貓須草不同部位主要營養(yǎng)成分及抗氧化能力比較

薛惠琴，蔡 旋，熊慧慧，杭怡瓊，肖長(zhǎng)峰，盧永紅

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

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貓須草不同部位主要營養(yǎng)成分及抗氧化能力比較

薛惠琴，蔡 旋，熊慧慧，杭怡瓊，肖長(zhǎng)峰，盧永紅*

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

摘 要：為比較貓須草不同部位的營養(yǎng)成分及抗氧化能力，采用常規(guī)方法測(cè)定貓須草根、莖、葉的基本營養(yǎng)成分及抗氧化成分含量，用比色法測(cè)定貓須草根、莖、葉50%乙醇浸提液體外抗氧化能力，用熒光探針法檢測(cè)IPEC-J2細(xì)胞胞內(nèi)NO自由基含量。結(jié)果表明：貓須草根、莖、葉基本營養(yǎng)成分及抗氧化成分含量差異較大；貓須草根、莖、葉50%乙醇浸提得率分別為9.52%、16.64%和16.70%，浸提液均具有良好的體外鐵離子還原能力、超氧陰離子自由基及羥基自由基清除能力；對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞NO自由基升高有緩解作用。貓須草葉體外抗氧化能力及清除胞內(nèi)NO自由基能力優(yōu)于根及莖。結(jié)果提示：根據(jù)貓須草各器官特點(diǎn)，針對(duì)性綜合利用貓須草資源十分必要。

關(guān)鍵詞：貓須草；營養(yǎng)成分；氧化應(yīng)激；自由基

貓須草，又被稱作“腎茶”，廣泛種植于南亞、澳大利亞［1］及中國南部地區(qū)［2］。貓須草在南亞作為一種傳統(tǒng)的茶飲而深受人們喜愛，但在中國，貓須草則更多是作為一種中草藥用于治療腎臟疾病、炎癥、痛風(fēng)以及糖尿病［3］，其中以治療腎病的報(bào)道尤為多見。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，貓須草具有很好的抗氧化效果［4］，而許多藥用植物的藥理作用都與其具有抗氧化效果相關(guān)［5］。

貓須草為多年生草本植物。葉片重量在整個(gè)植株中所占比例較小，且采摘不易，市場(chǎng)上所售的貓須草成品多為葉、莖混合品，而根部在加工切短環(huán)節(jié)即被拋棄。事實(shí)上，莖、葉混合品既不利于消費(fèi)者泡飲和提高貓須草成茶品相，也無助于貓須草中有效成分的浸出。我國使用中草藥飼料添加劑的歷史由來已久。長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐表明，一些中草藥飼料添加劑能提高畜禽的生產(chǎn)性能，并起到免疫防病和改良品質(zhì)的作用［6］。貓須草低廉的價(jià)格、良好的抗氧化性能和被廣泛證實(shí)的安全性正是其作為良好的中草藥飼料添加劑的基本保障。MALAHUBLAN等［7］將貓須草提取物在肉雞飼料中添加，發(fā)現(xiàn)貓須草提取物添加能夠增加肉雞的日增重，并改善肉品品質(zhì)。飼料添加劑對(duì)口感、品相的要求也較保健品低很多，貓須草保健茶飲加工后的副產(chǎn)物完全可以滿足需求。因此，提升貓須草保健茶飲品質(zhì)，并將其生產(chǎn)副產(chǎn)物作為動(dòng)物飼料添加劑使用，將是一件既充分利用資源，又能獲得良好經(jīng)濟(jì)效益的舉措。

但是，目前尚未見到分別研究貓須草各個(gè)器官的報(bào)道，這對(duì)于貓須草的深加工和飼料資源利用均是不利的。對(duì)貓須草根、莖、葉的基本營養(yǎng)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，比較各部分的活性，對(duì)于深入了解貓須草的性質(zhì)，及貓須草各個(gè)部分的加工具有重要意義。本研究通過比較分析貓須草不同部位的主要營養(yǎng)成分、抗氧化成分及其水醇提取物的抗氧化能力，并分析其對(duì)氧化損傷的動(dòng)物腸道細(xì)胞的修復(fù)作用，初步探討貓須草加工副產(chǎn)物作為動(dòng)物飼料添加劑的前景，為開發(fā)貓須草副產(chǎn)物動(dòng)物飼料添加劑提供支持。

