不同培養(yǎng)條件對綿羊卵母細胞體外成熟和凋亡的影響

陳魯杰，梁浩勤，賴露菊，趙宏偉，魏鎖成（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030）

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不同培養(yǎng)條件對綿羊卵母細胞體外成熟和凋亡的影響

陳魯杰，梁浩勤，賴露菊，趙宏偉，魏鎖成*
（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030）

摘要：目的，探討不同溫度和不同培養(yǎng)時間對綿羊卵母細胞體外培養(yǎng)，成熟和凋亡的影響，選擇合適的溫度和培養(yǎng)時間為綿羊卵母細胞進行體外成熟提供技術(shù)支持。方法：在綿羊死亡30 min之內(nèi)取出卵巢4～6 h帶回實驗室，切割法收集卵母細胞。在5%CO2、飽和濕度等條件相同情況下，分別在36.0℃、37.0℃、37.5℃、38.0℃、38.5℃、39℃下培養(yǎng)24～26 h。實驗中獲得的結(jié)果數(shù)據(jù)，采用t檢驗方法進行差異顯著性分析。結(jié)果：26 h的成熟率高于其他4個時間的成熟率，在培養(yǎng)22 h到26 h過程中，隨著培養(yǎng)時間的增加，卵母細胞的成熟率呈增高。但是在26 h過后，隨著培養(yǎng)時間增加，卵母細胞的成熟率呈遞減趨勢，至30 h卵母細胞的成熟率明顯低于22 h的成熟率。38.5℃時卵母細胞的成熟率最高，36℃是卵母細胞的凋亡率最高。卵母細胞成熟率的整體趨勢是隨著溫度的上升呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：卵母細胞；成熟率；凋亡率；卵巢；體外培養(yǎng)

項目來源：西北民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項目（編號：YCX14168）。

隨著胚胎工程技術(shù)的發(fā)展，對胚胎的需求量越來越大，如體外受精、轉(zhuǎn)基因、核移植、外源基因的倒入等均需要卵母細胞，而卵母細胞的成熟發(fā)育與胚胎有著緊密的聯(lián)系，卵母細胞的體外成熟技術(shù)日益受到重視［1］。Pincus等（1935）首先提出了卵母細胞的體外成熟（IVM），Edwards（1965）對動物的細胞進行了體外成熟研究。我國于1985年后20世紀(jì)80年代末期才開始研究家畜卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)。

21世紀(jì)，對卵母細胞的體外成熟技術(shù)提出了更高要求，因為如果體外成熟技術(shù)不過關(guān)，體外成熟卵母細胞質(zhì)量有問題，對以后哺乳動物體外受精、轉(zhuǎn)基因、核移植、外源基因的導(dǎo)入等會造成極大的影響。所以卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系的完善成了生物學(xué)家們最重視的科學(xué)技術(shù)。對綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)研究較晚也比較遲緩，導(dǎo)致培養(yǎng)技術(shù)缺乏。因此，開發(fā)和研究綿羊的卵巢卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)，建立和完善一套完全在體外環(huán)境下快速生產(chǎn)和保存大量品質(zhì)優(yōu)良、價格低廉的卵母細胞的技術(shù)勢在必行。卵母細胞體外成熟培養(yǎng)受很多因素的影響，如：培養(yǎng)的時間、溫度、CO2濃度、濕度、培養(yǎng)基成分（如激素、生長因子等）、動物的年齡、卵巢采集的季節(jié)等。關(guān)于這些因素對卵母細胞的體外成熟的作用效果的研究不多見，雖然文獻記載單一因素的報道，但是多因素綜合作用的研究鮮見。

