organs of Chelidonium majus L. were smashed and extracted by heat reflux extraction method with methanol∶water solution (4∶1, V∶V). The extracting solution was dried by distillation and dissolved by 50% methanol. After filtration, the sample solution was analyzed by HPLC. Diamonsil C18reverse phase column was used as chromatographic analysis column. The mobile phase was considered as acetonitrile-0.1% triethylamine (24∶76, pH value was adjusted to 3 by phosphoric acid). The flow rate was 1 mL/min, column temperature was 35 ℃ and the UV detection wave length was 290 nm. Results showed chelerythrine, sanguinarine, berberine and coptisine were well separated. The mass concentrations and peak areas of different constituents showed a good linear relationship in the range of measurement (r > 0.999 6). The experiment also showed an excellent reproducibility and the RSD (n=5) of 5 alkaloids were all less than 2.0%. The average sample adding recovery rates (n=5) were 97.78%～99.63%. There were some notable differences of the types of alkaloids in different organs of Chelidonium majus L.The types of alkaloids in roots, stems and fruits were more varied, and the contents were also higher. The types of alkaloids in different organs of Chelidonium majus L. were clarified which laid a foundation for the reasonable development and utilization of Chelidonium majus L..The developed HPLC determination method was stable, reliable, simple and convenient, which could be used for the quality evaluation of medicinal materials and preparations of Chelidonium majus L..

Key words：Chelidonium majus L; different organs; alkaloid; HPLC

收稿日期：2016-02-10.

基金項目：黑龍江省普通本科高等學校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃(No. UNPYSCT-2015070)；哈爾濱商業(yè)大學研究生創(chuàng)新項目(YJSCX2015-355HSD)；國家自然科學基金資助項目(81102858)；中國博士后科學基金項目(2013M321060)；黑龍江省博士后科研基金項目(LBH-Z11103).

作者簡介：鄒翔(1978-)，男，博士，副研究員，研究方向：抗腫瘤天然藥物研究. 通訊作者：曲中原(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：抗腫瘤天然藥物研究.

中圖分類號：R284

文獻標識碼：A

文章編號：1672-0946(2016)03-0257-04