1　材料與方法

1.1貓須草樣品及預(yù)處理

貓須草樣品購自廣西玉林中草藥市場(chǎng)，為2015年新采植株。整株貓須草經(jīng)自然曬干后，輕拍去除泥土，手工分離葉片、莖稈和根部，采用多功能高速粉碎機(jī)粉碎，過0.5 mm（32目）篩網(wǎng)，干燥器中保存待用。

1.2主要試劑

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物有限公司；過氧化氫、2-脫氧-D-核糖、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、還原型輔酶Ⅰ（NADH）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）購自Sigma公司；2-硫代巴比妥酸（TBA）購自阿拉丁試劑有限公司；DAF-FM DA購自碧云天生物研究所有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自GE公司；胎牛血清購自Thermo公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥化學(xué)有限公司。

1.3細(xì)胞及培養(yǎng)方法

IPEC-J2細(xì)胞取自新生仔豬腸道上皮，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)魏占勇教授饋贈(zèng)。IPEC-J2細(xì)胞采用以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)較密集時(shí)，胰酶消化傳代。

1.4主要營養(yǎng)成分的測(cè)定

采用1.1處理的風(fēng)干樣進(jìn)行主要營養(yǎng)成分的測(cè)定。水分采用直接干燥法測(cè)定；粗灰分采用灼燒法測(cè)定；粗纖維采用酸堿消煮法測(cè)定；粗脂肪采用索氏抽提法測(cè)定；粗蛋白采用凱氏定氮法測(cè)定。無氮浸出物經(jīng)計(jì)算得出：無氮浸出物%=100%-（水分%+粗脂肪%+粗纖維%+粗蛋白質(zhì)%+粗灰分%）。

1.5抗氧化成分的測(cè)定

酚類物質(zhì)通常被認(rèn)為是植物中主要抗氧化成分。

貓須草根、莖、葉樣品按1∶20的固液比，加入50%乙醇，55℃超聲波浸提30 min，中速定量濾紙抽濾，濾渣同樣方法再次浸提，共提取3次。合并3次的濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥。提取物刮取后稱重計(jì)算得率，貓須草根、莖、葉提取率分別為9.52%、16.64%和16.70%。采用50%乙醇復(fù)溶以進(jìn)行總黃酮和總多酚的測(cè)定。

貓須草根、莖、葉中總黃酮含量的測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定［8］，總酚含量采用福林酚法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定［9］。

1.6體外抗氧化能力測(cè)定

1.6.1還原能力 貓須草對(duì)鐵離子的還原能力采用蔡旋等［10］的方法測(cè)定。還原力測(cè)定以普魯士藍(lán)Fe4（Fe（CN）6）的生成量作為指標(biāo)，抗氧化劑將鐵氰化鉀還原，然后利用亞鐵離子生成普魯士藍(lán)，在700 nm處此物質(zhì)具有最大吸收峰。吸光值越大，說明樣品還原力越強(qiáng)。采用傳統(tǒng)比色法測(cè)定。20 μg/mL VC被作為對(duì)照。

1.6.2超氧陰離子自由基清除能力 貓須草對(duì)超氧陰離子的清除能力采用蔡旋等［10］的方法，超氧離子自由基在PMS-NADH系統(tǒng)中收集并通過NBT還原法檢測(cè)。20 μg/mL VC被作為對(duì)照。超氧離子自由基清除率由以下公式表示：

式中A對(duì)照表示溶劑對(duì)照的吸光度；AOS表示不同濃度貓須草添加的吸光度，A空白為溶劑對(duì)照且不加NBT組。

1.6.3羥基自由基清除能力 貓須草對(duì)羥基自由基的清除能力采用蔡旋等［10］的方法，將脫氧核糖作為·OH攻擊靶，利用Fe3+-EDTA-抗壞血酸-過氧化氫體系產(chǎn)生·OH，脫氧核糖在受到·OH攻擊后會(huì)裂解，同TBA產(chǎn)生反應(yīng)生成紅色化合物。羥基自由基清除率由以下公式表示：