自從1878年德國科學(xué)家Scherk對家兔和豚鼠進行了體外受精的嘗試以來，許多的科學(xué)家對此進行了研究［1］。過去若干年里，人們?yōu)樘剿髟缙谂咛プ罴训捏w外培養(yǎng)系統(tǒng)做了大量工作［2］?，F(xiàn)在已應(yīng)用卵母細胞體外成熟（in vitromaturation，IVM）和體外受精技術(shù)體外生產(chǎn)胚胎［3］。經(jīng)過研究者不斷地努力已被世界各國實驗室所采用，并且已在世界上進行了商業(yè)性應(yīng)用（1987年在愛爾蘭建立的商業(yè)性卵子公司集團Ovamass Ltd.，主要生產(chǎn)肉牛、羊胚胎），產(chǎn)生了重大的經(jīng)濟效益［4，5］。目前，體外受精的各個步驟：卵母細胞的體外成熟、精子的體外獲能、卵母細胞的體外受精、受精卵的體外發(fā)育以及配子和胚胎的冷凍保存等，都可在體外進行［6］。哺乳動物早期胚胎體外培養(yǎng)效果已經(jīng)可以為胚胎生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化服務(wù)，但是最適合卵母細胞體外生長發(fā)育的條件還沒有完全確定［7，8］。蘭州大尾羊是蘭州地區(qū)的特有羊品種，然而，蘭州大尾羊的數(shù)量目前只有3 000～4 000只，屬瀕危品種，被列入中國畜禽遺傳資源目錄和國家級畜禽種質(zhì)資源保存目錄。因此其數(shù)量遠遠不能滿足市場需求，養(yǎng)殖技術(shù)較落后，沒有形成規(guī)模，也還不是畜牧業(yè)養(yǎng)殖的支柱畜種，對當(dāng)?shù)剞r(nóng)民致富也沒有明顯的帶動作有，急需要改良，對其擴繁和保護已刻不容緩。通過超數(shù)排卵技術(shù)和胚胎移植技術(shù)的推廣應(yīng)用，可以提高繁殖能力和生產(chǎn)性能，提升產(chǎn)羔率，達到年產(chǎn)2胎，增加存欄量和出欄數(shù)，力爭數(shù)量在5年內(nèi)翻一番，加快生長發(fā)育，增加產(chǎn)毛量，毛皮質(zhì)量明顯提高，具有廣闊的市場前景和顯著地經(jīng)濟效益［9］。

卵母細胞的體外培養(yǎng)是胚胎移植技術(shù)的關(guān)鍵步驟。但是，蘭州大尾羊卵母細胞體外保存的合適溫度還不清楚，培養(yǎng)的合適溫度還沒確定等一系列問題，對胚胎移植技術(shù)有一定影響。本研究就是為了解決此類問題。對蘭州大尾羊卵母細胞的體外培養(yǎng)進行進一步研究，為蘭州大尾羊胚胎移植技術(shù)中的卵母細胞體外培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)。

1　不同溫度對綿羊卵母細胞體外成熟的作用

1.1材料

1.1.1實驗材料2～3歲成年綿羊卵巢，采自蘭州市小西湖馬忠華定點屠宰場。

1.1.2實驗試劑與藥品NaCl，KCl，CaCl·2H2O，KH2PO4，MgCl2·2H2O，Na2HPO4·12H2O，NaHCO3，丙酮酸鈉，葡萄糖，青霉素，鏈霉素，M199，LH（促黃體素，規(guī)格：4μg×10支），F(xiàn)SH（促卵泡素，規(guī)格：100單位×10支），E2（雌二醇，規(guī)格：4 mg×10支）三種激素均為寧波市三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，發(fā)情羊血清。

1.1.3主要儀器設(shè)備體視顯微鏡（LEICA DMIL產(chǎn)自北京悅昌行科技有限公司）；倒置顯微鏡（LEICA S8APO產(chǎn)自北京悅昌行科技有限公司）；超凈工作臺（產(chǎn)自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（STIK，型號IL- 161CT產(chǎn)自施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司）；電子天天平（FA2004N產(chǎn)自上海精密科學(xué)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備限公司）；高壓滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；一次性培養(yǎng)皿（35 mm×10 mm）；吸胚針；注射器及手術(shù)刀等。

