羊傳染性膿皰皮炎弱毒苗耐熱保護劑初步優(yōu)化篩選試驗研究

馮玲霞，張述斌，蒙琦，張海明

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平涼744000；2.甘肅省華亭縣動物疫病預防控制中心，744100）

羊傳染性膿皰皮炎弱毒苗耐熱保護劑初步優(yōu)化篩選試驗研究

馮玲霞1，張述斌1，蒙琦1，張海明2

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平涼744000；2.甘肅省華亭縣動物疫病預防控制中心，744100）

試驗以羊傳染性膿皰皮炎弱毒活疫苗為對象,依據凍干保護劑的保護功能，對耐熱保護劑的組成、混合比例進行了初步篩選。通過反復試驗，對其物理性狀觀察、水分含量測定、凍干前后病毒損失量、經37℃處理、25℃保存后病毒損失量等指標的比較進行篩選，優(yōu)選出了符合要求的A3、A6、C4三個耐熱保護劑配方。試驗結果表明，使用保護劑的羊口瘡疫苗在37℃保存20 d，病毒含量下降0.5～0.7個滴度，常規(guī)疫苗下降2.3個滴度；25℃保存60d，病毒含量下降0.3～0.6個滴度，常規(guī)疫苗下降2.5個滴度。從而證明了羊orf耐熱活疫苗耐熱效果優(yōu)于常規(guī)疫苗。

羊傳染性膿皰皮炎；弱毒苗；耐熱保護劑；篩選試驗

羊傳染性膿皰皮炎（orf）,俗稱羊口瘡，是危害綿、山羊的一種急性、接觸性的高度傳染病，其中以羔羊最易患本病，一旦發(fā)生，傳染非常迅速，隔離治療法往往收不到理想效果，故最好施行疫苗接種，但傳統(tǒng)的活疫苗熱穩(wěn)定性和保護功能差，對冷鏈的要求高，2～8℃條件下，保存期只有3～6個月，大多需在-15℃以下保存，這給疫苗的儲存和運輸帶來很大困難，容易因免疫失敗而造成疫病的流行。為了加快新型有效的耐熱保護劑的研究和應用，本研究以羊傳染性膿皰皮炎弱毒活疫苗為對象，根據凍干保護劑的種類和作用機制，主要篩選了聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、乳糖、蔗糖、多聚蛋白胨、谷氨酸鈉、維生素C等物質作為保護劑的主要成分。采用單因子試驗對耐熱保護劑的組成和配方比例進行篩選，并將其應用于羊傳染性膿皰皮炎弱毒活疫苗的試制生產中，經反復試驗，證明其對羊orf病毒具有良好的耐熱保護功能。這對提高羊orf疫苗的質量，控制羊orf病的發(fā)生與流行具有重大意義。

1 試驗材料

1.1 試驗用毒株

生產疫苗的HCE種毒 （即82代羊orf弱毒株）由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所鑒定、保管和供應。

1.2 試驗用細胞

犢牛睪丸細胞由“羊傳染性膿皰皮炎(orf)耐熱性活疫苗的研究”項目組制備。

1.3 試驗儀器

CO2培養(yǎng)箱、AD—1型單細胞旋轉培養(yǎng)機、真空冷凍干燥機、Mettler Toledo DL31水分測定儀、真空測定器、高壓蒸汽滅菌器、精密電子天平、生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺、普通離心機、磁力攪拌器、移液器、干燥箱等。

1.4 實驗藥品及試劑

1.4.1 病毒凍干保護劑：蔗糖、乳糖、脫脂奶粉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸鈉、多聚蛋白胨、維生素C。

1.4.2 其它化學試劑：199培養(yǎng)基、水解乳蛋白、胰蛋白酶等。

2 試驗方法

2.1 抗原液的制備

取82代羊orf弱毒株（生產用種毒），經生長良好的犢牛睪丸細胞傳代培養(yǎng)至85代后，測定其毒價，7～9d內該種毒TCID50≥106/0.1mL以上；其它按《中華人民共和國獸用生物制品制造及檢驗規(guī)程》方法進行檢測合格后，在-15℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 耐熱保護劑的配制

根據凍干活疫苗的質量要求和各類型原材料的作用機理，將聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、乳糖、蔗糖、多聚蛋白胨、谷氨酸鈉、維生素C、磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉等幾類物質按照不同的物質和不同的量組合成An、Bn、Cn多個配方進行耐熱保護劑的初步篩選。

將保護劑按組份、比例混合，分別進行除菌處理：(1）對可高壓滅菌的聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、多聚蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉，按各自比例溶于蒸餾水中，116℃滅菌 30～40min；（2）將不耐高溫的物質組份山梨醇、谷氨酸鈉、維生素C，均按各自比例溶于蒸餾水中，用孔徑0.22μm濾膜過濾除菌；（3）犢牛血清，用孔徑0.22μm 濾膜過濾除菌。 再將（1）、（2）、（3）三種成分按比例混合，即為凍干耐熱保護劑。使用時按1∶2比例加入病毒抗原液中，分裝后進行冷凍干燥。