式中A對(duì)照表示溶劑對(duì)照的吸光度；AOS表示不同濃度貓須草添加的吸光度，A空白為溶劑對(duì)照且不加脫氧核糖組。

1.7胞內(nèi)氮自由基清除能力

經(jīng)方法1.5制得的提取物采用PBS溶解并濾菌待用。參照CAI等［11］的方法，IPEC-2細(xì)胞以2× 104/孔的密度種植于96孔黑色細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h使之貼壁，加入不同濃度的貓須草提取物。共同孵育12 h后，試驗(yàn)孔加入1 mmol/L過氧化氫，作用1 h，吸去培養(yǎng)基，37℃預(yù)溫PBS洗2次，加入20 μL稀釋好的DAF-FM DA探針，20 min后洗去，并立即采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。以PBS代替提取物僅加入過氧化氫處理（H組）為陰性對(duì)照組，以PBS代替過氧化氫和提取物加入處理（C組）為空白對(duì)照組。結(jié)果以一氧化氮自由基清除百分率表示：

1.8數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。通過SPSS 22.0軟件，利用Duncan法進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)志。曲線擬合采用Origin 8.0軟件進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1貓須草根、莖、葉主要營養(yǎng)成分如表1所示，貓須草根和莖的營養(yǎng)成分相對(duì)接近，與葉的相差較大。根、莖中粗纖維含量極高，但粗蛋白、粗脂肪等含量相對(duì)較低，貓須草葉片中粗纖維含量不高，但粗蛋白含量達(dá)19.53%。三者粗灰分的含量亦有差異，以莖中含量最低（4.93%），葉中含量最高（9.07%）。提示在貓須草的使用及加工時(shí)需要根據(jù)其物理及營養(yǎng)成分來確定其適合的方案。

表1　貓須草（風(fēng)干）主要營養(yǎng)成分含量Table 1 Contents of main nutrient components of Orthosiphon stamineus（dry）　%

2.2貓須草根、莖、葉中多酚及黃酮含量

多酚及黃酮被認(rèn)為是植物中主要的抗氧化成分。貓須草根、莖、葉中多酚（以沒食子酸含量計(jì)）及總黃酮（以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品）含量見表2。由表2可知，貓須草葉中多酚及黃酮含量均為最高，而莖中多酚及黃酮含量最低，根、莖、葉中多酚及總黃酮含量均存在顯著差異（P＜0.05）。

表2　貓須草中抗氧化成分含量Table 2 Content of antioxidant components in Orthosiphon stamineus　mg·g-1干物質(zhì)

2.3貓須草不同部位體外抗氧化能力的比較

貓須草根、莖、葉都有一定的鐵離子還原能力，其中葉的鐵離子還原能力較強(qiáng)，而莖和根的還原能力十分接近（圖1）。貓須草根、莖、葉對(duì)超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除能力（圖2），其中葉的清除效果最佳，根、莖、葉對(duì)超氧陰離子自由基清除的半數(shù)有效劑量（EC50）分別為2 032.03 mg/kg、2 934.98 mg/kg、2 103.41 mg/kg；對(duì)于羥基自由基的清除能力，在低濃度（＜150 μg/mL）同樣是葉的清除效果最佳，但在高濃度（＞200 μg/mL）下莖提取物的羥基自由基的清除能力較優(yōu)，根提取物的羥基自由基的清除能力最低（圖3）。綜合還原能力、超氧陰離子自由基清除能力、羥基自由基的清除能力的結(jié)果可知，貓須草葉的體外抗氧化能力最佳，而根次之，莖最弱。因?yàn)楸窘Y(jié)果是已經(jīng)換算成貓須草風(fēng)干樣后進(jìn)行比較的，而葉、莖提取率較高，根的提取率遠(yuǎn)低于葉和莖，所以在提取物中的體外抗氧化能力以貓須草根提取物為最高，葉次之，而莖的抗氧化能力最弱。

圖1　貓須草根、莖、葉的還原能力Fig.1 Reducting Power of roots，stems and leaves of Orthosiphon stamineus