1.1.4培養(yǎng)液的配制雙抗（P/S）制備：青霉素160萬單位，加上80 ml的超純水，變成青霉素2萬單位/ml；鏈霉素100萬單位，加上50 ml的超純水，變成鏈霉素2萬單位/ml；青霉素和鏈霉素各取50 ml，再用超純水稀釋100倍，使得培養(yǎng)基中每毫升青霉素鏈霉素100個單位。

PBS液：NaCl 800 mg/100 ml，KCl 20 mg/100ml，CaCl2取13 mg/100ml，MgCl2取10 mg/100 ml，磷酸氫二鈉289.8 mg/ml，丙酮酸鈉3.6 mg/100 ml，C6H1206取5.56 mmol/L，定容至100 ml的超純水中，用一次性過濾器過濾除菌后，放置4℃冰箱內(nèi)保存，以待備用。

M199基礎(chǔ)液：M199 0.22 g，NaHCO30.95 g，三蒸水定容100 ml。用0.4 μm的過濾器過濾除菌，4℃保存。

洗卵液（撿卵液）：M199基礎(chǔ)液99 ml，丙酮酸鈉0.22 μg/ml，1%雙抗。用0.4 μm的過濾器過濾除菌，4℃保存。

發(fā)情羊血清（ESS）的制備：從甘肅省臨夏市和政縣泰祥三谷產(chǎn)業(yè)園采回發(fā)情羊血清，血樣必須在于4℃冰箱內(nèi)放置1～2h后，再用離心機用2 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取其中的血清。將分離好的血清在56℃條件下，滅活30 min，最后進行過濾分裝。

成熟液：M199基礎(chǔ)液8 ml，LH（促黃體素）50 μg，F(xiàn)SH（促卵泡素）5 μg，E2（雌二醇）10（取1 ml用三蒸水稀釋20倍，取1 ml），發(fā)情羊血清1 ml，雙抗0.1 ml。用0.4 μm的過濾器過濾除菌，4℃保存。

1.2方法

1.2.1綿羊卵巢的采集在綿羊宰殺30 min之內(nèi)取出卵巢，放入事先準(zhǔn)備好的裝有35～37℃的含有0.9%的青、鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中，4～6 h內(nèi)帶回實驗室進行實驗。卵巢置于含青、鏈霉素的35～37℃生理鹽水的培養(yǎng)皿中，用滅菌的37℃的生理鹽水沖洗卵巢2～3遍，剔除卵巢表面及周圍的脂肪、結(jié)締組織和系膜。一只手持鑷子固定卵巢，另一手拿眼科剪將卵巢表面的卵泡剪破，使卵泡液流出。較小的卵泡則將其所在卵巢表面剪碎，但不完全剪碎卵巢，盡可能地減少組織塊。最后再用PBS液沖洗剪碎的卵巢表面，使附著在上面的卵母細胞流入PBS液中。然后靜置1～2 min后在體視顯微鏡下用吸胚針進行撿卵。

1.2.2卵母細胞的收集卵巢經(jīng)過處理后用切割法收集卵母細胞。在倒置顯微鏡下用吸胚針挑出卵丘細胞層完整、包裹致密，卵母細胞胞質(zhì)顏色均勻的卵丘——卵母細胞復(fù)合體（cumulus- oocyte- complexes，COCs）用于體外成熟培養(yǎng)。COCs在洗卵液中清洗3～4遍。最后，從洗卵液中把COCs移至預(yù)平衡2～4h的微滴中培養(yǎng)。

1.2.3卵母細胞的分級標(biāo)準(zhǔn)將不同采集方法收集到的卵泡液置于體視顯微鏡下進行觀察，收集卵母細胞，并對收集到的卵母細胞進行分級評價。根據(jù)包被卵母細胞的卵丘細胞完整性、卵丘細胞層數(shù)以及卵母細胞的胞質(zhì)均勻性將卵母細胞分為4級：A級，卵丘細胞三層以上，胞質(zhì)均勻；B級，1～2層卵丘細胞，胞質(zhì)均勻；C級，裸卵或卵丘細胞不完整；D級是死亡退化的卵母細胞。A/B級卵母細胞為可用的卵母細胞。