2.3 耐熱凍干保護劑的初步篩選試驗

取orf弱毒株病毒液與不同組方的保護劑，按2:1比例混合，定量分裝，以傳統(tǒng)的保護劑配方作對照，在同一凍干箱用同一凍干曲線進行分批凍干。通過其物理性狀、水分含量、凍干前后病毒損失、經37℃處理15d、30d后病毒損失等指標的比較進行初步篩選。篩選的標準是凍干前后病毒損失小、具有一定的耐熱性，且物理性狀、水份含量合格。

2.4 耐熱凍干保護劑的優(yōu)化篩選

在初步篩選的基礎上，將測定結果均達到試驗設計要求的配方及配比組成（A3、A6、A8；B2、B3、B6；C1、C4、C7），在同一個凍干箱用同一凍干曲線再次進行凍干，并用常規(guī)保護劑疫苗作對照，取凍干樣品進行檢測。通過凍干前后病毒的損失量、37℃處理10d、20d及25℃放置 30d和60d后病毒損失量的比較進行二次篩選。

2.4.1 耐熱凍干保護劑疫苗凍干效果檢驗:按現行《中華人民共和國獸用生物制品制造及檢驗規(guī)程》方法檢測其物理性狀、真空度和剩余水份，評價耐熱凍干保護劑疫苗凍干效果。

2.4.2 熱穩(wěn)定性試驗：凍干后取樣分別經37℃處理10d、20d，25℃放置 30d和60d，并與傳統(tǒng)的活疫苗進行比較，用微量法對樣品進行ECID50測定。以其病毒滴度無明顯下降，損失量較小，不影響使用效果為標準進行優(yōu)選。

3 試驗結果

3.1 耐熱保護劑初步篩選結果

依據冷凍干燥效果觀察、凍干前后病毒損失量、37℃處理15d、30d后病毒損失量等指標的比較，對試驗結果進行對比分析（略），最終獲得比較理想的耐熱保護劑組方分別為A3、A6、A8；B2、B3、B6；C1、C4、C7。

3.2 耐熱凍干保護劑的優(yōu)化篩選試驗結果

3.2.1 物理性狀、剩余水分測定結果:產品凍干后，對其物理性狀進行觀察，樣品分別為乳白色、微黃色海綿狀疏松團塊，表面有微小孔隙，搖晃后可與瓶壁脫落，加稀釋液后可迅速溶解；并對其真空度和剩余水分進行了測定，結果見下表。

表：物理性狀、剩余水份及真空度測定結果

3.2.2 凍干前后：37℃處理 10d、20d；25 ℃放置30d、60d后病毒損失量測定結果分別見圖1、圖2。

圖1 耐熱保護劑凍干苗經37℃處理后病毒損失量比較

圖2 耐熱保護劑凍干苗經25℃處理后病毒損失量比較

結果表明，凍干前后各個組病毒損失量較小，無明顯差異；37℃處理10 d、20 d后，A3、A6和C4配方組的ECID50下降不超過0.7個滴度。25℃放置 30d、60d 后，A3、A6 和 C4 配方組的ECID50下降幅度較小且不超過0.6個滴度，其他組別下降幅度較大，普通疫苗組分別下降2.2和2.5個滴度。通過上述試驗，最終獲得比較理想的耐熱保護劑，分別為A3、A6和C4。

4 小結與討論

在篩選耐熱保護劑配方時，大分子和小分子物質配合使用十分重要。大分子物質構成凍干制品多孔構架，小分子物質主要作用是防止蛋白質變性，防止干燥狀態(tài)下微生物的氧化，大分子物質與小分子物質配合使用，能有效地增強小分子的保護作用。試驗結果表明，耐熱保護劑疫苗凍型、色澤、質地良好，水分含量低，真空度合格，凍干前后病毒損失少，說明我們所選擇的保護劑配方搭配合理，具有更好的保護作用。

通過耐熱性試驗，常規(guī)保護劑疫苗病毒損失迅速發(fā)生，說明常規(guī)疫苗用蔗糖脫脂奶保護劑在高溫條件下的耐熱性能差。A3、A6、C4保護劑疫苗在37℃耐老化試驗和常溫保存中病毒損失量小，說明我們篩選出的耐熱保護劑在疫苗的生產和保存過程中均表現出了穩(wěn)定的耐熱性能，且具有良好的耐熱效果。

[1]王文成.獸用生物制品耐熱凍干保護劑的研究進展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2002,18(12):7-10,15.

[2]殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997:329-331.

[3]王玉琳,曾鳴,王玲,等.病毒活疫苗凍干保護劑篩選研究[J].微生物學免疫學進展,1996,24(1):22-26.

[4]汪宏才，楊峻，楊濤，等.豬瘟活疫苗耐熱保護劑研究[J].湖北農業(yè)科學，2009，48（11）：2795-2796.

[5]中華人民共和國獸用生物制品制造及檢驗規(guī)程[S].中華人民共和國農業(yè)部，2000：32-34.

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1003-8655（2016）05-0018-03