圖2　貓須草根、莖、葉的超氧陰離子自由基清除能力Fig.2 Scavenging Oon the roots，stems and leaves of Orthosiphon stamineus

2.4貓須草提取物對(duì)腸道上皮細(xì)胞胞內(nèi)氮自由基的清除作用

一氧化氮自由基既是一種重要的氮自由基，又是一種信號(hào)分子，NO自由基含量的增多往往關(guān)系到炎癥的產(chǎn)生。如圖4所示，300 mg/kg的貓須草根、莖、葉中所含成分對(duì)1 mmol/L過氧化氫誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞中NO自由基均有一定清除作用。貓須草葉提取物的胞內(nèi)NO自由基顯著高于根和莖提取物。

圖3　貓須草根、莖、葉的羥基自由基清除能力Fig.3 Radical scavenging of OH on the roots，stems and leaves of Orthosiphon stamineus

圖4　貓須草根、莖、葉的對(duì)IPEC-J2細(xì)胞胞內(nèi)NO自由基的清除能力Fig.4 Radical scavenging of NO by IPEC-J2 cell on the roots，stems and leaves of Orthosiphon stamineus

3　討論與結(jié)論

本試驗(yàn)研究表明，貓須草根、莖、葉的基本營養(yǎng)成分和抗氧化成分含量相差較大，葉片中蛋白含量豐富，總酚含量、總黃酮含量均較高，且葉片質(zhì)地柔軟，纖維素含量低，所含成分易溶出。以熱水浸泡葉片時(shí)觀察到茶湯呈淡黃色，有特殊香味，茶湯微苦，偏酸，但回味甘甜，適合作為日常的茶飲。本研究發(fā)現(xiàn)貓須草葉的體外鐵離子還原能力、超氧陰離子自由基清除能力及羥基自由基清除能力均高于莖和根，可能與葉片中酚含量較高有關(guān)。同時(shí)胞內(nèi)NO自由基清除能力也顯著高于莖和根提取物。動(dòng)物腸道上皮處于一個(gè)包含食糜、腸道微生物和各種消化液的高度復(fù)雜的微環(huán)境中，極易受到氧化應(yīng)激和炎癥影響［12］。上皮細(xì)胞IPEC-J2細(xì)胞是一種典型的非腫瘤化的傳代上皮細(xì)胞，適合作為腸道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型研究［13］。本研究也表明，貓須草提取物具有保護(hù)腸道上皮的作用。

貓須草莖稈部分在日常售賣的貓須草成品中所占比例極大，本研究在廣西玉林中草藥市場(chǎng)上隨機(jī)購買了三份貓須草，通過手工分揀葉片后發(fā)現(xiàn)，其莖稈重量均占總重量的90%以上。但目前少有專門針對(duì)貓須草莖的研究，本研究表明，貓須草莖稈的粗纖維含量高達(dá)43.20%，為葉片含量的3倍以上，但蛋白含量?jī)H為葉片的1/2。體外抗氧化能力分析表明，貓須草莖有一定的自由基清除能力，但清除率較葉和根的略低。同樣以熱水浸泡貓須草莖稈，發(fā)現(xiàn)茶湯色澤較淡，溶出較少，提示貓須草莖稈更適合提取加工使用。

我國使用貓須草作為藥物的歷史悠久［14］，但多以莖、葉入藥［15］，東南亞各國，尤其馬來西亞、菲律賓等國喜以貓須草葉為日常茶飲［2］，未見貓須草根的研究報(bào)道。貓須草的根多在加工中被拋棄，市場(chǎng)上難以購買到，因此易被研究者所忽略。本研究發(fā)現(xiàn)，貓須草根中抗氧化成分含量較高，遠(yuǎn)高于莖中多酚及黃酮的含量，剔除提取率影響，則貓須草根提取物的體外抗氧化能力（鐵離子還原能力、超氧陰離子自由基清除能力、羥基自由基清除能力）高于貓須草葉的體外抗氧化能力，對(duì)IPEC-J2細(xì)胞胞內(nèi)自由基的清除能力也高于貓須草莖提取物。但本研究中，貓須草根采用50%乙醇提取的得率僅為9.52%，遠(yuǎn)低于莖（16.64%）和葉（16.70%）的提取率，這可能與貓須草根部木質(zhì)化程度高，粗纖維含量較高（表1）有關(guān)。貓須草根經(jīng)熱水浸泡后色澤較等量莖浸泡后所得茶湯色澤更淡，基本無香味，且貓須草根部泥土難以除凈，因此并不適合泡飲。該研究提示貓須草根是一種值得開發(fā)的資源，但提取方式應(yīng)重新進(jìn)行摸索，以提高提取率。