1.2.4綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)本實驗采用微滴培養(yǎng)方法：取一35 mm培養(yǎng)皿，先在培養(yǎng)皿中用成熟培養(yǎng)液做成80 μl的微滴，每個培養(yǎng)皿均勻分布4～5滴；然后加入1 ml滅菌石蠟油均勻覆蓋住微滴，在培養(yǎng)箱中平衡2h以上。COCs洗凈后穿破石蠟油放入微滴中，每微滴培養(yǎng)卵母細胞15～30枚左右，數(shù)量過多或過少均會影響卵母細胞的體外成熟。

在38.5℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間后，用透明質(zhì)酸將COCs經(jīng)移液槍反復(fù)吹打分離卵母細胞及卵丘細胞，并用PBS清洗2～3遍收集卵母細胞，看第一極體排出的情況。卵母細胞成熟的一個重要指標(biāo)就是卵丘細胞的擴散，將卵母細胞成熟后的卵丘細胞擴散程度分為4級（圖1）。

圖1　電鏡下的卵母細胞a：1級；b：2級；c：3級（10×10）.

1.2.5實驗設(shè)計實驗一為在5%CO2濃度與飽和濕度等條件相同情況下，分別在36.0℃、37.0℃、37.5℃、38.0℃、38.5℃、39℃下培養(yǎng)24～26 h。

實驗二是在5%CO2濃度與培養(yǎng)溫度（38.5℃）相同條件下，培養(yǎng)22 h、24 h、26 h、28 h和30 h。

最后放在透明質(zhì)酸酶中反復(fù)吹打去除顆粒細胞，并用PBS液清洗2～3遍收集卵母細胞，統(tǒng)計第一極體的排出情況。

1.2.6成熟卵母細胞的判定卵細胞的成熟包括核成熟和胞漿成熟。第一極體的排出是卵母細胞體外培養(yǎng)成熟的標(biāo)志，也是細胞核成熟的標(biāo)志，胞質(zhì)成熟的是以卵丘細胞擴散為標(biāo)志。

細胞核成熟的判定方法：卵母細胞成熟培養(yǎng)20～24 h后，挑選卵丘層擴散良好的COCs，放在含有0.3% BSA（Sigma）的HEPES- TALP液中，旋渦振蕩5 min，徹底去除卵丘細胞，在體視鏡下觀察第一極體排出情況。取部分卵放到四角滴有石蠟油：凡士林（1∶9）的載玻片上，加蓋玻片，在顯微鏡下邊觀察邊逐漸輕輕向下壓，直到卵胞質(zhì)充滿卵腔為止。放入無水乙醇：冰乙酸（3∶1）固定液中固定24 h以上，再用1%的醋酸地衣紅（45%醋酸配制）染色1～2 min，倒置顯微鏡下觀察卵母細胞核形態(tài)。

圖2　成熟前后不同時期的綿羊卵母細胞A.綿羊未成熟卵母細胞（×100），周圍有3～4層顆粒細胞包裹，同時有一薄層完整的透明帶形成；B.綿羊成熟卵母細胞（×100），完成第二次減數(shù)分裂，顆粒細胞層明顯膨大，以卵母細胞為中心呈放射狀向四周擴散；C.排出第一極體的綿羊卵母細胞（×200），透明帶明顯增厚，細胞核被擠到一邊，第一極體排出。

