細(xì)胞周期蛋白家族基因在家蠶胚胎期的表達(dá)分析

劉麗華，沈衛(wèi)德，李　兵，秦佳梅，劉　濤

(1 通化師范學(xué)院 生物系，吉林 通化 134000；2 蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

細(xì)胞周期蛋白家族基因在家蠶胚胎期的表達(dá)分析

劉麗華1，沈衛(wèi)德2，李兵2，秦佳梅1，劉濤1

(1 通化師范學(xué)院 生物系，吉林 通化 134000；2 蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

[摘要]【目的】 研究家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1)在滯育卵與即時(shí)浸酸處理的滯育卵發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄活性，為家蠶胚胎發(fā)育及細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制研究提供參考?！痉椒ā?以家蠶品種大造為試材，取產(chǎn)后1～8 d的滯育卵及產(chǎn)后20 h即時(shí)浸酸的非滯育卵，提取其RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析家蠶Cyclin家族基因在胚胎發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄水平?！窘Y(jié)果】 在即時(shí)浸酸處理的家蠶非滯育卵中均能檢測到Cyclin家族基因的表達(dá)，但不同發(fā)育階段Cyclin家族基因表達(dá)量差異很大，在發(fā)育開始的1～3 d，Cyclin家族基因變化顯著，說明此期細(xì)胞分裂頻繁，正處于組織和器官活躍形成時(shí)期。在胚胎發(fā)育晚期，除CyclinL1外的其他基因表達(dá)量都很低，表明此時(shí)幼蟲器官發(fā)育幾近完成，因此細(xì)胞分裂遲緩。而滯育卵從蛾體產(chǎn)下經(jīng)過3 d后，細(xì)胞分化停滯于G2期，Cyclin家族基因也進(jìn)入沉默狀態(tài)?！窘Y(jié)論】 Cyclin家族基因在家蠶胚胎發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。

[關(guān)鍵詞]家蠶；細(xì)胞周期蛋白；胚胎發(fā)育；基因表達(dá)譜

Expression of Cyclin family genes during embryonic

stage ofBombyxmori

LIU Li-hua1,SHEN Wei-de2,LI Bing2,QIN Jia-mei1,LIU Tao1

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，分為G1、S、G2、M 4個(gè)時(shí)期。細(xì)胞周期受細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(Cyclindependent kinase,CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)的共同調(diào)控[1]，其中CDK是真核生物細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子，依賴細(xì)胞周期蛋白發(fā)揮其功能，細(xì)胞周期蛋白周期性的積累與分解從時(shí)空上特異性地調(diào)控CDK的活性，從而推動細(xì)胞周期向前推進(jìn)，這一過程在生物界高度保守[2]。

Cyclin廣泛存在于多種生物體內(nèi)[3-4]，在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了20多種細(xì)胞周期蛋白家族成員[5]，在家蠶體內(nèi)報(bào)道了5種，即CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE和CyclinL1 。研究表明，CyclinA在S期和G2期到M期轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮作用[6]，CyclinB和CyclinB3同屬于B型周期蛋白，是M期的限制因素[7]，CyclinE是G1期向S期轉(zhuǎn)變的周期蛋白[8]，CyclinL1對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用[9]。

家蠶既是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，又是鱗翅目的模式昆蟲，一生要經(jīng)過卵、幼蟲、蛹和成蟲4個(gè)形態(tài)和機(jī)能完全不同的發(fā)育階段[10]。在家蠶胚胎發(fā)育過程中，受精卵的分裂和分化必然受到細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控。本研究采用RT-PCR方法檢測了家蠶CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinL1、CyclinE基因在產(chǎn)后1～8 d 的滯育卵及即時(shí)浸酸處理后的滯育卵中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，旨在為家蠶胚胎發(fā)育及細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1家蠶供試家蠶品種為大造，由蘇州大學(xué)蠶桑實(shí)驗(yàn)室保存，飼育溫度(25±1) ℃，RH 60%～75%，新鮮桑葉飼育。取產(chǎn)后1～8 d的滯育卵，同時(shí)另取產(chǎn)后20 h的滯育卵進(jìn)行即時(shí)浸酸處理，使其打破滯育狀態(tài)繼續(xù)發(fā)育，于浸酸處理后1～8 d取樣，凍存于液氮中備用。