目前人類衰老、疾病及許多動(dòng)物生產(chǎn)問題均已被證實(shí)與自由基代謝失衡相關(guān)，腸道氧化應(yīng)激與炎癥問題也是困擾動(dòng)物生產(chǎn)的一大障礙，本研究已證實(shí)貓須草根、莖、葉提取物均具有自由基清除能力及腸道上皮細(xì)胞保護(hù)作用。但由于根、莖、葉的物理性質(zhì)和營養(yǎng)成分的差異，不加區(qū)分的統(tǒng)一進(jìn)行加工可能會(huì)不利于貓須草有效成分的充分利用和資源的合理配置。本研究提示，分離貓須草葉片作為日常茶飲，將莖稈、根部用作保健食品或飼料添加劑加工原料，并對(duì)莖稈、根分別采取針對(duì)性的提取工藝是一種更高效、合理的資源利用方式。

本試驗(yàn)表明，貓須草根、莖、葉基本營養(yǎng)成分及抗氧化成分含量差異較大，葉中粗蛋白、多酚及黃酮含量最高，而根和莖中纖維素含量較高。貓須草根、莖、葉50%乙醇浸提得率分別為9.52%，16.64%和16.70%，浸提液均具有良好的體外鐵離子還原能力，超氧陰離子自由基及羥基自由基清除能力，對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞NO自由基升高有緩解作用，貓須草葉體外抗氧化能力及清除胞內(nèi)NO自由基能力優(yōu)于根及莖。根據(jù)貓須草各器官特點(diǎn)，針對(duì)性綜合利用貓須草資源十分必要。

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（責(zé)任編輯：張睿）

Main nutrients and antioxidant capacity of Orthosiphon stamineus in different parts

XUE Hui-qin，CAI Xuan，XIONG Hui-hui，HANG Yi-qiong，XIAO Chang-feng，LU Yong-hong*
（Institute of Animal Husbandry & Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：In order to compare the nutritional components and antioxidant capacity of Orthosiphon stamineus in different parts.Basic nutritional components and antioxidant content in root，stem and leaf of Orthosiphon stamineus were determined by using conventional ways.Antioxidant capacity of Orthosiphon stamineus’s root，stem and leaf dissolved with 50%ethanol were extracted and determined by colorimetry.Nitric oxide free radical in IPEC-J2 cells content were determined by Steady-State Fluorescence.The results showed that the basic nutritional components and antioxidant components of Orthosiphon stamineus’s root，stem and leaf were obviously different.The extraction rate was 9.52%，16.64%and 16.70%.The extraction solution has good ability of iron ion reduction in vitro，and scavenging capacity of hydroxyl radical and superoxide radical.The effects of hydrogen peroxide on the NO free radical of intestinal epithelial cells were alleviated.The in vitro antioxidant capacity and the NO radical scavenging activity of leaves were superior to that of root and stem.The results suggested that the comprehensive utilization of Orthosiphon stamineus resources in the light of the characteristics of various organs was necessary.

Key words：Orthosiphon stamineus；Nutrients；Oxidative stress；Free radical

中圖分類號(hào)：S567.23

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3924（2016）03-030-06

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.06

收稿日期：2016-2-29

基金項(xiàng)目：上海市農(nóng)委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目［滬農(nóng)科攻字（2013）第2-5號(hào)］資助

作者簡(jiǎn)介：薛惠琴（1970—），女，本科，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：動(dòng)物營養(yǎng)。E-mail：huiqinx888@qq.com

*通信作者，Tel：021-62207862，E-mail：luyonghong@163.com