1.2.7結(jié)果統(tǒng)計實驗中獲得的結(jié)果數(shù)據(jù)，采用t檢驗方法進行差異顯著性分析。

1.3實驗結(jié)果

表1　培養(yǎng)條件綿羊卵母細胞體外成熟的影響

卵母細胞培養(yǎng)不同時間后的成熟率見表1和圖2。26 h的成熟率高于其他4個時間的成熟率，在培養(yǎng)22 h 到26 h過程中，隨著培養(yǎng)時間的增加，卵母細胞的成熟率呈增高。但是在26 h過后，隨著培養(yǎng)時間增加，卵母細胞的成熟率呈遞減趨勢，至30 h卵母細胞的成熟率明顯低于22 h的成熟率。

圖3　培養(yǎng)溫度與卵母細胞成熟率和凋亡率

根據(jù)表1和圖2均顯示培養(yǎng)溫度越高，細胞成熟率越高。經(jīng)過許多研究證明，產(chǎn)生這種情況的原因主要是由于細胞內(nèi)活性物質(zhì)的活性決定的。在動物正常的生理溫度范圍內(nèi)，卵母細胞的代謝強度與溫度成正比，溫度升高，酶、激素等活性物質(zhì)的活性也隨之升高，細胞代謝也增強，成熟率就會升高。但是溫度過高或過低均會影響卵母細胞的生長和成熟。當(dāng)溫度過高到達一定限度時會導(dǎo)致酶、激素等的失活，同時會破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致滲透性改變，甚至引起細胞死亡［10］。當(dāng)溫度略低于正常溫度時，對卵母細胞沒有重大影響，但是會引起細胞內(nèi)活性物質(zhì)的活性降低，細胞代謝減弱，導(dǎo)致卵母細胞的生長發(fā)育受到抑制，所以產(chǎn)生了36～37.5℃的成熟率較低的情況。實驗結(jié)果顯示綿羊在39.0℃時成熟率最高，可能是細胞內(nèi)的各種酶和激素等物質(zhì)的活性最強，細胞代謝旺盛，所以成熟率最高。經(jīng)過查證大量資料顯示在培養(yǎng)溫度高于綿羊正常體溫時，由于破壞了細胞結(jié)構(gòu)，細胞成熟率會降低。所以反證本實驗培養(yǎng)溫度越高，細胞成熟率越高；39.0℃在綿羊正常體溫范圍（38.3～39.9℃）內(nèi)成熟率最高，符合以前的研究成果。

適宜的培養(yǎng)溫度是哺乳動物卵母細胞體外成熟培養(yǎng)成功的一項重要因素，然而不同的哺乳動物卵母細胞培養(yǎng)的最適溫度也不相同。經(jīng)Lenz（1983）研究顯示牛卵母細胞對溫度的敏感性很強，Wang通過組合實驗證明在38～39℃是牛的卵母細胞體外成熟的最適溫度。Eng（1986）指出豬的卵母細胞在39℃下體外培養(yǎng)成熟率比在37℃下高。戴榮亮等人也證實了體外培養(yǎng)溫度在山羊正常體溫（38.5～39.7℃）范圍內(nèi)變動，對卵母細胞成熟率無顯著影響［11］。本實驗證實，只要在綿羊正常體溫范圍（38.3～39.9℃）內(nèi)變動，則對成熟率無顯著影響，符合以前的研究成果。雖然在實際生產(chǎn)活動中的培養(yǎng)環(huán)境遠遠不如實驗室嚴(yán)密和完備，但是只要控制在綿羊的正常生理溫度范圍內(nèi)，卵母細胞的成熟率是可以保證。