1.1.2主要試劑總RNA抽提試劑盒Trizol-A，購自天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒及其他化學(xué)試劑，均購自寶生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1胚胎發(fā)育時(shí)期蠶卵總RNA的提取及cDNA制備按照Trizol-A 試劑盒說明書分別提取1～8 d滯育卵及即時(shí)浸酸蠶卵總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度。用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的不同胚胎發(fā)育時(shí)期的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)NCBI中家蠶CyclinA(GenBank登錄號：NM001160187)、CyclinB(GenBank登錄號：D84452)、CyclinB3(GenBank登錄號：EU074796)、CyclinL1(GenBank登錄號：NM001161717)、CyclinE(GenBank登錄號：619696)基因序列，采用Primer5.0軟件，按照Real-time PCR要求設(shè)計(jì)Actin3內(nèi)參照基因和CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1基因的引物對(表1)，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。以合成的cDNA為模板，采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒對各基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過程由ABI 7300測定儀軟件自動設(shè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

表 1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測基因和內(nèi)參照基因的引物

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別將CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1和Actin3基因以10倍梯度稀釋成6個(gè)濃度梯度，進(jìn)行Real-time PCR，以所得循環(huán)閾值(Ct值)為縱軸(y)，對應(yīng)的模板拷貝數(shù)的常用對數(shù)(lgN)為橫軸(x)作圖，即得各基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4數(shù)據(jù)處理RT-PCR結(jié)果數(shù)據(jù)用ABI 7300儀器自帶的Sequence detection software version 1.3.1軟件進(jìn)行處理與分析，并參照Schefe等[11]的方法進(jìn)行效率校正。圖表采用SPSS16.0軟件制作。

2結(jié)果與分析

2.1實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由圖1可以看出，家蠶Cyclin家族各個(gè)基因曲線的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，表明其線性關(guān)系非常好。

圖 1　家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因的實(shí)時(shí)

2.2家蠶Cyclin家族基因在非滯育卵中的表達(dá)

對不同發(fā)育時(shí)期即時(shí)浸酸蠶卵的Cyclin家族基因mRNA轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。

圖 2Cyclin家族基因在非滯育蠶卵中的轉(zhuǎn)錄檢測

Fig.2Transcript expression of Cyclin family genes in non-diapause eggs

由圖2可知，Cyclin家族基因在整個(gè)胚胎發(fā)育階段都有表達(dá)。產(chǎn)后1 d，CyclinB基因表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他基因的表達(dá)量，揭示剛解除滯育的細(xì)胞經(jīng)催青后大部分處于G2期；2 d時(shí)，CyclinB基因表達(dá)量迅速下降，而CyclinE、CyclinA基因表達(dá)量迅速升高，表明胚胎細(xì)胞從G2期經(jīng)過G1期快速進(jìn)入S期，一直持續(xù)到第3天，此期細(xì)胞分裂頻率較高；CyclinB3基因在前4 d的表達(dá)水平明顯低于CyclinB基因，推測雖然CyclinB及CyclinB3基因都是細(xì)胞周期M期的限速因素，但在即時(shí)浸酸蠶卵發(fā)育過程中，CyclinB基因?qū)?xì)胞周期及增殖的影響較大。4 d后，CyclinE、CyclinA、CyclinB、CyclinB3基因表達(dá)保持相對穩(wěn)定，表達(dá)量都很低，表明此時(shí)幼蟲器官發(fā)育幾近完成，因此細(xì)胞分裂較為遲緩。在本試驗(yàn)中，隨著胚胎發(fā)育的推進(jìn)，CyclinL1基因的表達(dá)水平與其他細(xì)胞周期蛋白家族基因完全不同，呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，發(fā)育到4 d時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)小高峰，然后又呈降低趨勢，至7 d后又開始升高，推測其在卵發(fā)育的不同階段對不同基因起調(diào)控作用。

2.3家蠶Cyclin家族基因在滯育卵中的表達(dá)

采用熒光定量PCR方法對家蠶Cyclin家族基因在滯育卵中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。

圖 3Cyclin家族基因在滯育蠶卵中的轉(zhuǎn)錄檢測

Fig.3Transcript expression of Cyclin family genes in diapause eggs

由圖3可知，隨著發(fā)育時(shí)間的延長，CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1基因表達(dá)量逐漸降低，3 d后幾乎檢測不到其表達(dá)，揭示此時(shí)細(xì)胞已停止分裂。

3討論

胚胎發(fā)育一直是生命科學(xué)研究的主題之一。家蠶催青期胚胎發(fā)育是蠶體內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)的體現(xiàn)。受精卵經(jīng)過一系列的分裂和分化最終形成不同形態(tài)和功能的細(xì)胞，然后進(jìn)一步構(gòu)建各種組織和器官，最后構(gòu)成一個(gè)胚胎有機(jī)體，其中許多調(diào)控機(jī)制在胚胎發(fā)育階段就已經(jīng)決定[12]。因此，研究胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制對于闡明生物的生長、發(fā)育和起源進(jìn)化具有重要意義。

家蠶由受精卵發(fā)育到1齡幼蟲的過程中，正是細(xì)胞進(jìn)行大量分裂和分化的時(shí)期，這一時(shí)期是探索細(xì)胞分裂分子調(diào)控機(jī)制的理想期。本試驗(yàn)在即時(shí)浸酸后，對蠶卵發(fā)育過程中Cyclin家族基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行跟蹤分析，結(jié)果表明，Cyclin家族基因在胚胎發(fā)育階段都有表達(dá)，這與張春冬等[13]的研究結(jié)果相同。但在胚胎發(fā)育的不同階段，Cyclin家族基因表達(dá)水平相差很大，在卵開始發(fā)育的1～3 d，Cyclin家族基因變化顯著，說明此期時(shí)細(xì)胞分裂頻繁，正處于組織和器官活躍形成時(shí)期。4 d后，CyclinE、CyclinA、CyclinB、CyclinB3基因表達(dá)保持相對穩(wěn)定；而到胚胎發(fā)育晚期所有的基因表達(dá)量都很低，表明在此時(shí)幼蟲器官的發(fā)育幾近完成，因此細(xì)胞分裂比較遲緩。

本試驗(yàn)同時(shí)對Cyclin家族基因在滯育蠶卵發(fā)育過程中的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育3 d后，已經(jīng)檢測不到Cyclin家族基因的表達(dá)。Nakagaki等[14]研究表明，滯育蠶卵在滯育激素作用下，胚胎細(xì)胞在產(chǎn)后3 d分裂變慢并停滯于細(xì)胞分裂的G2期。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)滯育卵的細(xì)胞分化停滯于G2期后，Cyclin家族基因也進(jìn)入沉默狀態(tài)。但蠶卵從蛾體產(chǎn)下3 d后，其體內(nèi)生理生化代謝仍在繼續(xù)進(jìn)行[15]。推測家蠶胚胎進(jìn)入滯育后關(guān)閉了某些基因，只保留生命體基本代謝所需的基因，以維持機(jī)體物質(zhì)能量消耗，而至于保留了哪些基因的活性，還有待于進(jìn)一步研究。

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(1DepartmentofBiology,TonghuaNormalUniversity,Tonghua,Jilin134000,China;
2SchoolofBasicMedicineandBiologicalSciences,SoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215123,China)
Abstracrt: 【Objective】 The transcriptional activities of Cyclin family genes (CyclinA,CyclinB,CyclinB3,CyclinE,andCyclinL1) during development of diapause and non-diapause eggs ofBombyxmoriwere studied to provide reference for embryonic development and control mechanism of cell cycle inB.mori.【Method】 The total RNA was isolated from 1-8 d diapause and 20 h non-diapause eggs ofB.mori(Dazao) and was reversely transcribed into cDNA.The transcription levels of Cyclin family genes during embryonic development stage were measured using real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】 All of the Cyclin family genes were detected in non-diapause eggs.The Cyclin family genes expression levels varied widely at different embryonic development stages.At 1-3 d,Cyclin family genes changed significantly,indicating that the cell division was frequent at this phase,and it was during the formation stage of tissues and organs.Expressions of all genes exceptCyclinL1 were low in late embryonic development stage,indicating that the larval organ development was almost complete at this time.Three days after the lay of diapause eggs,the differentiation stagnated at the G2 phase,and Cyclin family genes were in silenced state.【Conclusion】 The Cyclin family genes play an important role in regulation at embryonic development stage.

Key words:Bombyx mori;Cyclin;embryonic development;gene expression

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.005

[收稿日期]2014-10-29

[基金項(xiàng)目]吉林省科技廳項(xiàng)目(20130101100JC)；吉林省教育廳項(xiàng)目(2013493)

[作者簡介]劉麗華(1972-)，女，吉林通化人，副教授，博士，主要從事動物資源與功能基因組研究。E-mail：liulihua209@163.com

[中圖分類號]S882.4

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0029-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.010.html