2　討論

2.1不同溫度對綿羊卵母細胞的體外成熟影響

適宜的培養(yǎng)溫度是成功進行卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的重要因素，然而不同的哺乳動物卵母細胞培養(yǎng)的最適溫度也不相同。在這項研究中，卵母細胞的成熟率，隨著培養(yǎng)溫度從36.0℃升至38.5℃，逐漸增加。最大的成熟率和最小細胞凋亡率在38.5℃時出現(xiàn)。許多研究證明，產(chǎn)生這種情況的原因主要是由于細胞內(nèi)活性物質(zhì)的活性決定的。在動物正常的生理溫度范圍內(nèi)，卵母細胞的代謝強度與溫度成正比，溫度升高，酶、激素等活性物質(zhì)的活性也隨之升高，細胞代謝也增強，成熟率就會升高。但是溫度過高或過低均會影響卵母細胞的生長和成熟。當(dāng)溫度過高到達一定限度時會導(dǎo)致酶、激素等的失活，同時會破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致滲透性改變，甚至引起細胞死亡［10］。有實驗結(jié)果顯示綿羊在39.0℃時成熟率最高。戴榮亮等證實生理體溫（38.5～39.7℃）范圍內(nèi)變動對山羊卵母細胞體外成熟率無顯著影響［12］。綿羊母細胞體外成熟率在正常體溫范圍（38.3～39.9℃）也無明顯差異［10］。Eng等研究發(fā)現(xiàn)，39℃時豬卵母細胞的成熟率為71.0%，37℃時為35%。劉靈39℃時培養(yǎng)山羊卵母細胞，獲得79.4%的成熟率。張涌等在38.5℃的條件下培養(yǎng)山羊卵母細胞，成熟率為68.4%［12］。

2.2培養(yǎng)時間對卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的影響

徐燕霞等（2014）報道培養(yǎng)20 h的卵母細胞的成熟率為57.8%，培養(yǎng)22 h的成熟率為63.6%，培養(yǎng)24 h 為64.4%，培養(yǎng)26h為72.5%，培養(yǎng)20 h和22 h的成熟率差異顯著；培養(yǎng)20 h和24 h、26 h的成熟率差異極顯著；培養(yǎng)22 h和24 h成熟率差異不顯著；培養(yǎng)24 h和26 h差異極顯著。隨著培養(yǎng)時間的延長，卵母細胞的成熟率在提高，但是時間太長，卵母細胞就會老化，不利于卵母細胞的體外受精。王超（2007）和楊志杰等（2008）的研究結(jié)果顯示培養(yǎng)24 h、26 h的卵母細胞成熟率顯著高于18 h和20 h的。呂麗華等（2009）研究了山羊培養(yǎng)24 h、27 h、30 h后卵母細胞的成熟率，結(jié)果顯示培養(yǎng)27 h卵母細胞成熟率顯著高于其他2組。不同物種卵母細胞成熟時間不同，牛卵母細胞需要24 h就成熟，但是豬卵母細胞的成熟需要培養(yǎng)42～48 h。卵母細胞體外培養(yǎng)時間對卵母細胞的成熟及其之后的體外受精和早期胚胎的發(fā)育非常重要，卵母細胞培養(yǎng)時間太短不易成熟，但是時間太長容易造成卵母細胞透明帶硬化，從而不適合受精。因此卵母細胞的成熟培養(yǎng)時間對卵母細胞的成熟和體外受精非常重要，具有深遠的意義。本試驗結(jié)果說明，綿羊的卵母細胞培養(yǎng)22～24 h成熟率高且利于體外受精。

3　結(jié)論

試驗結(jié)果表明，用切卵法收集卵母細胞之后，在5%CO2，培養(yǎng)26 h，飽和濕度的條件下培養(yǎng)溫度38.5℃時綿羊卵母細胞的成熟率最高、凋亡率最低。在5% CO2，培養(yǎng)溫度38.5℃，飽和濕度的條件下培養(yǎng)26 h時綿羊卵母細胞的成熟率是37.3%最高，凋亡率是25.4%最低。

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（編輯：高真貞）

中圖分類號：S814.4

文獻標(biāo)識碼：B

文章編號：1006- 799X（2016）05- 0076- 05

作者簡介：陳魯杰（1986-），男，河南商水人，在讀碩士研究生，主要從事動物醫(yī)學(xué)生殖技術(shù)研究。

通訊作者：魏鎖成（1962-），男，甘肅甘谷人，教授，主要從事動物生殖生物技術(shù)的教學(xué)和科研工作。